蛋白质化学PPT课件

蛋白质化学,第二章 蛋白质化学,主要内容： 主要介绍蛋白质的构件单位氨基酸的结构、分类、性质。了解肽的概念、结构。重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系。,目 录,第一节 蛋白质的生物学功能及元素组成第二节 蛋白质的基本组成单位氨基酸第三节 肽第四节 蛋白质的分子结构第五节 蛋白质结构与功能的关系第六节 蛋白质的重要性质第七节 蛋白质的分离纯化技术第八节 蛋白质的分类,蛋白质的结构层次,一级结构：氨基酸的排列序列，由遗传物质决定。二级结构：多肽链的主链骨架本身（不包括R基团）在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。三级结构：是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。四级结构：具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。其内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。,蛋白质的四种结构层次,化学键,共价键,次级键,肽键,二硫键,氢键,疏水作用,离子键,范德华力,一级结构,二、三、四级结构,三、四级结构,蛋白质分子中的共价键与次级键,配位键,第五节 蛋白质结构与功能的关系,蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。,蛋白质一级结构是空间结构的基础蛋白质的空间结构决定其功能,一、蛋白质一级结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构的基础蛋白质复杂的空间构象所需的信息包含在它的一级结构中，是由肽链中氨基酸的排列顺序决定的。特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持。一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。一级结构的改变，往往引起蛋白质功能的改变。,一、蛋白质一级结构与功能的关系,（一）一级结构相似的蛋白质具有相似的功能,同源蛋白质种属差异与生物进化 （一级结构的种属差异）同源蛋白质（homologous protein）： 不同生物体内具有相同功能的蛋白质，由同一祖先进化而来。 例如：hemoglobin输送氧气 cytochrome组成电子传递链,Homologous protein特点：肽链长度相同或相近。序列中许多位置的氨基酸对所有种属都是相同的，称保守残基（conserved residue）。保守残基高度保守，是必需残基。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属的差异很大，称可变残基（variable residue）。可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的结构与功能。,通过比较homologous protein 的氨基酸序列（amino acid sequence），可以研究不同物种间的亲源关系和进化关系。 Sequence homology 亲源关系越远，homologous protein的amino acid sequence差异就越大。,细胞色素c（cytochrome c）细胞色素c是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于真核生物线粒体中。大多数种属的细胞色素c，分子量为12500，含有100个左右的残基。60个种属的细胞色素c氨基酸顺序已被测定。肽链中28个位置的氨基酸对所有已测试的种属都相同的，表明这些残基是规定细胞色素c功能所必需的。,Conservation and variation of cytochrome c sequences,28 invariant residues (yellow),conservative substitutions (blue)nonconservative or variable residues (unshaded),不同物种的细胞色素c一级结构的比较,亲源关系越近，其细胞色素c的差异越小亲源关系越远，其细胞色素c的差异越大,各物种中细胞色素c可变残基顺序的差异和分歧时间氨基酸顺序 种差异数目 分歧时间(百万年）人-黑猩猩 0 人-猴 1 5060人-马 12 7075人-狗 10 7075猪牛羊 0 马-牛 3 6065哺乳类-鸡 1015 280脊椎动物-酵母 4348 1100,系统进化树,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,不变的AA残基，是Cyt c 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,与酶结合的部位,细胞色素c一级结构的比较告诉我们什么？