醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化

大学毕业论文醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化BREEDINGOFACETICACIDBACTERIAANDTHEOPTIMIZATIONOFPROCESSCONDITIONS2011年6月01日烟台大学醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化烟台大学毕业论文任务书院（系）化学生物理工学院姓名毕业论文题目醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化指导教师具体要求主要内容、基本要求、主要参考资料等1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计2）认真探索实验方法，找出实验的关键3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范主要参考文献1冯静,施庆珊,欧阳友生,陈仪本醋酸菌多相分类研究进展微生物学通报SEP20,2009,369139013962MAMEYAMA,ESHINAGAWA,KMATSUSHITAANDADACHIAGRBIOLCHEM,2010,483099进度安排第12周确定论文题目，布置文献查阅相关事宜。阅读、整理文献，写开题报告。第34周进入实验室，熟悉环境、实验仪器。第512周预试验。正式试验，及整理实验数据。第1314周论文初稿。第15周论文修改及定稿。指导教师（签字）年月日院（系）意见教学院长（主任）（签字）年月日备注I摘要本实验从陕西农家醋醅和实验室自制果醋中分离得到两种菌种A1和B，以其为出发菌种，进行诱变以期得到高产酸量的菌株。结果表明采用紫外诱变处理，得到A11和B11菌株，分别比亲株产酸量提高18和49。因起始酒精度、发酵温度、溶氧量（摇床转速）对醋酸菌的发酵产量有较大的影响。故对A11和B11菌株进行单因素优化，最终得到的最佳条件是A11初始酒精含量5、摇床转速150R/MIN、发酵温度28；B11初始酒精含量6、摇床转速150R/MIN、发酵温度30。关键词醋酸菌；分离；紫外线（UV）诱变；单因素试验IIABSTRACTINTHISSTUDY,WEGOTTWOKINDSOFSTRAINS,A1ANDB,FROMSHANXIPEASANTVINEGARANDLABORATORYFERMENTEDHOMEMADEFRUITVINEGARINTHEEXPERIMENTSTARTEDBYTHEMASBACTERIA,WEHOPETOGETSTRAINSTHATCOULDMAKEHIGHYIELDONACIDCONSUMPTIONTHERESULTSSHOWTHATWEGOTA11ANDB11STRAINSBYTHEULTRAVIOLETMUTATIONPROCESSING,ANDTHEIRCONSUMPTIONOFACIDINCREASEDBY18AND49STARTINGALCOHOLDEGREES,FERMENTATIONTEMPERATUREANDOXYGENTHESPEEDOFTHEWAVEBEDHAVEGREATINFLUENCEONTHEACETICACIDBACTERIAFERMENTATIONYIELDSWEMADESINGLEFACTOROPTIMIZATIONONA11ANDB11STRAINS,ANDWEGOTTHEBESTCONDITIONISA115OFTHEINITIALALCOHOLCONTENT,ROTATIONSPEED150R/MIN,FERMENTATIONTEMPERATURE28B116OFTHEINITIALALCOHOLCONTENT,ROTATIONSPEED150R/MIN,FERMENTATIONTEMPERATURE30KEYWORDSACETICACIDBACTERIA,SEPARATION,ULTRAVIOLETUVMUTAGENESIS,SINGLEFACTORTESTIII目录1前言111概述1111醋酸菌的简介1112醋酸菌的培养及保藏112诱变育种1121物理诱变紫外线诱变2122化学诱变甲基磺酸乙酯EMS诱变213醋酸菌生产性能的研究进展3131影响醋酸菌生长的生态因子3132生产性能的有关研究314果醋的营养保健功能415研究的目的和意义416课题创新点42材料与方法521主要材料5211样品5212醋酸菌培养基5213主要仪器设备522主要操作方法5221醋酸菌的分离与纯化5222诱变方法5223单因素试验6224醋酸菌的鉴定及检测方法7225醋酸菌的生长曲线73结果与分析831醋酸菌原始菌株的筛选8311分离筛选8312醋酸菌菌株的定性鉴定8313醋酸菌生长曲线的绘制1032诱变育种11321紫外线诱变的菌株筛选11322EMS诱变的结果筛选1533醋酸菌产酸量的影响因素17331单因素试验设计17IV332单因素实验设计检验21333小结224结论23结论与展望24参考文献25致谢26烟台大学毕业论文11前言11概述111醋酸菌的简介醋酸菌是一大群革兰氏染色阴性、严格好氧的细菌的总称。醋酸菌最显著的特征是，在有氧条件下，能将乙醇氧化为乙酸ASIA属除外。在将乙醇氧化为乙酸后，大部分醋酸菌还可进一步将乙酸或乙酸盐氧化为CO2和H2O1。根据能否将乙酸盐和乳酸盐氧化为CO2和H2O的能力及鞭毛类型，将醋酸菌分为醋杆菌（ACETOBACTER）和葡萄糖氧化杆菌（GLUCONBACTER）2。醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆到杆状，单生、成对或成链排列。细胞大小为（08M12M）（15M25M）。细胞运动或不运动，若运动则具有周生鞭毛或极生鞭毛这两种类型鞭毛。专性好氧，是需氧细菌的代表，其中一些能产生色素或纤维素36。112醋酸菌的培养及保藏醋酸菌适宜的碳源是葡萄糖、果糖等六碳糖，其次是蔗糖和麦芽糖等，不能直接利用淀粉、糊精等多糖类。酒精、甘油和乳酸是极其适宜的碳源。培养醋酸菌的培养基需要含糖和酵母膏VB，另外添加酒精以适应代谢，加碳酸钙以中和其代谢所生成的醋酸，保证其繁殖的旺盛。常用培养方式有两种（1）原菌试管培养，是将培养基做成试管斜面，接种后于3032恒温培养箱内培养48H，保存于04冰箱，一般在半月内传代一次。（2）三角瓶扩大培养，是将液体培养基装入三角瓶中，无菌操作加入酒精，每只试管斜面接34瓶于恒温培养箱培养5D7D，也可摇床培养24H，一般测定酸度达到152即成熟。在食醋的生产中，醋酸菌菌种多半采用固体斜面的方式进行保藏。但是用这种方法保藏的醋酸菌退化快，生产性能也不稳定79。因此可以将菌种接入20甘油中，用冻干管零下20保藏，如此可以保藏约六个月，可以防止多次传代引起的菌种退化。12诱变育种诱变育种是通过诱变剂处理菌株，是当前菌种选育的一种重要方法10。提高菌种的突变率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，在生产中应用极其广泛。但是诱发突变缺乏定向性11，因此诱发突变必须经过大规模的筛选才能得到显著的效果。诱变育种技术包括两个环节一是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使个体在恶劣环境中的变异频率大大提高；二是设计一种有效的筛选方法淘汰负向变异菌株，并把正变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来12。可以说目前工业上所用的高产菌株大部分都是通过这种方法获得的，而且这种方法在抗生素菌种改良中仍是方便、经济有效的，烟台大学毕业论文2尤其适用于对那些遗传背景、生物合成途径还不甚清楚的抗生素产生菌；使用该法可以阻断不必要的酶活力，起到解除负调控、增加基因剂量的作用，不仅可使抗生素产量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。成功的诱变育种需要1）处理可用于筛选的大的微生物群体；2）预期的特性突变率高；3）可以用视力诊断或简单测定鉴别突变的有效方法。121物理诱变紫外线诱变物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外线，而其此种诱变方法有很多先例，可以予以借鉴。用紫外线诱变醋酸菌，能使其产量有稳定的提高13。紫外线是波长136390NM的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发），导致分子的理化变化。紫外线辐射最主要的则是引起DNA形成嘧啶二聚体，他会阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变14。它的遗传效应主要是引起GCAT的转换或移码突变。由于存在光复活作用，即白光照射能活化光激活酶并将嘧啶二聚体解而使DNA恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可见光照射（应在红光下操作）15。测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间16。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在30CM左右，挑选出致死率达到90999所需的辐射时间进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需要辐照35MIN，芽孢要10MIN，芽孢杆菌的营养体则要13MIN，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30S，放线菌的分生孢子用30S2MIN17。辅射同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热2030MIN，使光波稳定。122化学诱变甲基磺酸乙酯EMS诱变EMS，即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，自1953年KOLMARK首次发现EMS的诱变作用后，EMS便被广泛地应用于动物、植物和微生物育种中，并取得了显著的成果。但其尚未应用于醋酸菌的诱变育种，故对其在此领域应用的研究具有一定的科研价值。（1）EMS诱变育种原理甲基磺酸乙酯ETHYLMETHANESULPHONATE，简称EMS，是一种改变DNA结构烷化剂，对生物系统作用的重点主要是核酸，对修复酶的钝化也有一定的作用它与DNA中的磷酸嘌呤、嘧啶作用，使之突变。主要原因是烷化剂具有一个或多个活性烷基，这些烷基能被转移到其他分子上置换氢原子，发生烷化作用。烷基化位点主要在G鸟嘌呤的N7位置上，由于上N7的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季烟台大学毕业论文3铵基团产生两个效应一是促进第一位氨基上氢解离。使G不再与C配对而与T配对，从而造成GCAT转换。