苹果皮渣固态发酵生产菌体蛋白饲料工艺优化及产物品质分析

苹果皮渣固态发酵生产菌体蛋白饲料工艺优化及产物品质分析核农学报，（）文章编号（）苹果皮渣固态发酵生产菌体蛋白饲料工艺优化及产物品质分析刘倩男哈益明靳婧（中国农业科学院农产品加工研究所，北京）摘要为提高苹果皮渣中粗蛋白的含量，以黑曲霉为发酵菌种发酵苹果皮渣，通过单因素试验对影响苹果皮渣固态发酵的参数进行优化，在此基础上进一步采用响应面试验筛选最佳发酵工艺参数，并对最佳工艺条件下的发酵产物品质进行分析。结果表明，黑曲霉发酵苹果皮渣的最佳工艺条件为黑曲霉接种量、发酵温度、水料比、发酵时间。此条件下苹果皮渣经发酵后粗蛋白含量从提高到，粗脂肪含量从提高到，粗纤维含量从降低到，氨基酸总含量从提高到，必需氨基酸含量从提高到。综上，黑曲霉发酵可以显著提高苹果皮渣的营养价值，这为苹果皮渣资源化利用、缓解蛋白质供需矛盾提供了有效途径。关键词黑曲霉；固态发酵；苹果皮渣；营养价值我国是世界上最大的苹果（）生产国，年苹果总产量达万，近几十年来，我国苹果浓缩汁加工业发展迅速，在世界苹果浓缩汁产业中占有相当突出的地位，其中世界苹果浓缩汁以上的产量和贸易量由我国主导。苹果浓缩汁加工过程中会产生大量的苹果鲜渣，我国每年形成的苹果鲜渣接近万，是苹果皮渣的主要来源。苹果皮渣含有较高的水分和丰富的营养物质，易量；同时降低苹果皮渣中粗纤维的含量，消除苹果皮渣中的抗营养因子。因此，研究和开发苹果皮渣菌体蛋白饲料，对苹果皮渣资源化利用、缓解蛋白饲料供需矛盾具有深远的现实意义。利用微生物发酵开发苹果皮渣菌体蛋白饲料在国内外已有一些相关报道，但主要集中在以苹果皮渣作为发酵培养基提高粗蛋白含量方面，而对不同发酵条件下发酵后产物氨基酸含量与种类变化的研究较少。黑曲霉（）是公认的安全菌株，可以产生多种胞外酶以分解纤维素，培养条件粗放，可在多种基质上生长。本试验采用黑曲霉作为发酵菌株，对苹果皮渣固态发酵进行单因素及响应面优化试验，对比发酵前后苹果皮渣中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、氨基酸、微量元素及重金属元素含量的变化，筛选出适合苹果皮渣发酵的最佳工艺参数，并对最佳工艺条件下的发酵产物进行品质分析和营养评价，旨在为苹果皮渣的资源化利用与富有营养的高蛋白饲料的研发提供技术支撑。被微生物侵染，资源化利用难度较大，废弃处理又会造成严重的资源浪费和环境污染；其经发酵干燥后形成蛋白饲料，可用于饲喂动物，降低饲喂成本，提高经济效益。尽管苹果皮渣含有丰富的纤维素、可溶性糖、维生素及矿物质等营养物质，但其蛋白质含量偏低，且含果胶、单宁等易与营养物质结合，形成阻碍消化作用的抗营养因子，此外苹果皮渣用作饲料大量饲喂动物容易造成动物营养不良、腹泻等问题。利用微生物发酵苹果皮渣生产单细胞蛋白饲料可大幅度提高苹果皮渣中蛋白质、脂肪、维生素等营养元素的含收稿日期接受日期基金项目农业部公益性行业（农业）专项（）作者简介刘倩男，女，主要从事苹果渣发酵生产菌体蛋白饲料研究。通讯作者哈益明，男，教授，主要从事辐照食品加工与贮藏研究。