,存在于所有的需氧生物：从细菌到人类。大多数都由104个氨基酸组成，28/104不变。在15亿年之前（植物和动物“分家”）开始进化。两个物种之间氨基酸的差异程度反映了它们之间的亲缘关系，据此可绘出进化树。氨基酸的差异不是随机的。氨基酸的差异由自然选择才保留下来。,（二）一级结构的改变引起蛋白质功能的改变,分子病：基因突变功能蛋白氨基酸残基遗传性替代整个分子的三维结构改变功能部分或全部丧失镰刀型红细胞贫血（sickle-cell anemia）是由于hemoglobin发生了遗传突变引起的。链第6位的氨基酸残基由正常的Glu变成了疏水的Val。 正常人血红蛋白： .N.Glu 6 镰刀型贫血： .N.Val 6,镰刀型红细胞贫血,正常红细胞,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,蛋白质的空间结构决定其功能每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。当蛋白质特定构象存在时，蛋白质表现出生物学功能。一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。相同功能的蛋白质，高级结构很相似；高级结构决定生物学功能，功能与结构相互适应。,二、蛋白质空间结构与功能的关系,7265,58 110,9540,84 26,7265,58 110,9540,84 26,HS,26,HS 40,58SH,SH 65,HS 72,SH 84,95 HS,HS 110,天然状态有催化活性,-S-S-恢复， 正确配对，有活性,非折叠状态，无活性，-S-S- 被还原成Cys残基,（一）核糖核酸酶的折叠与去折叠,分子伴侣（molecular chaperone),新生肽 功能蛋白,分子伴侣,组蛋白 核质素 DNA,核小体,在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。,能识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽，帮助新生多肽链正确折叠。可逆地与新生肽结合，然后帮助它折叠为具有特定空间结构的蛋白质。与错误折叠的肽段结合，使之解聚再诱导其正确折叠。帮助蛋白质分子穿膜进入细胞器的转位过程。,分子伴侣的基本功能,蛋白质二硫键异构酶PDI的作用机制,王志珍院士“漫画”蛋白质世界,（二）肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合,1、肌红蛋白(Mb)的结构2、血红蛋白(Hb)的结构3、Mb和Hb的氧合曲线及比较4、Hb的别构效应,1、肌红蛋白的结构,肌红蛋白由一条153个AA组成的肽链和一个血红素辅基组成。分子量为17800。肌红蛋白的三级结构是由一簇八个-螺旋组成的，螺旋之间通过一些片段连接。肌红蛋白中的四分之三AA残基都处于-螺旋中。,肌红蛋白的三维结构,2、血红蛋白的三维结构,1,2,1,2,Hb的链、链和Mb链构象的相似性,血红蛋白链、链及肌红蛋白链的三级结构非常相似，但这三种肽链的氨基酸序列有很大不同，141个氨基酸残基位置中只有27个位置的残基在这三种肽链中是相同的。,Mb Hb Hb,3、肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线,Mb的氧合曲线,令: 氧饱和度,（1）,将（2）带入（1）式，得：,Y 对 Po2 作图得 氧合曲线,可推得：,Hb的氧合曲线,（1）,将（2）带入（1）式，得：,Y 对 Po2 作图得氧合曲线,求得：,令: 氧饱和度,血红蛋白与肌红蛋白氧合曲线的比较,Mb和Hb在不同pH下的氧合曲线,4、血红蛋白的别构效应,O2与肌红蛋白和血红蛋白的结合,血红素中铁的第5个配位键与珠蛋白的第93（或F8）位His残基的咪唑基N结合，这个His称为近侧His，而O2与Fe的第6个配位键结合。在肌红蛋白没有结合O2时，这个部位是空的。高铁肌红蛋白不能与O2结合，H2O分子代替O2成为第6个配体。 在血红素结合O2的一侧，还有一个His残基，即第64（或E7）位His残基，称为远侧His。由于这个远侧His的存在，使得O2的结合受到空间位阻。在氧合肌红蛋白中，O2的两个原子与Fe不成一条直线，而是倾斜了30。,氧合肌红蛋白中血红素Fe2+的6个配体,O2的结合改变Mb和Hb的构象,脱氧血红蛋白中的Fe()只有5个配体，并位于卟啉环上方0.055 nm。当氧结合时， Fe()被拉回到卟啉环平面，离卟啉环平面仅为0.026 nm。这种结构的改变对肌红蛋白意义不大，但显著的改变了血红蛋白的性质，改变了四聚体的亚基间的作用，使之具有别构效应。,血红蛋白的别构效应,血红蛋白是一个四聚体蛋白，它与肌红蛋白相比，出现了一些新的性质。