二是N7成为季铵基团后，减弱了N9位上的N糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，则原来的GC对可以变为任何碱基对GC、CG、AT、TA，既有转换，又有颠换。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失。总之，碱基熔化后易从DNA链上裂解下来，造成DNA的碱基缺失及修补，从而引起突变1820。（2）EMS诱变突变体的鉴定目前常用的鉴定方法有形态学方法、细胞学方法、诱变与离体培养技术相结合方法、生理生化方法、现代分子生物学方法、遗传学方法等21，特别是随着分子生物学的发展，人们逐渐将从分子水平对变异体进行早期鉴定，其中分子标记辅助选择技术具有准确、有效等优点，从而减少了选择群体和缩短育种时间。（3）EMS诱变前景在今后一段时期内，如何提高诱变频率和选择效率仍是EMS研究的关键问题，我们在进一步发挥诱变育种的特长与优势的同时，有必要从各个方面进行深入研究诱发突变的机理，以提高诱变频率，并结合分子标记及其它生物标记技术，提高选择效率。13醋酸菌生产性能的研究进展131影响醋酸菌生长的生态因子醋酸菌的生长需要适宜的生态环境，不同的生态环境，必将影响其正常的活动规律及其代谢能力，影响醋酸菌生长的因素主要表现在以下几个方面（1）温度温度是醋酸菌代谢的主要调节因素，是醋酸菌生长繁殖和产酸的必要条件。醋酸菌的最适生长温度为2537。但是微生物生长速度最快时的温度未必是发酵积累产物最多的温度22。（2）初始酒精浓度酒精是醋酸菌生长代谢所需能量的提供者，但较高的酒精浓度对醋酸菌的生命活动有一定的抑制作用23，因此，在醋酸发酵过程中要根据醋酸菌耐酒精的能力，将酒精浓度控制在一定的范围内。（3）溶氧量醋酸菌为严格好氧微生物，只有在有氧的条件下才能生长。生产中只有通气良好，才能正常发酵。在含有较高浓度乙醇和醋酸的环境中，菌种对缺氧非常敏感，中断供氧会造成菌体死亡。132生产性能的有关研究醋酸菌只有在合适的条件下才能生长和发酵良好，故在人工培养醋酸菌时，要了解菌种性能以控制合适的发育和发酵条件，取得较好的发酵效果。黄仲华等对所分离烟台大学毕业论文4出的优势醋酸菌进行了耐乙醇能力、分解乙酸盐能力、耐食盐能力和耐高温能力的试验研究；祖国仁、施安辉等对分离出的优势醋酸菌进行了产酸速度、耐酒精度、耐温度、酒精转化率等性能的试验研究；国外用多种不同菌种混合发酵，不仅发酵速度加快，还能形成其他有机酸与酯类物质，增强了产品的香味和固形物成分。14果醋的营养保健功能食醋含有丰富的有机酸、糖分、氨基酸、B族维生素和水溶性钙、磷、铁、锌、等矿物质，以及醇、醛、酚、酯等微量成分。现代营养学、医药学研究表明，醋对人体健康有很多益处24水果中含有丰富的糖资源，是酿醋用的上等原料，与粮食醋相比，果醋的营养成分更为丰富25。果醋中富含有机酸、醇、酷类等以及维生素、氨基酸和矿物质，这使得果醋具有丰富的营养价值，且有多种保健功能，如可预防高血压、高血脂，促进血液循环、增强钙质吸收、延缓衰老、开胃消食等功效29。15研究的目的和意义我国是水果生产大国，而且果醋及果醋饮料逐渐兴起为第四代饮料产品，将有巨大的市场发展潜力。但水果实际加工量很低，水果加工滞后于种植业的发展。开发高质量的果醋及果醋饮料，不但可以节约粮食，充分利用水果资源，还可以解决水果销路难的问题，增加果农收入。同时，开发高质量的果醋及果醋饮料对提高我国水果资源综合利用价值，发展我国的水果加工业有一定的帮助。综上总结则选育高产醋酸菌为重中之重。正如所有发酵工业主要是利用微生物的转化作用一样，食醋中微生物及其酶的作用对发酵制品质量及风味也有重要的影响。总结目前食醋生产现状，存在如下问题1菌种的产酸量不够高，因此导致大生产过程中原料的损失较多，导致成本高；2菌株发酵过程代谢产物过于单一，导致成品醋的口感不良；3醋酸发酵条件的不确定，造成发酵浪费。故此，微生物高产菌种的选育及其优良特性的充分发挥，对酿醋工业尤为关键。传统食醋酿造在漫长一个历史时期，是利用自然界野生的有益微生物，产品质量高低不一，质量没法保持稳定。因此设法提高醋酸菌的生产质量是当务之急。16课题创新点传统的诱变方式主要有亚硝酸诱变处理、吖啶橙诱变处理、5溴尿嘧啶诱变处理、2氨基腺嘌呤诱变处理、盐酸羟胺诱变处理及紫外线诱变处理等，都取得了不错了效果。本课题首先是采用了传统的紫外诱变处理菌种，第二种诱变方法是采用了甲基磺酸乙酯（EMS）诱变育种，EMS诱变其他菌株如酵母菌或者植物如玉米等已有很多先例，但是用于醋酸菌的诱变育种是首例，经过对其他实验的总结进行醋酸菌的EMS诱变的尝试实验设计，其诱变结果充分验证了此种育种方法用于醋酸菌株的可行性。烟台大学毕业论文52材料与方法21主要材料211样品陕西农家醋醋醅、实验室自制果醋以及分离出的菌种212醋酸菌培养基基础培养基1酵母粉，1葡萄糖，PH45，01MPA灭菌20MIN，使用前加入3（V/V）无水乙醇。分离培养基1酵母粉，1葡萄糖，1碳酸钙，15琼脂，PH45，01MPA灭菌20MIN，使用前加入3（V/V）无水乙醇，分装制成CACO3平板分离培养基。斜面保藏培养基1酵母粉，1葡萄糖，1碳酸钙，15琼脂，PH45，01MPA灭菌20MIN，使用前加入3（V/V）无水乙醇，摆成斜面即为菌种保藏培养基。产酸实验培养基豆芽汁，1葡萄糖，灭菌后加入4（V/V）无水乙醇。