肾消通络方对糖尿病肾病的防治作用及作用机制研究

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疫组织化学染色阳性为棕黄色,阴性呈无色至淡黄色,细胞核蓝色。的表达测定步骤总的提取,用匀浆器匀浆至透明状,取肾皮质组织左右,加入转移至另一离心管,室温静置离心,取上清液至另一离心管,加入氯仿,震荡混匀,室温静置离一,取上层水相至另一离心管,加入异丙醇,充分混匀,室温静置离心,离心管的底部及侧面可见在白色的小团沉淀,弃上清,加入酒精,弃上清,漂沈沉淀次。无菌工作台中,沉淀干燥,加入双蒸水处理,充分溶,稀释,使用紫外分光光度计,读取解。取和处值,/,即可使用,总浓度稀释倍数肛/,用时调整为“肛。逆转录反应取总,肛,加入反应体系管中,反应体系,等。加入双蒸水,处理至,震荡混匀,离心,仪加入矿物油,合成,逆转录酶失活,。保存备用。反应扩增引物退火温度为一上游引物下游引物扩增片段为退火温度为上游引物下游引物扩增片段为研究论文反应体系聚合酶,上样染料,稳定剂,优化剂,反应体系反应缓冲液,逆转录反应产物,上下游引物等。震荡混匀,短暂离心,仪加入少许矿物油,扩增。反应条件变性。,各自的退火温度,个循环延伸。个循环,一结果分析每个标本的扩增产物取肛,琼脂糖凝胶含核酸染料电泳,以为标准片段标记,采用紫外透射仪观察电泳结果,凝胶软件分析目的电泳条带,以电数码相机照相,泳条带为参照,待测条带与进行对比,表示相对表达水平。/、的表达测定。步骤样品处理取大约组织加提取液溶解于裂解液中匀浆提取,离心,取上清,分装保存。配制不含二硫苏糖醇的凝胶上样缓冲液/、电泳液、溴酚蓝、甘油,室温保存,用时取/按比例加入缓冲液中。取样品加上样缓冲液混匀,一保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳准备清洁的玻璃板,用甘氨酸琼脂糖将玻璃板下端封住。配制电泳分离胶。一甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶、丙、过硫酸烯酰胺、/、酰胺、,共。玻璃板间隙倒入分离胶,加水覆盖顶层,聚合、丙烯酰后,吸干水,倒入成层胶、胺、/、过硫酸胺溶液、,共,插入梳子。待成层胶凝聚后,拔出梳子。加入样本,加入电泳缓冲液,甘氨酸,。走成层胶,走分离胶。蒸馏水溶解,定容至,溶解研究论文膜转移采用水浴式电印迹。配制水浴式电印迹用缓冲液,甘氨酸,蒸馏水溶解,定容至后,加甲醇,。冷却。转移按顺序放置海绵、三层滤纸、转移膜、胶、三层滤纸、海绵。转移膜在正极,胶在负极,。免疫反应将膜置于封闭液牛血清白蛋白中静止过夜。加入封闭液稀释的第一抗体,室温缓慢摇动,用洗膜次,每次振荡后,加入封闭液稀释的第二抗体,室温缓慢摇动,。用沈膜次,每次振荡显色将膜浸入显色液/加入二氨基联苯胺,溶解后过滤,加入,室温充分显色后,立即用蒸馏水洗膜,将膜转入中观察、照相。结果分析照相分析,使用凝胶分析软件,测定各条带的平均光密度值值,待测蛋白质表达量与表达量比值,表示蛋白质的相对表达水平。统计学处理使用统计软件进行数据资料分析。数值变量以均数加减标准差元虹表示。数据采用单因素方差分析,组间比较采用检验,所有假设检验方法显著性水准以为准。结果。肾消通络方对大鼠血糖的影响见对照组血糖处于正常范围内,模型组、厄贝沙坦组、中药组血糖水平较对照组明显升高,中药组血糖水平有下降趋势,但较模型组、厄贝沙坦组之间无统计学意义胗。肾消通络方对大鼠的影响见模型组、厄贝沙坦组、中药组水平较对照组明显升高,模型组较厄贝沙坦组、中药组水平明显升高,研究论文厄贝沙坦组、中药组之间水平差异无统计学意义胗。、肾消通络方对大鼠肾功能的影响见、模型组、厄贝沙坦组、中药组、水平较对照组明显升高尸,模型组较厄贝沙坦组、中药组、水平明显升高氏,厄贝沙坦组、中药组之间、水平差异无统计学意义。、肾消通络方对大鼠肾血脂的影响见、模型组、厄贝沙坦组、中药组水平较对照组明显升高,模型组较厄贝沙坦组、中药组水平明显升高,厄贝沙坦组、中药组之间水平差异无统计学意义。