血红蛋白的一个亚基与一个O2结合后，会促进同一分子其它亚基与O2的结合。具有这种性质的蛋白质称为别构蛋白。,蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。,一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。,（三）朊病毒与构象病,1732年，英国牧羊人发现一种可致绵羊死亡的羊瘙痒病，亦称羊痒病。19201921年，德国两位神经病理学家 Creutzfeldt 和Jacob首先系统描述并报道了 1名22岁妇女和 6例中年人发生早老痴呆的中枢神经系统变性病，死者脑组织呈弥漫性神经元变性，后命名为克雅氏病（CJD）。1939年，英国Cuille与Chelle医生研究患羊痒病的脑组织证实传染因子存在于脑组织液中，具“类病毒”的特征。,1957年，发现在新几内亚高地有食尸习俗的土著部族中流行一种震颤病，亦称kuru病，死者脑组织呈海绵状变性。之后，分别将kuru病和CJD死者的脑组织滤液接种于猩猩及猴均获得成功，动物染病且病原传代，从而证实羊痒病、kuru病、CJD可能为同一病原。1980年，美国神经学教授Prusine从患羊痒病的羊脑中提纯使接种小鼠全部发病的传染因子，并确定该因子是不含核酸却能不停复制而具传染性的奇特蛋白质粒子，他将该致病因子命名为prion，称此蛋白为“Prion Protein”，简称PrP)。他因此获1997年诺贝尔医学生理学奖。,PrPc转化为PrPsc结构模式图,正常的Prion蛋白含有大量的螺旋,病变的Prion蛋白含有更多的折叠,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,第六节蛋白质的重要性质,一、 蛋白质胶体性质二、 两性解离性质及等电点三、 蛋白质的沉淀四、 蛋白质的变性与复性五、 蛋白质的颜色反应六、 蛋白质的紫外吸收光谱,一、蛋白质的胶体性质,将一种物质或几种物质（分散相）分散在另一种物质（分散介质）中就构成了分散体系。真溶液（分散相质点1 nm）胶体溶液（1-100 nm）悬浊液（100 nm）胶体溶液的三个条件：分散相质点1-100 nm分散相质点带同种电荷，相互排斥使之不易沉淀分散相质点表面形成溶剂化层，使之不易靠拢聚集成较大的颗粒而沉淀,蛋白质水溶液为稳定的亲水胶体，其成因：直径在220 nm；颗粒外面形成一层水化层（表面极性AA对水亲合性）；带电荷（在非等电点时，相同蛋白质颗粒带同种电荷，相互排斥）。,水化膜,双电层,二、蛋白质两性解离和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。,等电点时，蛋白质的溶解度、粘度，渗透压、膨胀性和导电能力均为最小。,三、蛋白质的沉淀,沉淀：蛋白质分子因脱水、失去电荷、变性或生成难溶盐而从溶液中沉淀析出的现象。如果加入适当的试剂破坏蛋白质分子形成的水化层或双电层，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。,引起蛋白质沉淀的因素,1、高浓度中性盐 加入高浓度的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4等，可破坏蛋白质的水化层，并中和蛋白质的电荷，从而使蛋白质沉淀析出，此现象称为盐析。该方法不会使蛋白质产生变性，是最常用的蛋白质沉淀方法。 在低浓度时，中性盐使蛋白质分子吸附少量相反电荷的盐离子，起到稳定双电层的作用，因此其溶解度随稀盐浓度的增加而增大，这种现象称为盐溶。,2、有机溶剂在蛋白质溶液中加入能与水互溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等，可破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质发生沉淀。有机溶剂还会降低蛋白质的介电常数，削弱蛋白质分子之间的斥力，从而降低蛋白质的溶解度，使蛋白质沉淀。此法常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。常用于蛋白质或者酶的提纯。,3、重金属盐重金属盐可与蛋白质中带负电的基团结合使蛋白质沉淀，同时还会使之变性。4、生物碱试剂生物碱试剂是能引起生物碱沉淀的一类试剂。一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。蛋白质在酸性条件下带正电，能与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。5、加热几乎所有蛋白质都因加热变性而凝固；少量盐可促进凝固；当处于蛋白质等电点时，加热凝固迅速而完全。6、酸碱等电点沉淀,四、蛋白质变性与复性,蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。