213主要仪器设备HZQF160振荡培养箱中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司恒温培养箱上海福玛实验设备有限公司DMS直流磁力搅拌器天津市华兴科学仪器厂YC260L医用冷藏箱BA200生物显微镜22主要操作方法221醋酸菌的分离与纯化取10G研磨好的曲样，10ML果醋分别放入富集基础培养基中进行摇床培养48H，得到101的稀释液，10倍梯度稀释，取103，104，105稀释度的样品稀释液涂布于平板分离培养基上，每一稀释度涂布三个平板，每个平板用01ML稀释液，涂好后3005倒置培养48H，挑取HC值（溶钙圈与菌落直径之比）较大，菌落丰厚的单菌落。然后进行划线分离得到纯种菌株，接种于斜面保藏培养基中，3005培养24H后保藏于4冰箱备用。烟台大学毕业论文6222诱变方法2221紫外诱变采用紫外线照射诱变的方法，对分离出的菌A和菌B进行形状改良。诱变筛选流程如下始发菌株活化紫外线（UV）诱变处理分离纯化初筛复筛菌种保藏诱变处理过程大致如下（1）制备菌悬液将培养好的斜面上的菌株用5ML085的无菌生理盐水洗下，轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1108CFU/ML）的菌悬液，将菌悬液注入无菌培养皿中，置于磁力搅拌器上，搅拌十分钟，制成单细胞菌悬液。（2）紫外诱变取以上制备好的平皿置于超净工作台中，距紫外灯30CM处，先不打开皿盖。紫外灯打开预热20分钟，以稳定光波。然后打开皿盖使菌液暴露在波长为2537NM，15W的紫外光下照射，磁力搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外光波。采用不同的照射时间（10S、20S、30S、40S、50S、60S）。（3）涂布分离避光十倍稀释涂布，用黑布包住培养26，防止回复突变，与同步培养的野生型菌株进行比较。（4）制作致死率曲线计算致死率诱变后减少的菌落数诱变前的菌落数100，做出致死率照射时间曲线。依据大量资料，醋酸杆菌在偏低诱变剂剂量（7080致死率）的情况下发生正突变的几率较高，故由图均选择75致死率时的诱变剂剂量进行诱变。（5）初筛以最佳照射时间处理菌悬液，取05ML进行系列梯度稀释，进行平板涂布后3005倒置培养48H。选择HC值大的菌株进行定性实验。（6）复筛以标准NAOH滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。2222EMS诱变采用化学试剂EMS诱变方法，对分离出的菌A和菌B进行形状改良诱变筛选流程如下始发菌株活化甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理分离纯化初筛复筛菌种保藏诱变处理过程如下（1）制备菌悬液将培养好的斜面上的菌株用5ML085的无菌生理盐水洗下，轻轻震荡，使菌苔打散成乳白色悬浊状，配成一定浓度（1108CFU/ML）的菌悬液。（2）EMS诱变处理取等量菌悬液加入无菌离心管中，每管2ML，离心弃去上清液后加入2MLPH70的磷酸缓冲溶液。加入40LEMS原液,放入3005摇床培养，采用不同的反应时间（10MIN、20MIN、30MIN、40MIN、50MIN、60MIN），加入2ML5硫代硫酸钠溶液终止反应。（3）涂布分离离心弃去上清液并用无菌生理盐水洗涤离心三次后稀释涂布，培养。与同步培养的野生型菌株进行比较，计算致死率，作出致死率照射时间曲线。烟台大学毕业论文7（4）初筛溶钙圈法，及醋酸菌的定性定量实验。（5）复筛以标准NAOH滴定法测定总酸量，根据总酸量高低确定优良菌种。223单因素试验1温度对醋酸产量的影响分别向温度为25、28、30、32、35的产酸培养基中接入接种量为5的菌种，摇床培养，醋酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同温度对醋酸菌醋酸发酵的影响。2溶氧量对醋酸产量的影响按照以确定温度的优化条件将醋酸菌按5的接种量接入产酸培养基中，在转速为120R/MIN、130R/MIN、140R/MIN、150R/MIN、160R/MIN、170R/MIN下振荡培养，醋酸发酵结束测定其产酸量，并分析不同溶氧量对醋酸菌醋酸发酵的影响。3初始酒精度对醋酸产量的影响按照以确定温度和溶氧量的优化条件，分别向初始酒精度为3、4、5、6、7、8（V/V）的产酸培养基中接入菌种，摇床培养，发酵结束测定其产酸量，并分析不同酒度对醋酸菌醋酸发酵的影响。224醋酸菌的鉴定及检测方法2241鉴定方法一采用碳酸钙平板，根据是否有透明圈产生来判断是否产酸，分离出HC值较大的醋酸菌，然后进行革兰氏染色及定性实验来具体确定是否为醋杆菌属醋酸菌。二革兰氏染色将上述试管斜面上的菌株连续活化2次，在第2次活化24H30H后，进行革兰氏染色，枯草芽孢杆菌作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照。三定性试验将上述斜面菌株活化2次，在第2次培养48H后，接种于装有10ML产酸试验培养液的18180MM的试管中（各接两支），3005静置培养，培养4D时各取出一支，3000R/MIN离心5MIN，除去菌体，用氢氧化钠中和，加入10氯化铁23滴，在火焰上煮沸，能形成红褐色溶液者为产醋酸的菌株27。2242检测方法酸度的测定标准NAOH溶液滴定法28。总酸的测定酸碱滴定法29。225醋酸菌的生长曲线菌株接种于产酸培养基中，30120R/MIN振荡培养，每天补加1（V/V）无水酒精，每天取样用血球计数板进行菌体计数，绘制醋酸菌的生长曲线，从而确定产酸定量测定的时间，应在对数中后期或稳定前期进行产酸量测定。烟台大学毕业论文83结果与分析31醋酸菌原始菌株的筛选311分离筛选经过对醋醅和果醋的富集培养、分离纯化和筛选得到如下菌株，其形态特征见表1和表2。