材料与方法仪器与试剂快马速弗水炉分（测定仪，（，美国），德国），肪分析仪全自动凯氏定氮仪（，（，意大利瑞典），），全自动型脂氨基酸分析仪（日立，日本），四氟乙烯消解罐，电热恒温鼓风干燥箱（武汉利辉仪器厂计（济南创远仪器有限公司恒温培养振荡器超净工作台（上海智城仪器有限公司），光照培养箱（国华仪器厂（上海智城仪器有限公司），），），粉碎机），（酸度北京锟捷玉诚仪器厂），电子分析天平（梅特勒托利多仪器公司），电子天平（上海佑科仪器有限公司）。蔗糖、硝酸钠、七水硫酸镁、氯化钾、四水合硫酸亚铁、磷酸氢二钾、尿素，所用试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。菌种保藏管理中心菌种与培养基发酵菌种。黑曲霉菌株购自中国普通微生物培养基培养基蔗糖硝酸钠，七水硫酸镁，氯化钾，黑曲霉种子液体培养基，四水合硫酸亚铁琼脂。，磷酸氢二钾蔗糖，七水硫酸镁，氯化钾，硝酸钠四水合硫酸亚铁，发酵培养基苹果皮渣（，陕西海升集团提供磷酸氢二钾）。，。尿素，混匀装于三角瓶中，灭菌斜面培养基上试验方法菌种的活化，于将保存的菌种接种到恒温培养箱中培养后转接活化子于黑曲霉液体种子培养基中次种子液的制备，于中保存备用用接种环接种一环黑曲霉孢。，调整孢子浓度为个，、摇床中培养。种比例接种到固体发酵培养基上进行培养固体发酵将发酵好的种子液按照相应的接。单因素试验优化发酵条件对菌种接种量、发酵时间、发酵温度、水料比个因素进行单因素试验，根据发酵后苹果皮渣中的粗蛋白含量、干物质得率和蛋白质得率筛选出最佳的发酵条件量下烘干。每个处理。每一轮筛选的最佳参数作为下一轮筛选时的发酵、称重、粉碎过个重复。目筛发酵结束后，用于测定粗蛋白质含，将样品于条件。添加、接种量的优化、共设计（）个处理组的黑曲霉种子液，每组分别。水料比，温度，发酵时间，自然。梯度（、），水料比的优化按接种量的优化结果进行接种设置个不同的初始水料比，其余条件同（、发酵温度的优化。进行试验），按接种量设置、水料比的优化结果个不同的温度梯度，其他条件同。、发酵时间的优化进行试验），。按接种量、水料比设置、发酵温度的优化结果个时间梯度（、响应面试验在单因素试验的基础上，根据响应面设计原（理，选取发酵时间（）、温度（为响应值）、接种量）、水料比，设计了四因素三水平的（）个因素为变量，以粗蛋白含量组试验，其中包（）括组因素试验和组中心试验点，试验均为随机顺序以降低不可控因素造成的系统误差。试验结果使用二次多项式进行拟合为响应值，其中，和分别为变量回归系数常数项、线性项、二次项和交互项。量。使用方差分析（）验证回归模型的显著性、为自变、失拟性和回归系数的显著性，计算相关系数决定系数、校正根据响应面试验优化出的发酵参数对苹果皮渣进、残差、纯误差及变异系数（）。行固态发酵目筛，用于测定粗蛋白，发酵结束后产物于、粗纤维、粗脂肪下烘干、氨基酸、粉碎过量元素及重金属的含量。、微指标测定水分的检测参照测定，粗蛋白的检测参照饲料中水分的粗蛋白测定方法，粗纤维的检测参照饲料中饲料中粗纤维测定方法检测参照，粗脂肪的检测参照饲料中粗脂肪的测定饲料中粗灰分的测定，粗灰分的，核农学报卷氨基酸的检测参照饲料中氨基酸的测定试验动，矿物元素的检测参照物、配合饮料、矿物质和微量元素的测定。数据分析用软件对单因素试验数据进行统计分析，法进行多重比较，软件进行响应面试验设计及分析。结果与分析影响单因素试验结果由表黑曲霉种子液接种量对苹果皮渣发酵效果的可知，随着接种量的增大，发酵产物的粗蛋白含量先增加后降低，干物质得率呈现一直降低的趋势，粗蛋白的得率也呈现先增加后降低的趋势。