各组之间水平差异无统计学意义,但中药组水平有下降趋势。肾组织病理形态学观察见、染色对照组肾小球、肾小管形体结构基本正常模型组肾脏病理改变明显,肾小球基底膜明显增厚,细胞外基质积聚,系膜细胞增生厄贝沙坦组和中药组较模型组病理改变减轻,两组间差异不明显。染色对照组肾小球形体结构基本正常,阳性物质无明显增多模型组肾脏病理改变明显,系膜区阳性物质增多,红染明显,肾小球基底膜明显增厚,细胞外基质积聚厄贝沙坦组和中药组病理改变较模型组减轻,阳性物质较模型组有所减少。电镜观察对照组肾小球基底膜结构基本正常,厚度均匀,足突结构正常,足细胞无调亡、脱落模型组肾小球基底膜广泛增厚,部分节段明显,大量足突融合和缺失,部分足细胞丢失厄贝沙坦组和中药组病理改变较模型组减轻,肾小球基底膜增厚不明显,足突融合较少。肾消通络方对大鼠肾脏、表达的影响见、对照组、在肾小球,肾小管处均有少量表达模型组、厄贝沙坦组、中药组、一的表达水平较对照组明显升高,模型组在肾小球内可见、一大量表达,在内皮细胞、系膜细胞处均呈现表达增高,在细胞外基质也有散在阳性表达厄贝沙坦组和中药组、。的表达水平较模型组有所降低,部分肾小球出现表达增高,整体水平较模型组呈现下调,厄贝沙坦组和中药组之间差异不明显。肾消通络方对大鼠肾脏表达的影响见、研究论文】水平较对照组明显升高模型组、厄贝沙坦组、中药组一水平明显升高,模型组较厄贝沙坦组、中药组水平差异无统计学意,厄贝沙坦组、中药组之间义。肾消通络方对大鼠肾脏/、表达的、影响见、模型组/水平较对照组、厄贝沙坦组、中药组明显升高,对照组、厄贝沙坦组、中药组之间/水平差异无统计学意义护。厄贝沙坦组、中药组水平较对照组、模型组明显升高尸,中药组水平较厄贝沙坦组明显升高,对照组、模型组之间水平差异无统计学意义。模型组、厄贝沙坦组、中药组、水平较对照组明显升高,模型组、中药组、水平较厄贝沙坦组明显升高尸,模型组、水平较中药组明显升高。研究论文附图/。厂。弱巧加/厂研究论文/研究论文/研究论文衄、析一/研究论文研究论文。、譬嚣蓥。研究论文蘧函组灞溺弱唆麟遴,。、父,惑、。磅。巴。二。,二篱簧七主曼挈,鬻冬每爻。母挈一棒。二。,一,一,二。基名套扛/一,蠢毋。乙阜蠕一、于警,、,、,。/,曦,。摹。,。气每/、穸紫、,如,每臻一一一。奄,。气一一。蕞茹一研究论文一“”叫礴囊蛰毫幽一一吣、一蛳。一,二一一/,研究论文附表如妇尸妇研究论文氏姆氏元妇研究论文丈妇尸/妇如/欠研究论文虹火尸元如尸研究论文讨论立题依据是的并发症之一,属微血管病变,是导致终末期肾病的主要原因,是患者致死、致残的重要原因。我国的患病率呈明显上升趋势,的发生也在增加,患者高血压、总胆固醇升高、白蛋白降低都是的危险因素【】。的临床表现为蛋白尿,高血压,水肿,渐进性肾功能损害,最后发展为。】早期的特点是肾小球滤过率增加、肾小球和肾小管肥大、肾脏增大,出现尿微量白蛋白增加,随进展,蛋白尿增加,肾小球滤过率下降,肾小球和肾小管基底膜增厚,系膜细胞增生,细胞外基质增加,最后到达,出现肾小球硬化。如何有效的预防、治疗,延缓的发展,保护肾功能,提高患者生存质量,是医学界共同关注的问题。的发病机理尚未完全阐明,其发生和发展与多种因素相关。多种细胞因子参与的发生和发展,并且相互之间构成了复杂的网络关系。是复杂细胞因子网络中的核心因子,/信号通路在介导细胞外基质代谢异常,促进发病中起着重要的作用。、与一之间形成复杂的相互作用,共同参与的发病和发展。祖国传统医学】在的临床治疗中有着较好疗效和特色优势,有减少蛋白尿、保护肾功能等作用,可延缓的进展,还可以改善和提高患者生存质量,的中西医结合治疗【效果较好,值得临床推广应用。川肾消通络方”是在赵玉庸教授多年经验方“肾络通”基础【】上优化而来,有着较好临床疗效,临床证实肾消通络方具有减少蛋白尿、改善肾功能、延缓肾脏进展等作用,为进一步探讨其作用机制,进行了此项研究,期望为中医防治提供实验依据。