表1醋醅中的产酸菌形态TAB1VINEGARGRAINSINTHEFORMOFACIDBACTERIA菌体形态MORPHOLOGY菌落特征COLONYCHARACTERISTICS编号NUMBER基本形态THEBASICFORM形状SHAPE表面SURFACE边缘EDGE隆起形状BULGESHAPE颜色COLORHC值HCVALUE1椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE斑点SPOTTED光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM412短杆，对生SHORTIRON,OPPOSITE圆形ROUND不光滑NOTSMOOTH不整齐IRREGULAR突起CONVEX白色WHITE523椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY扁平FLAT乳白色MILKY39274椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE缺刻NICK不光滑NOTSMOOTH不整齐IRREGULAR扁平FLAT乳白色MILKY565表2自制果醋中产酸菌的形态TAB2THEMORPHOLOGYOFSTRAINSOFVINEGARMADEINLABORATORY菌体形态MORPHOLOGY固体培养菌落特征COLONYCHARACTERISTICSOFSOLIDCULTURE编号NUMBER基本形态THEBASICFORM形状SHAPE表面SURFACE边缘EDGE隆起形状BULGESHAPE颜色COLORHC值HCVALUEB椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM2812312醋酸菌菌株的定性鉴定3121形态特征醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆形的到杆状，单生的、成对或成链排列，菌落特征为乳白色或乳黄色，圆形或斑点状，表面湿润，边缘比较整齐。优良的醋酸烟台大学毕业论文9菌产酸量较高，这可以通过溶解碳酸钙产生的溶钙圈的直径与菌落直径之比来判断，可以看出1、2菌种的HC值比较大，即产酸量可能会比较大，其他两种菌的HC值比较小，但是2菌种菌落表面不光滑，不符合醋酸菌菌落特征。而且具体产酸量的大小与HC值之比是否符合还有待验证。3122生理生化实验挑选出产透明圈的菌株进行革兰氏染色，其染色结果如下各图所示图1镜检结果1图2镜检结果2FIG1MICROSCOPICEXAMRESULTOF1FIG2MICROSCOPICEXAMRESULTOF2图3镜检结果3图4镜检结果4图5镜检结果BFIG3MICROSCOPICEXAMFIG4MICROSCOPICEXAMFIG5MICROSCOPICEXAMRESULTOF3RESULTOF4RESULTOFB从图1到图5五个照片中可以看出1、2、B三株菌均为革兰氏阴性菌，且形状为棒状短杆菌或杆菌且都为对生的，与醋酸菌的特征相符。根据氧化葡萄糖生成葡糖酸能力的强弱，将醋酸菌分为葡糖杆菌属和醋杆菌属，定性实验即从这两种醋酸菌中鉴别出醋杆菌属醋酸菌。根据醋酸铁溶液呈红褐色这一现象可以区分。由图6、图7、图8可以看出上述挑选的菌株只有1、B两种菌有红褐色溶液产生。将1改标记为A，即该实验的结果为选育出A、B两种醋酸菌。B烟台大学毕业论文10图6实验结果1图7定性实验结果BFIG6RESULTSOF1FIG7RESULTSOF图8实验结果2FIG8RESULTSOF2313醋酸菌生长曲线的绘制1用显微镜直接计数法测得的菌A的生长曲线787980818283848502468图9菌A生长曲线FIG9THEGROWTHCURVEOFA时间/DLOG10菌体数目烟台大学毕业论文11由图9可知，在开始的1D内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期；从第2D开始醋酸菌数量激增，到第4D醋酸菌数达到最大，这段时间内醋酸菌处于对数生长期；第4D到第5D醋酸菌数虽略有下降，但变化不大，此时醋酸菌处于稳定期；从第5D起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即第4D）滴定测其产酸量为2742G/L。2用显微镜直接计数法测得的菌B的生长曲线8081828384858687051015图10菌B的生长曲线FIG10THEGROWTHCURVEOFB由图10可知，在开始的1D内，醋酸菌增长较缓慢，此时醋酸菌处于延迟期；从第2D开始醋酸菌数量激增，到第8D醋酸菌的数目达到最大，这段时间内醋酸菌处于对数生长期；第8D到第12D醋酸菌的数目虽略有下降，但变化不大，此时醋酸菌处于稳定期；从第12D起醋酸菌处于衰亡期，活菌数不断下降。在稳定前期（即第8D）滴定测其产酸量为6465G/L。32诱变育种321紫外线诱变的菌株筛选3211紫外线诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定菌种A的致死率照射时间曲线如下图所示LOG10菌体数目时间/D烟台大学毕业论文12060708091011020406080图11紫外诱变对A菌致死率的影响FIG11THEDEATHRATEOFABYUSINGUVMUTAGENESIS由图11可以看出，在13S的时菌A的致死率达到75，因此选定13S为最佳诱变时间。