变性实质是分子中各种次级键被破坏（有时包括二硫键），其空间构象从紧密有序状态变成松散无序状态，但不涉及肽链的断裂，因此一级结构仍是完整的。,引发变性的因素物理因素：加热、紫外线、X射线、超声波、剧烈振荡、搅拌或高压等。化学因素：强酸、强碱、脲、胍、重金属盐、生物碱、有机溶剂等。变性伴随的表现功能上：生物活性丧失。理化性质上：紫外吸收和粘度增大，溶解度、渗透压和扩散速度降低，易絮凝、不易结晶（可判断蛋白质是否为天然构象），疏水基团外露，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。应用变性灭菌、消毒；变性制食品,蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。,核糖核酸酶变性与复性,五、蛋白质的颜色反应,双缩脲反应 酚试剂反应 蛋白质定量、定性测定常用方法 茚三酮反应,六、蛋白质的紫外吸收光谱,蛋白质在远紫外光区（200-230 nm）有较大的吸收，在280 nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,蛋白质质量浓度（mg/ml）=1.45A - 0.74A,测定范围：0.10.5 mg/ml,260,280,蛋白质分离提纯的一般原则,根据蛋白质的溶解度分离根据电荷差异分离根据分子大小分离根据配体特性异性分离选择性吸附分离根据疏水性的差异,第七节 蛋白质的分离纯化技术,一、透析与超过滤,* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超过滤 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜分离技术。 原理： 大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到分离。,技术关键： 根据欲分离成分的具体情况选用规格适宜的过滤膜。 不同膜过滤被截留的分子大小有区别。如运用超滤，选用适当规格的膜可实现对中药提取液中多糖类、多肽类、蛋白质类的截留分离。,二、电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。,几种重要的蛋白质电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,样品,浓缩胶,分离胶,+,使用较厚的间隔条,1/2,1/4,-,分离胶,SDS-PAGE电泳,聚焦在pI,在低 pH 处带正电被排斥,在高 pH 处带负电被排斥,等电聚焦电泳（IEF）,双向电泳,Isoelectric Point,kD,SDS-PAGE,pH,三、层析技术,层析（chromatography）分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。* 凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,* 亲和层析：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。,四、超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)在重力作用下，蛋白质在溶液中逐渐沉降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降结束。既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,第八节 蛋白质的分类,结合蛋白质,根据组成分类,简单蛋白质,膜蛋白,练一练,在蛋白质和多肽分子中，只存在一种共价键。（ ）蛋白质的特异性功能主要取决于： A、各氨基酸的相对含量 B、氨基酸的种类 C、氨基酸的排列顺序 D、非氨基酸,练一练,血红蛋白的氧合曲线形状是（ ） A、双曲线 B、抛物线 C、S形曲线 D、直线镰刀型红细胞性贫血是哪种蛋白质结构的异常（ ） A、淀粉酶 B、胰岛素 C、血红蛋白 D、肌红蛋白别构效应常发生在具有（ ）结构的蛋白质上 A、一级 B、二级 C、三级 D、四级以下哪种因素一般不易使蛋白质变性（ ） A、强酸强碱 B、加热 C、X射线 D、低温,名词解释1、等电点 2、同源蛋白质 3、肽平面 4、蛋白质一级结构 5、蛋白质二级结构 6、超二级结构 7、结构域 8、蛋白质三级结构 9、蛋白质四级结构 10、亚基 11、寡聚蛋白 12、蛋白质变性13、蛋白质沉淀 14、蛋白质盐析 15、蛋白质盐溶 16、简单蛋白质 17、结合蛋白质 18、必需氨基酸,名词解释,等电点：当氨基酸或蛋白质溶液处在某一pH值时，氨基酸或蛋白质解离成正、负离子的趋势和程度相等，即形成兼性离子或两性离子，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该氨基酸或蛋白质的等电点。肽平面：由于肽键具