动物模型的复制实验性动物模型有多种类型,采用化学药物诱导的模型较为广泛。常用的有链脲佐菌素和四氧嘧啶。制备动物模型的成模率高,死亡率低,损伤较轻。的主要作用方式是可以选择性的破坏胰岛细胞,造成胰岛素分泌低下,此外还可通过淋巴细胞介导的自身免疫作用使细胞不断破坏。本实验选择采用大鼠研究论文腹腔注射方法,成功诱导模型。在实验期间,造模动物血糖水平显著升高,模型组动物出现尿微量白蛋白增高,肾功能下降,肾脏出现病理改变。的中医理论认识祖国传统医学没有的名称,依据中医理论辩证论治的思想,的临床表现,可以参考中医消渴病相关文献,可归属与消渴病相关的“水肿”、“肾消”、“尿浊”、“关格”等范畴,多数学者认为为“本虚标实”之证【】【,“本虚”以气虚证、阴虚证为主,“标实常以痰湿、血瘀贯穿疾病的整个发展过程。随着中医络病学的发展,的从络论治【】己成趋势,课题组基于赵玉庸教授“肾络瘀阻”病机学说,形成了从络论治的病机理论的发生是消渴病久病不愈,热伤气阴【,热结、气滞、痰湿、瘀血相互胶结,混处络脉,肾络瘀阻,在肾之络脉形成“微型疲瘕”【,致。肾体受损,肾用失司,发生。方药解析肾消通络方是基于“热伤气阴,肾络瘀阻”基本病机,以“益气养阴,化瘀通络”为治法组方而成。方中黄芪益气健脾,利水消肿,元参下养肾阴兼清上焦之热,黄连、地锦草清热泻火解毒,金雀根破血活血,丹参血活血,化瘀通络,鬼箭羽软坚散结,红曲可药食两用,健脾化痰,活血化瘀,方中虫类药有多种,蝉蜕、地龙、乌梢蛇化瘀通络。肾消通络方对大鼠血生化和肾功能的作用肾消通络方对大鼠血糖的影玎向时高血糖状态是的重要始动因素。实验期间对照组血糖稳定在正常范围内【,模型组,厄贝沙坦组,中药组大鼠血糖水平持续保持在高位。实验造模期间,动物死亡较多。可能与短期血糖过高有关,实验期间,动物死亡较少,死亡时间不规律。从结果看,中药组血糖水平略有下降,但不明显,可能是因为动物模型胰岛细胞损伤过于严重,非降糖药物难以恢复正常血糖。实验研究发现,降压药物【】【厄贝沙坦对具有保护作用,但其对血糖无显著影响。本实验结果同样显示,厄贝沙坦对血糖无显著影响。肾消通络方对大鼠的影响指尿中排出量超出正常上限,但尚未达临床蛋白尿水平的中研究论文间阶段。是诱发肾小球微血管病变最早期的客观指标之一,对的早期诊断有重要意义。患者出现尿时,在病理组织学上可看到系膜的扩张或有少数结节性病变,在分期上属于早期,及时进行治疗和控制血糖水平,此期肾损伤是可逆的。实验结果显示,模型组大鼠的水平显著升高,说明实验模型的复制成功。与模型组相比,肾消通络方可显著降低大鼠的水平,厄贝沙坦同样具有一定的作用。肾消通络方对大鼠肾功能的影响、是临床上判定肾功能常用的指标。实验结果显示模型组,厄贝沙坦组、中药组大鼠、水平较对照组均有不同程度升高,对照组的肾功能正常【,说明发生和发展时对肾功能产生损害。肾消通络方可明显降低、水平,改善肾功能。肾消通络方对大鼠血脂的影响、是常用的血脂指标,高糖高脂环境是发病的重要因素。本实验选用普通饲料喂养,实验动物血脂略有变化。所有实验动物水平未出现明显升高,属正常水平。模型组大鼠水平出现明显升高,略超出正常水平厄贝沙坦组和中药组水平较对照组略有升高,但仍属正常范围。实验结果提示随着时间延长,脂代谢出现紊乱,血脂有升高趋势,肾消通络方具有一定的降脂作用,改善血液环境。肾消通络方对大鼠肾组织形态学的影响的病理改变主要是肾小球和肾小管肥大、肾脏增大,随进展出现肾小球和肾小管基底膜增厚,系膜细胞增生,细胞外基质增加,最终导致肾脏纤维化,出现肾小球硬化。本实验结果,染色对照组肾小球、肾小管形体结构基本正常模型组肾脏病理改变明显,肾小球基底膜明显增厚,细胞外基质积聚,系膜细胞增生厄贝沙坦组和中药组较模型组病理改变减轻,两组间差异不明显。染色对照组肾小球形体结构基本正常,阳性物质无明显增多模型组肾脏病理改变明显,系膜区阳性物质增多,红染明显,肾小球基底膜明显增厚,细胞外基质积聚厄贝沙坦组和中药组病理改变较模型组减轻,阳性物质较模型组有所减少。电镜观察对照组。