用同样的方法对菌B进行紫外诱变，致死率照射时间曲线如下图00020406081012020406080图12紫外诱变对B菌致死率的影响FIG12THEDEATHRATEOFBBYUSINGUVMUTAGENESIS由图12可以看出，在25S时B的致死率为75，因此选择25S为最佳诱变时间对该菌种进行诱变。3212紫外诱变后的初筛在最佳诱变时间对两种菌株进行诱变，根据HC值的大小进行初筛。菌体诱变前和诱变后的形态见表3。表3诱变前后醋酸菌的形态TAB3THEFORMOFACETICACIDBACTERIABEFOREANDAFTERMUTATION编号NUMBER菌体形态MORPHOLOGY固体培养菌落特征COLONYCHARACTERISTICSOFSOLIDCULTURE时间/S致死率/致死率时间/S致死率时间/S致死率时间/S时间/S致死率烟台大学毕业论文13基本形态THEBASICFORM形状SHAPE表面SURFACE边缘EDGE隆起形状BULGESHAPE颜色COLORHC值HCVALUEA椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE斑点SPOTTED光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM41A11椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE斑点SPOTTED光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM513B椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM2812B11椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM4513B12椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM4015B13椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM4218通过表3的对比发现，诱变后的HC值明显变大。此类菌株有可能为高产醋酸菌，故挑选此类菌株进行定性实验。对A11、B11、B12、B13进行定性实验结果如下图所示图13A11实验结果图14B11实验结果FIG13RESULTSOFA11FIG14RESULTSOFB11图15B12实验结果图16B13实验结果FIG15RESULTSOFB12FIG16RESULTSOFB13由图13、图14、图15、图16的实验结果可以看出，定性实验培养液均变为红褐色溶液，并与对照培养液形成鲜明对比，故此四种菌均为醋酸菌。但是仅凭定性实验和HC值的大小并不能确定产酸量的变化情况，须通过对如上的几种菌进行复筛实烟台大学毕业论文14验以验证诱变的效果。3213复筛紫外诱变得到四种新菌种A11、B11、B12、B13，将四种菌接入定量实验培养基，于3005下120R/MIN摇床培养，待菌种到达稳定期后，立即用01MOL/L的氢氧化钠溶液滴定酸度。紫外诱变前和诱变后的菌株的生长曲线如下7879808182838485868702468系列1系列2图17A、A11生长曲线FIG17THEGROWTHCURVEOFAANDA118818283848586878805101520系列1系列2系列3系列4图18B、B11、B12、B13生长曲线FIG18THEGROWTHCURVEOFB、B11、B12ANDB13图17中系列1为诱变前菌株A，系列2为诱变后所得菌株A11。如图可以看出，诱变前后两株菌的生长期基本没有变化，只是诱变后的繁殖力增强，因此在对数期，菌株的数目增大的幅度比较大。与此同时，产生的结果可能是在保证培养基中营养物质足够用的前提下，产酸量会发生较大的变化。图18中系列1、2、3、4分别为B、B11、B12、B13。如图所示诱变后产生的三株醋酸菌的生长期基本与诱变前一致，只是繁殖力有所提高，因此单位时间内产生的菌体数目比诱变前有提高。另外，除了B12在对数期的增殖速率减小外其他的均变化不明显，因此，在保证培养基中的营养物质充足的条件下，产酸量均有可能增加。对以上挑选的菌株进行总酸的测定，其诱变前后的产酸量见表4。时间/DLOG10菌体数目LOG10菌体数目时间/D烟台大学毕业论文15表4诱变前后醋酸菌产酸量比较TAB4MUTATIONACIDPRODUCTIONOFACETICACIDBACTERIABEFOREANDAFTERCOMPARISON编号NUMBER产酸量/G/LTHEAMOUNTOFACETICACIDG/LA2742A113236B6465B116780B126283B136726由表4可以看出，诱变后所得的菌种的产酸量发生了明显的提高。A菌株的产酸量有了很大的提高，在原来的基础上提高了约18，B菌株诱变产生的新菌株中B11的产酸量提高最大,约为49，B13次之，B12发生负向突变，产酸量降低。322EMS诱变的结果筛选3221EMS诱变致死率曲线及最佳诱变时间的确定对菌A、菌B进行EMS诱变，做出致死率反应时间曲线，选择最佳诱变时间进行诱变。（1）菌A的致死率曲线如下00020406081012020406080图19菌A致死率曲线FIG19LETHALITYCURVEOFA由图19可以看出，在约17MIN时菌A致死率为75，因此选择此时刻为最佳诱变时间对菌株A进行EMS诱变。