当接种量为时，发酵产物的粗蛋白含量最高，达到产物的粗蛋白得率也最大，与其他接种量之间差异显著，达到。与此同时发酵，所以接种量选择为宜。表黑曲霉种子液接种量对苹果皮渣发酵效果的影响接种量粗蛋白含量干物质得率粗蛋白得率率、粗蛋白得率均以风干基础测定注表中数据均以平均值标准差表示，粗蛋白得率。粗蛋白含量干物质得率、干物质得粗蛋白含量。同行数据中的不同小写字母表示差异显著（）。下同。，由表可知水料比对黑曲霉发酵苹果皮渣效果的影响，随着水料比的增大粗蛋白含量先增加后减小，干物质得率呈现先减少后增加的趋势，粗蛋白得率先增加后减少。当水料比为时，发酵产物的粗蛋白含量最高，达到，与水料比为、时差异显著（），与水料比为时差异不显著。水料比为，时因此后续试验选择水料比为，发酵产物的粗蛋白得率。也最高，达到表水料比对黑曲霉发酵苹果皮渣效果的影响水料比粗蛋白含量干物质得率粗蛋白得率量先增加后降低由表发酵温度对黑曲霉发酵苹果皮渣效果的影响可知，随着温度的增加，干物质得率呈现一直降低的趋势，发酵产物的粗蛋白含，粗蛋白的得率呈现先增加后降低的趋势其他温度相比差异显著时，发酵产物的粗蛋白含量最高（），达到。当温度为但此温度下干物，与质得率最低；当温度为时，发酵产物的粗蛋白得率最高，达到，与相比差异不显著。但当温度为时，菌丝长势快，杂菌不易生长，所以后续试验的发酵温度选择。表发酵温度对黑曲霉发酵苹渣效果的影响发酵温度粗蛋白含量干物质得率粗蛋白得率白含量一直增加由表发酵时间对黑曲霉发酵苹果皮渣效果的影响可知，随着发酵时间的延长，干物质得率呈现一直降低的趋势，发酵产物的粗蛋，粗蛋白的得率呈现先增加后降低的趋势时，发酵产物的粗蛋白含量最高，达到。当发酵时间为此发酵时间下干物质得率最低，仅为，且培养，但表发酵时间对黑曲霉发酵苹果皮渣效果的影响发酵时间粗蛋白含量干物质得率粗蛋白得率高，达到，而且此时培养基无不良气味及孢子响应面试验结果的产生，所以后续试验的发酵时间选择。由表可知，在响应面试验条件下，苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量在之间，使用软件对试验试验数据进行多元回归分析，得到二次多项响应面回归模型苹果皮渣菌体蛋白饲料粗蛋白含量的方差分），方程决定系数为，表明回归方程拟合析由表可知，二次多项式回归模型极显著（。基中黑曲霉产生大量孢子，影响了发酵产物的感官性状。当发酵时间为时，发酵产物的粗蛋白得率最表响应面试验设计与结果序号（）（）发酵时间（）（）（）发酵温度（）（）（）接种量（）（）（）水料比蛋白质含量（）核农学报卷表黑曲霉发酵苹果皮渣粗蛋白含量的方差分析（）方差来源模型残差失拟项纯误差总误差相关系数校正决定系数变异系数平方和自由度均方值值显著性注无显著作用；表示在水平上差异显著；表示在水平上差异显著。，良好，与试验结果有的符合度，校正决定系数为，也表明模型具有良好的拟合性，模型的失拟性，说明模型的失拟性不显著。模型的变异系数为，表明该二次多项式模型具有可重复性。因此，该方程可以准确的预测苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白的含量。