中国汉族人银屑病外显子测序发现3个新的易感位点

安徽医科大学博士学位论文分类号UDCR75863R3945密级编号学位论文中国汉族人银屑病外显子测序发现3个新的易感位点THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATION博士研究生盛宇俊指导教师姓名张学军教授安徽医科大学皮肤病研究所杨森教授安徽医科大学皮肤病研究所申请学位级别提交论文日期博士2013年12月专业名称论文答辩日期皮肤病与性病学2013年12月学位授予单位和日期安徽医科大学答辩委员会主席教授评阅人教授2013年12月安徽医科大学博士学位论文安徽医科大学博士学位论文论文题目中国汉族人银屑病外显子测序发现3个新的易感位点THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATION作者姓名指导教师学科专业研究方向工作时间盛宇俊张学军教授杨森教授皮肤病与性病学遗传性皮肤病2011年03月至2013年10月资助本课题的基金项目973计划前期研究专项（2011CB512103）973计划前期研究专项（2012CB722404）国家自然科学基金面上项目（81072461）国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（81222022）安徽医科大学博士学位论文学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名日期学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名日期导师签名日期安徽医科大学博士学位论文目录英文缩略词表1中文摘要4英文摘要7正文111引言1111研究背景1112本课题的研究设计方案172实验材料与方法1921研究对象1922实验试剂1923研究仪器2124电子数据库和分析软件2325DNA提取与标化2726全基因组外显子测序和靶向测序3127SEQUENOMMASSARRAY系统基因分型3928数据分析503结果5231全基因组外显子测序阶段5332靶向测序阶段6333已知免疫疾病相关候选基因的非同义风险SNVS6634既往报道的易感基因非同义SNVS验证情况7435错义风险SNVS和既往GWAS报道的SNPS的条件回归分析和单体型分析7636已知免疫疾病相关基因以外的非同义风险SNVS7837对罕见非同义变异的GENEBASED关联分析7838全基因组外显子测序和靶向测序对非编码区域易感基因发现情况8039基因分型验证试验结果83安徽医科大学博士学位论文4讨论865结论97参考文献98附录109个人简历109个人技能109在读期间获奖励情况109参与基金项目109参加学术会议109在读期间发表文章110致谢114课题综述115银屑病易感基因研究进展115参考文献134安徽医科大学博士学位论文英文缩略词表英文缩写CARD14CDCD27CDSCHBCHD4CIDHSDNAEDTAERAP1FIGFUT2GDNAGJB2GWASHAPMAPHGPHLAHWEIIBDIFIH1IKZF3IL英文全名CASPASERECRUITMENTDOMAINFAMILY,MEMBER14CROHNSDISEASECD27MOLECULECODINGSEQUENCECHINESEHANINBEIJINGCHROMODOMAINHELICASEDNABINDINGPROTEIN4CONFIDENCEINTERVALDEOXYRIBONUCLEASEIHYPERSENSITIVESITESDEOXYRIBONUCLEICACIDETHYLENEDIAMINETETRAACETATEENDOPLASMICRETICULUMAMINOPEPTIDASE1FIGUREFUCOSYLTRANSFERASE2GENOMICDNAGAPJUNCTIONPROTEIN,BETA2GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDYHUMANHAPLOTYPEMAPHUMANGENOMEPROJECTHUMANLEUKOCYTEANTIGENHARDYWEINBERGEQUILIBRIUMCODINGINDELINFLAMMATORYBOWELDISEASEINTERFERONINDUCEDWITHHELICASECDOMAIN1IKAROSFAMILYZINCFINGER3INTERLEUKIN1中文全名半胱天冬酶募集结构域家族成员14克罗恩病CD27分子编码序列中国北京汉族人染色质解旋酶DNA结合蛋白4可信区间脱氧核糖核酸酶1超敏感位点脱氧核糖核酸乙二胺四乙酸内质网氨肽酶1图岩藻糖基转移酶2基因组DNA缝隙连接蛋白2全基因组关联分析研究人类单体型图人类基因组计划人类白细胞抗原遗传平衡编码区插入/缺失炎症性肠病干扰素诱导与解旋酶C结构域1IKAROS家族锌指蛋白3白介素安徽医科大学博士学位论文LAG3LCE3DLDLODMAFMHCNCBINFKB1NFBNGSNNLYMPHOCYTEACTIVATIONGENE3LATECORNIFIEDENVELOPE3DLINKAGEDISEQUILIBRIUMLOGODDSMINORALLELEFREQUENCYMAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXNATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATIONNUCLEARFACTOROFKAPPALIGHTPOLYPEPTIDEGENEENHANCERINBCELLS1NUCLEARFACTORBINDINGNEXTGENERATIONSEQUENCINGNORMALSKINFROMCONTROLS淋巴细胞活化基因3晚期角质化包膜3D连锁不平衡优势对数最小等位基因频率主要组织相容性复合体美国国立生物技术信息中心B细胞轻链多肽基因增强核因子1核转录因子B二代测序对照的正常皮肤NOD2NUCLEOTIDEBINDINGCONTAINING2OLIGOMERIZATIONDOMAIN寡聚核苷酸结合域2NSODOMIMORPCAPCRPNPPQCQQPLOTRARNARNF114RPMNONSYSNONYMOUSOPTICALDELNSITYONLINEMENDELIANINHERITANCEINMANODDSRATIOPRINCIPALCOMPONENTSANALYSISPOLYMERASECHAINREACTIONUNINVOLVEDSKINFROMCASESINVOLVEDSKINFROMCASESQUALITYCONTROLQUANTILEQUANTILEPLOTSRHEUMATOIDARTHRITISRIBONUCLEICACIDRINGFINGERPROTEIN114REVOLUTIONSPERMINUTE2非同义光密度人类在线孟德尔遗传优势比主成份分析聚合酶链反应患者的未受累皮肤患者的受累皮肤质量控制QQ图风湿性关节炎核糖核酸环指蛋白114每分钟转速安徽医科大学博士学位论文SAPSLESNPSNVSST1DTABTARBP1TI/TVTRSHRIMPALKALINEPHOSPHATASESYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMSINGLENUCLEOTIDEVARIANTSSPLICEACCEPTORANDDONORSITETYPE1DIABETESTABLETARHIV1RNABINDINGPROTEIN1TRANSITION/TRANSVERSIONTARGETREGION虾碱酶系统性红斑狼疮单核苷酸多态性单核苷酸变异剪切位点1型糖尿病表TAR（HIV1）RNA结合蛋白1转换/颠换目标区域TRAF3IP2TRAF3INTERACTINGPROTEIN2TRAF3交互蛋白2TYK2UCSCUTRZNF816ATYROSINEKINASE2UNIVERSITYOFCALIFORNIASANTACRUZUNTRANSLATIONREGIONZINCFINGERPROTEIN816A3酪氨酸激酶加州大学圣克鲁兹分校非翻译区锌指蛋白816A安徽医科大学博士学位论文中国汉族人银屑病外显子测序发现3个新的易感位点博士研究生盛宇俊研究生导师张学军教授杨森教授中文摘要研究背景银屑病是一种慢性的多因素的皮肤疾病，该病以界限清楚的红色斑块附着银色的鳞片为特征。目前该病的病因及发病机制尚不清楚，炎症介质的异常产生在银屑病发病中发挥重要作用。多数学者认为银屑病的发生是遗传与环境相互作用的结果，其中遗传因素在银屑病的发病中起到重要作用，并且该病是由多个易感基因共同参与的复杂性疾病。银屑病的患病率在世界各地差异较大，与种族、地理位置、环境等因素有关。总体上，高加索人群的患病率约为23，而日本人的患病率较低且绝大多数银屑病患者为散发。我国银屑病的患病率约为0123，总患病人数接近1,000万例，分布趋势表现为男性患病率高于女性，北方高于南方，城市高于农村。国内1043例寻常型银屑病患者及其家族成员的遗传流行病学调查，发现一、二级亲属的发病率明显高于一般人群，一、二级亲属的遗传度分别为6704和4659，且随亲缘系数的增加呈现降低的趋势。随着遗传学研究技术的发展和研究方法的更新，国内外学者在银屑病遗传学领域研究方面作出了大量的工作，发现了一批有价值的疾病易感基因/区域。“定位克隆”和“定位候选克隆”的方法是研究孟德尔遗传模式疾病遗传学基础、发现疾病致病基因的主要方法。在上个世纪末，科学家们尝试着把遗传连锁分析研究的方法应用到银屑病的易感基因研究中。目前，通过连锁分析方法运用定位克隆和全基因组扫描的方法共计在全基因组范围内发现了10个银屑病易感位点1Q21、1P、3Q21、4Q、4Q31Q34、6P2133、16Q、17Q25、18P1123和19P13。随着分型技术的迅速发展和分型成本的不断降低、覆盖整个人类基因组的高通量商业化SNP检测芯片的出现和不断更新，4（安徽医科大学博士学位论文全基因组关联研究（GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDY，GWAS）得到发展。国内外研究团队通过大规模GWAS发现了超过40个银屑病易感基因或位点。