（2）菌B致死率曲线如下致死率时间/MIN致死率致死率时间/MIN时间/MIN时间/MIN烟台大学毕业论文16002040608112010203040506070图20B致死率曲线FIG20LETHALITYCURVEOFB由图20得菌B在约10MIN时致死率为75，因此选择此时刻为最佳诱变时间进行EMS诱变。3222EMS诱变后的初筛在最佳诱变时间对两种菌株进行诱变，根据HC值的大小对诱变后的菌株进行初筛。其诱变前和诱变后的结果见表5。表5诱变前后醋酸菌的形态TAB5THEFORMOFACETICACIDBACTERIABEFOREANDAFTERMUTATION菌体形态MORPHOLOGY固体培养菌落特征COLONYCHARACTERISTICSOFSOLIDCULTURE编号NUMBER基本形态THEBASICFORM形状SHAPE表面SURFACE边缘EDGE隆起形状BULGESHAPE颜色COLORHC值HCVALUEA椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE斑点SPOTTED光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM41A21椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE斑点SPOTTED光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM5012B椭圆，对生ELLIPSE,OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM2812B21椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM5515B22椭圆，对生ELLIPSE，OPPOSITE圆形ROUND光滑SMOOTH整齐TIDY突起CONVEX乳黄色CREAM5015由表5可以看出，诱变后所得到的三株菌A21、B21、B22的HC值比诱变前有一定的改变，即说明诱变后的菌株的产酸量可能会提高，至于HC值与诱变后的产酸量变化是否吻合还需要经过后期的复筛实验予以确认。对挑选出的A21、B21、B22进行定性实验，其定性结果如下时间/MIN致死率致死率时间/MIN时间/MIN烟台大学毕业论文17图21左侧试管为定性实验结果，右侧为未加热的对照组，其他两图均左侧为对照组，右图为定性实验结果。由实验结果可以看出A21、B21、B22三株菌种均为醋杆菌属。3223复筛实验EMS诱变得到的新菌种A21、B21、B22，现需要通过复筛实验选出高产菌株。将结果同诱变前进行比较，以验证诱变的效果。表6诱变前后醋酸菌产酸量比较TAB6MUTATIONACIDPRODUCTIONOFACETICACIDBACTERIABEFOREANDAFTERCOMPARISON编号NUMBER产酸量（G/L）THEAMOUNTOFACETICACIDG/LA2742A213140B6465B216565B226365由表6可以看出，在诱变后，菌A、菌B的产酸量都有所提高，其中菌A的产酸量发生了较大的变化，而且为正向突变，提高了145，菌B虽然有变化，但是变化不大。而且B22还发生了反向突变。但总的结果还是提高了菌株的产酸量。图22B21实验结果FIG22RESULTSOFB21图21A21实验结果FIG21RESULTSOFA21图23B22实验结果FIG23RESULTSOFB22烟台大学毕业论文1833醋酸菌产酸量的影响因素331单因素试验设计（1）温度对醋酸产量的影响将菌种接入产酸培养基中，振荡培养结束后，进行酸碱滴定，分别得到结果如下表表7A11耐温度试验设计及结果TAB7TESTDESIGNANDRESULTSOFTEMPERATURERESISTANTBYA11试验号TESTNO温度/TEMP/乙醇浓度/ALCOHOL/溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML1253120144265322831201443513330312014429984323120144252653531201441855表8B11耐温度实验设计及结果TAB8TESTDESIGNANDRESULTSOFTEMPERATURERESISTANTBYB11试验号TESTNO温度/TEMP/乙醇浓度/ALCOHOL/溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML1253120264279228312026431973303120264359432312026429353531202642252最后计算并综合作图如下烟台大学毕业论文19图25温度对A11、11醋酸产量的影响FIG25THEEFFECTOFTEMPERATURETOA11、B11所以由图25得知系列1为温度对A11的影响趋势线，得到A11在温度为28时产酸量最高；系列2为温度对B11的影响趋势线，得知B11温度为30时产酸量最高。由于培养方式为振荡培养，温度对其产酸量有较大影响。在实验条件下验证得知，温度越高，醋酸的挥发性就越高，最终得到的醋酸产量越少。所以适宜温度并非是3640的范围内（2）溶氧量对醋酸产量的影响按照以确定温度的优化条件将醋酸菌按5的接种量接入转速分别为120R/MIN、130R/MIN、140R/MIN、150R/MIN、160R/MIN、170R/MIN的产酸培养基中，醋酸发酵结束后测定菌种的总产酸量。