由验证可知，各因子贡献率为有显著的影响（），其他因子对苹果皮渣菌体交互作用对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量的影响根据回归方程预测个因素对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量的影响。由图以及结合回归方程系数的显著性可知，各试验因素对响应值不是简单线性关系，存在交互作用。由图、可知，当水料比为时，发酵时间与温度、发酵时间与接种量的交互作用对苹果皮渣菌体时，发酵时间与水料比的交互作用对苹果皮渣菌由图可知，接种量对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白的含量影响不显著，温度对苹果皮渣菌体蛋白蛋白饲料中粗蛋白含量影响不显著。当接种量为体蛋白饲料中粗蛋白含量影响也不显著（图）。蛋白饲料中粗蛋白含量影响不显著。，即对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量（）的影响主次因子顺序为发酵时间温度水料比接种量。值通常用于反映各个回归系数的显著性，值越小表明回归系数越显著。方程各回归系数方差分析表明，因子、对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量具有极显著的影响（），因子、对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量具期图发酵条件对苹果皮渣菌体蛋白饲料粗蛋白含量的影响饲料中粗蛋白的含量影响显著（），在不同接种量下粗蛋白含量均随温度的升高呈先升高后降低的趋势。这是由于每种微生物都有适合的生长温度，温度过低微生物生长繁殖慢，合成蛋白质的速度低；而温度过高，微生物体内的酶活也随之降低，导致微生物繁殖速度降低。由图可知，当接种量为时，温度与水料比二者之间交互作用不显著。由图可知，接种量与水料比的交互作用对苹果皮渣菌体蛋白饲料中粗蛋白的含量影响极显著（），当水料比为时，粗蛋白含量随接种量的升高而增加；当水料比为时，粗蛋白含量随接种量的升高而降低。这可能是由于水料比为时，培养基中的水分含量过少，微生物活性极弱，高接种量在带来大量的微生物的同时也增加了培养基中的水分含量，随着接种量的增加培养基含水量增加，微生物繁殖旺盛，粗蛋白含量增加；而在水料比为时，培养基中的水分含量已远超出微生物的需求，接种量越高带来的水分含量越高，越不利验证试验响应面优化求得各因素的理论最，水料比，在该条件下粗蛋白理论值为优条件为发酵时间，温度，接种量。在实际操作中将条件修正为发酵时间，于微生物的生长，粗蛋白含量随之下降。核农学报卷温度，接种量，水料比，在此条件下发酵苹果皮渣，重复次，测得苹果皮渣生产菌体蛋白饲料的粗蛋白含量为，与理论预测值相比，预测准确率为。由此表明，利用响应面法优化发酵最优条件发酵结果苹果皮渣生产菌体蛋白饲料的条件是可行的。在试验最佳条件，即发酵时间，温度，接种量，水料比下发酵苹果皮渣，对比发酵前后苹果皮渣各基本成分及重金属元素的变化。结果表明，以干物质为基础，与未发酵苹果皮渣相比，粗蛋白含量从提高到；粗脂肪从提高到；粗纤维从降低到（表）。总氨基酸含量从提高到，其中必需氨基酸含量提高到（表）。微、；重金属元素、量元素、含量分别提高到、的含量分别为、（表）。