肾小球基底膜结构基本正常,厚度均匀,足突结构正常,足细胞无调亡、脱落模型组肾小球基底膜广泛增厚,部分节段研究论文明显,大量足突融合和缺失,部分足细胞丢失厄贝沙坦组和中药组病理改变较模型组减轻,肾小球基底膜增厚不明显,足突融合较少。实验结果显示肾消通络能够减轻肾脏病理损害,保护肾脏的基本形态结构。肾消通络方对作用机制的分析肾消通络方对及一的影响是发病过程中的重要细胞因子,是目前公认的致纤维化的细胞因子,在的发生和发展的起到重要作用。共有五种类型,在哺乳动物中只有、,在肾脏中主要表达。肾小球系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞、间质成纤维细胞均能表达并合成。正常情况下,以无活性的前体形式存在。高血糖、,参与的整个病理过程,其是的重要致病介质【、机制之一是可使转为有活性的成分,而且可以促进】能诱导系膜细胞及一的表达。者处于高糖状态下,高糖表达,含量增高,导致细胞外基质过度积聚,同时,增加系膜细胞对葡萄糖的可诱导系膜细胞表达摄取,葡萄糖的摄取增加又促使表达,两者之间形成恶性循环,使病变过程大大加快。在介导细胞外基质代谢异常,促进发病中起着重要的作用。在生理情况下【】,细胞外基质的形成和降解维持在一个动态平衡的水平,发生和发展中多种因素导致细胞外基质的合成和降解失衡,最终导致肾小球硬化。可通过白分泌与旁分泌途径,促进细胞外基质积聚,其作用途径包括促进细胞外基质成分合成,如型胶原、促进蛋白酶抑制因子的表达,如纤溶酶原激活物抑制因子、金属蛋白酶组织抑制因子,抑制组织细胞蛋白水解酶信使的表达等。在多种的模型中,如诱导的大鼠、自发性大鼠、自发性小鼠的肾脏,及表达均明显升高,同时伴有肾脏肥大和细胞外基质增多。患者的首要治疗是降低血糖水平,血糖水平对的发生和发展【有重要意义,降糖药物【】可减少一在肾小球和肾小管的表达,减轻肾脏病理改变临床显示患者尿一水平与血压控制有一定关系,降压可使尿减少,这表明肾脏表达水平的下调,研究论文对的表达抑制是降压药物发挥防治作用的重要途径。和患者的血液环境对肾脏有重要影响,高糖高脂可加速的发展,降低血脂水平同样可对的表达产生抑制作用,他汀类药物【可降低患者血清水平,在的治疗中可以延缓其进展,改善肾功能。及表达明显升高本实验结果显示模型组大鼠,其含量与肾脏病理损伤程度明显相关,表明参与了的发生和进展。肾消通络方可显著降低及表达明显升高,提示可能是肾消通络方的重要作用靶点,进而减轻肾脏病理损伤程度,保护肾功能。肾消通络方对/信号通路影响介导的信号转导是多信号转到,目前认为,/途径是其主要的作用途径。大多数细胞都存在受体【,主要有、型,、型受体胞质内有丝苏氨酸激酶活性,是信号转到通路必须的受体。家族蛋白是参与一在细胞内信号传导的一族蛋白质。家族蛋白分为类受体激活型,包括、共同通路型,抑制型,包括、。参与一信号传导的蛋白主要包括、。与受体结合后可使、磷酸化激活,激活后的、与形成复合物进入细胞核,作用于目标基因,完成对基因的调控可与一的型受体结合,但不能被活化,从而阻断、的激活及后续作用。在正常生理条件下,/信号通路被负性调节严格控制,除可在受体段起抑制作用,核转录共抑制因子也参与负性调节机制,、刚、等可与/、/、/复合体结合,抑制信号激活基因转录。对/信号通路的负性调节减弱,可能是/信号通路在的作用机制之一。研究发现【,大鼠肾组织的表达显著增加,的表达减少经胰岛素控制血糖后,的表达减少,显著上调,大鼠肾纤维化病变明显改善。研究显示】在的发生和发展中,出现蛋白减少,使用抗抗体、反义寡核苷酸或基因敲除,可以预防或逆转状态小鼠肾脏纤维研究论文化。在中药组方对的治疗,/信号通路是重要作用机制之一。实验【】【】表明中药可通过影响/信号通路,下调、/,上调的表达,减轻的肾脏的病理改变。本实验结果显示模型组大鼠/表达水平明显升高,表达水平较低,表明/信号通路是发生的关键机制。肾消通络方可抑制及的表达,同时可降低/表达/信号通路的干预可能水平,提高表达水平,提示对是肾消通络方