表9溶氧量对A11产酸量的影响TAB9DISSOLVEDOXYGENONTHEACIDPRODUCTIONOFA11试验号TESTNO溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN乙醇浓度/ALCOHOL/温度/TEMP/时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML112032814414472130328144266331403281442720415032814437495160328144312461703281442724表10溶氧量对B11产酸量的影响产酸量/G/ML温度/烟台大学毕业论文20TAB10DISSOLVEDOXYGENONTHEACIDPRODUCTIONOFB11试验号TESTNO溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN乙醇浓度/ALCOHOL/温度/TEMP/时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML112033026420262130330264280931403302643357415033026435855160330264244961703302642335最后计算并作图如下图26溶氧量对A11和11醋酸产量的影响FIG26DISSOLVEDOXYGENONTHEACIDPRODUCTIONOFA11ANDB11摇床转速影响培养基中的氧气含量，即溶氧量对醋酸产量的影响。由图26可知，系列1为A11，系列2为B11，两种菌种均在摇床转速为150R/MIN时总产酸量最高。（3）初始酒精度对醋酸产量的影响按照以确定的优化条件，分别向不同初始酒精度的产酸培养基中接入菌种，摇床振荡培养，发酵结束测定其总产酸量，结果如下表表11初始酒精度对A11产酸量的影响TAB11INITIALALCOHOLONTHEACIDPRODUCTIONOFA11试验号TESTNO乙醇浓度/ALCOHOL/溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN温度/TEMP/时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML13150281443085241502814436423515028144437046150281442956烟台大学毕业论文2157150281448236815028144012表12初始酒精度对B11产酸量的影响TAB12INITIALALCOHOLONTHEACIDPRODUCTIONOFB11试验号TESTNO乙醇浓度/ALCOHOL/溶氧量/R/MINSPEED/R/MIN温度/TEMP/时间/HTIME/H产酸量/G/MLTOTALACIDITY/G/ML131503026416552415030264205235150302643108461503026442195715030264192868150302641854由表11和表12中菌11和菌B11在不同乙醇浓度下的总产酸量进行综合计算并作图如下图27初始酒精度对A11和B11产酸量的影响FIG27INITIALALCOHOLONTHEACIDPRODUCTIONOFA11ANDB11由图27可知，酒度处于较低水平时，醋酸菌生长较慢，醋酸发酵所产生的酸度较低；而当酒度处于较高水平时，会超过醋酸菌对酒精的耐受值，产酸能力反而下降，影响醋酸发酵的效果。故醋酸发酵的醋酸菌对初始酒精度有最佳要求。因此得出，A11的最佳初始酒精度为5；而B11的初始酒精度为6时总产酸量最高。332单因素实验设计检验采用优化后的培养条件与优化前的培养条件进行产酸对照，测定醋酸总产酸量，结果见表13。表13培养条件优化前后的醋酸的产量TAB13BEFOREANDAFTEROPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONSFORPRODUCTIONOFACETICACID初始酒精度/产酸量/G/ML烟台大学毕业论文22菌种BACTERIA优化前的产酸量ACIDPRODUCTIONBEFOREOPTIMIZATION优化后的产酸量ACIDPRODUCTIONAFTEROPTIMIZATION提高率/IMPROVETHERATE/A11274243703725总酸度/G/MLB11359042191491根据表13中菌A11和菌B11经过单因素优化后总产酸量的提高量做对比图如下A11B1105101520253035404550总产酸量/G/ML系列1系列2图28培养条件优化前后的醋酸的产量FIG28BEFOREANDAFTEROPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONSFORPRODUCTIONOFACETICACID333小结通过单因素实验设计结果得知A11的发酵周期为6D，最佳优化条件为温度28，溶氧量150R/MIN，初始酒精度为5；B11的发酵周期为11D，最佳优化条件为温度30，溶氧量150R/MIN，初始酒精度为6。烟台大学毕业论文234结论本实验的实验目的旨在通过选育醋杆菌属醋酸菌，经过诱变提高醋酸菌的产酸量，以更好的应用于工业生产。通过分离筛选及定性实验确定菌A、菌B两株产醋酸菌株。定量实验结果显示两菌株产酸量较高，适于运用诱变育种提高其产酸量。综上实验，就此紫外诱变和EMS二种诱变剂而言，紫外线是醋酸菌诱变的最佳诱变剂。诱变后所得的菌种的产酸量发生了明显的提高