表黑曲霉固态后发酵苹果皮渣基本成分的变化（干物质基础）（）成分干物质粗蛋白粗纤维粗脂肪粗灰分未发酵苹果皮渣发酵苹果皮渣表黑曲霉固态发酵苹果皮渣后氨基酸成分的变化（干物质基础）表黑曲霉固态发酵苹果皮渣后微量元素与重金属元素成分的变化（干物质基础）（）未发酵苹果皮渣检测项目微量元素元素重金属元素（）发酵苹果皮渣讨论接种量、水料比、发酵温度、发酵时间属于固态发酵中对微生物生长及发酵产物品质具有重要影响的几个因素渣的条件，。结果表明本研究通过响应面试验优化发酵苹果皮，在发酵时间，温度，接种量，水料比时，粗蛋白含量可达到，明显高于宋鹏等（）、李宏涛等（达到了蛋白饲料中粗蛋白高于）、高再兴等（）报道的粗蛋白含量的标准，由于本试验采用的黑曲霉具有高效利用苹果渣中残余。这是营养物质，降解纤维素合成自身蛋白质的能力。此外，本试验还发现，苹果皮渣经黑曲霉发酵后粗蛋白含量提高；原有氨基酸的组成比例与含量发生了显著变化，必需氨基酸含量大幅度增加，尤其对动物生长有重要作用的赖氨酸、蛋氨酸的含量分别提高到、胃蛋白酶与胃酸的分泌。有研究表明，提高胃液分泌功效，赖氨酸可以刺激，起到增进食欲、促进动物生长与发育的作用；此外，赖氨酸还能提高钙的吸收及其在动物体内的积累，加速骨骼生长；在动物日粮中加入适量赖氨酸可以显著改善动物胴体品质，增加家禽胸肌产量，同时还可以显著提高饲粮转化率，降低料肉比，减少养殖成本硫必需氨基酸，与生物体内各种含硫化合物的代谢密。蛋氨酸是含切相关，蛋氨酸提供的甲基可参与动物体内多种物质的合成，如肾上腺素、胆碱、肌酸等。日粮中缺乏蛋氨酸，会引起动物食欲减退、生长减缓，适量添加蛋氨酸可以提高饲料中其他氨基酸的利用率。在皮毛动物饲料中添加适量蛋氨酸可以改善皮毛品质；在禽类动物饲料中添加适量蛋氨酸可以有效促进禽类生长发育、提高免疫力、提高饲料利用率、减少腹脂率此，苹果皮渣经过黑曲霉发酵后不仅提高了粗蛋白的。因含量而且显著改善了植物性饲料原料中赖氨酸、蛋氨酸含量普遍偏低的问题，进一步提高了发酵后苹果皮渣蛋白饲料的营养价值。本试验结果还表明，当苹果皮渣发酵时间超过后，黑曲霉产生大量黑色孢子，产物感官质量下降严重。因而，在今后的研究中可以进一步探讨抑制黑曲霉产孢子的方法，以提高产物的可接受度。此外，将黑曲霉发酵苹果皮渣所得菌体蛋白饲料应用于动物养殖中，探究其对动物生长发育产生的影响也是今后研究的重要方向。结论本试验通过响应面优化得出黑曲霉发酵苹果皮渣生产菌体蛋白饲料的最佳工艺条件为发酵时间，温度，接种量，水料比。在此条件下苹果皮渣发酵后粗蛋白含量提高到，粗纤维含量降低到。苹果皮渣经发酵后必需氨基酸及微量元素、的含量均有大幅提高，重金属元素、的含量均在安全范围内。因此黑曲霉发酵后的苹果皮渣营养成分得到大幅度提高，可作为一种安全可靠的高蛋白饲料用于动物饲养中，以进一步缓解我国蛋白饲料供求矛盾的现状。参考文献赵玉山友，（）我国苹果市场新特点及年产销预测果农之刘爽析及应对策略，牛鹏飞，苏肖洁陕西农业科学我国苹果及浓缩苹果汁生产贸易变化分，（）刘芸西安苹果皮渣固态发酵高蛋白产量菌株筛选及发酵条件研究马惠玲陕西师范大学，化技术，马艳萍西北林学院学报，李晓明苹果皮渣污染根治与综合利用的体系，（），（），（）吕晓亚养因子的研究进展，贾延勇，朱启新北方园艺微生物发酵法消除植物蛋白质中抗营，（）国外畜牧学王金明，霍丽娟，（）常见植物型饲料中