然而，目前发现的风险变异大多数可能仅是标签单核苷酸多态性（SNP），这些易感基因的功能性编码变异，尤其是低频和罕见的变异在GWAS研究中被忽略，因此没有进行系统性研究。目的本研究主要是评估功能性编码变异在整个银屑病遗传度上的贡献，并试图发现银屑病的其他关联信号。方法我们在两个独立中国汉族人群（包括21,309例样本）中对功能性编码变异进行大规模测序分析研究。首先，我们对781例患者和676例对照样本的全基因组外显子测序数据进行全基因非同义单核苷酸变异（SNVS）分析，并在9,946例患者和9,906例对照的1,326个候选基因的靶向测序数据进行验证分析。对于非编码区域SNVS，我们进行深入的数据分析并在大规模测序数据的基础上对22个提示SNVS在另外一个独立中国汉族人群（4,480例患者和6,521例对照）中进行验证实验，以发现银屑病的其他关联信号。结果对于非同义SNVS，我们发现6个常见和低频SNVS在两个独立的测序样本（全基因组外显子测序和靶向测序）中关联性一致，并在联合分析中达到全基因组显著水平，包括IL23R基因上的CHR167421184（CG530A）（PEXOMETARGET1941011，OR072）、GJB2基因上的RS72474224（CG324A）（PEXOMETARGET7461011，OR134）、LCE3D基因上的RS512208（CC185A）（PEXOMETARGET2921023，OR124）、ERAP1基因上的RS27044（CC2535G）PEXOMETARGET2161014，OR086）和RS26653（CG727C）PEXOMETARGET5271012，OR087）以及ZNF816A基因上的RS12459008（CT590A）（PEXOMETARGET225109，OR088）。在FUT2基因上，我们发现一个常见错义变异RS1047781（CA418T）（PEXOMETARGET278106，OR110）和两个罕见错义变异（CHR1953898296/CC271T和CHR1953898541/CC516G）（PEXOMETARGET551105，OR361和PEXOMETARGET292103,OR692）具有提示相关性。对于非编码SNVS，我们验证了既往报道的4个银屑病易感基因，包括IL12B（RS2288831，PEXOMETARGET2301020，OR083）、IFIH1（RS13431841，PEXOMETARGET2961009，5安徽医科大学博士学位论文OR083）、ERAP1（RS27043，PEXOMETARGET6501012，OR087）和RNF114（RS4647954，PCOMBINED2411007，OR109），并发现了3个新的易感位点达到全基因组显著水平，包括NFKB1（RS1020760，PEXOMETARGET2191008，OR112；RS1609798，PEXOMETARGET9871008，OR112），12P133（RS758739，PCOMBINED4081008，OR091；RS2243750，PCOMBINED4381008，OR091）和17Q12（RS10852936，PCOMBINED1961008，OR110；RS12936231，PCOMBINED5021008，OR110）。此外，我们还发现了两个位点具有提示意义，分别是3P2131（RS1863837，PCOMBINED3911007，OR090）和17Q25（RS3744017，PCOMBINED5831007，OR112）。结论本研究结果提示编码区变异，至少是低频或者罕见非同变异对银屑病的整体遗传度贡献非常有限，此外，本研究增加了银屑病确定的风险位点数量。关键词银屑病/单核苷酸变异/外显子测序/易感基因/遗传学6安徽医科大学博士学位论文THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATIONDRCANDIDATEYUJUNSHENGADVISORSPROFESSORXUEJUNZHANGHOWEVER,MOSTOFTHEIDENTIFIEDRISKVARIANTSAREEXPECTEDTOBETAGGINGSNPS,ANDTHEFUNCTIONALCODINGVARIANTSOFTHESESUSCEPTIBILITYGENES,PARTICULARLYTHOSETHATAREOFLOWFREQUENCYANDRARE,ARELARGELYREFRACTORYTOTHEINTERROGATIONBYGWASANDHAVETHEREFORENOTBEENSYSTEMATICALLYINVESTIGATEDOBJECTIVETHISSTUDYAIMEDTOINVESTIGATETHECONTRIBUTIONOFFUNCTIONALCODINGVARIANTSANDNONCODINGVARIANTSTOTHEGENETICSUSCEPTIBILITYOFPSORIASISANDIDENTIFIYADDITIONALASSOCIATIONWITHTHEDISEASEMETHODWECARRIEDOUTALARGESCALESEQUENCINGANALYSISOFFUNCTIONALCODINGVARIANTSINTWOINDEPENDENTSAMPLESCOMPRISING21,309INDIVIDUALSOFCHINESEHANFIRST,WEANALYZEDWHOLEGENOMENONSYNONYMOUSSINGLENUCLEOTIDEVARIANTSSNVSBYEXOMESEQUENCINGIN781CASESAND676CONTROLS,ANDFOLLOWINGVALIDATIONON1,326CANDIDATEGENESBYTARGETEDSEQUENCINGIN9,946CASESAND9,906CONTROLSOFCHINESEPOPULATIONFORTHENONCODINGSNVS,WEPERFORMEDINDEPTHDATAANALYSISANDAREPLICATIONSTUDYFOR22SNVSINANINDEPENDENTCOHORTOFCHINESEHANCONSISTINGOF4,480CASESAND8安徽医科大学博士学位论文6,521CONTROLSBASEDONTHELARGESCALESEQUENCINGDATA10,727CASESAND10,582CONTROLSTOFINDADDITIONALASSOCIATIONWITHTHEDISEASERESULTFORTHENONSYNONYMOUSSNVS,WEDISCOVERED6COMMONANDLOWFREQUENCYMISSENSESNVSTHATSHOWEDCONSISTENTASSOCIATIONINTHETWOINDEPENDENTSAMPLESOFEXOMEANDTARGETEDSEQUENCINGANALYSESANDACHIEVEDGENOMEWIDESIGNIFICANCEINCOMBINEDANALYSISCHR167421184CG530AATIL23RPEXOMETARGET1941011,OR072,RS72474224CG324AATGJB2PEXOMETARGET7461011,OR134,RS512208CC185AATLCE3DPEXOMETARGET2921023,OR124,RS27044CC2535GANDRS26653CG727CATERAP1PEXOMETARGET2161014,OR086ANDPEXOMETARGET5271012,OR087,ANDRS12459008CT590AATZNF816APEXOMETARGET225109,OR088ONECOMMONMISSENSESNVRS1047781CA418TANDTWORAREMISSENSESNVSCHR1953898296/CC271TANDCHR1953898541/CC516GINFUT2WEREALSOIDENTIFIEDWITHSUGGESTIVEASSOCIATIONEVIDENCEPEXOMETARGET278106,OR110,PEXOMETARGET551105,OR361ANDPEXOMETARGET292103,OR692,RESPECTIVELYFORTHENONCODINGSNVS,WECONFIRMED4PREVIOUSLYREPORTEDPSORIASISSUSCEPTIBILITYGENESIL12BRS2288831,PEXOMETARGET2301020,OR083,IFIH1RS13431841,PEXOMETARGET2961009,OR083,ERAP1RS27043,PEXOMETARGET6501012,OR087ANDRNF114RS4647954,PCOMBINED2411007,OR109,ANDIDENTIFIED3NEWSUSCEPTIBILITYLOCIEXCEEDEDTHEGENOMEWIDESIGNIFICANCETHRESHOLDNFKB1RS1020760,PEXOMETARGET2191008,OR112RS1609798,PEXOMETARGET9871008,OR112,12P133RS758739,PCOMBINED4081008,OR091RS2243750,PCOMBINED4381008,OR091AND17Q12RS10852936,PCOMBINED1961008,OR110,RS12936231,PCOMBINED5021008,OR110WEALSOIDENTIFIED2ADDITIONALLOCIEXHIBITINGSUGGESTIVEEVIDENCEOFANASSOCIATION3P2131RS1863837,PCOMBINED3911007,OR090AND17Q25RS3744017,PCOMBINED5831007,OR1129安徽医科大学博士学位论文CONCLUSIONTHERESULTSOFTHISSTUDYINDICATEDTHATCODINGVARIANTS,ATLEASTNONSYNONYMOUSONESWITHLOWANDRAREFREQUENCYMIGHTHAVELIMITEDCONTRIBUTIONTOTHEOVERALLGENETICRISKOFPSORIASISANDINCREASETHENUMBEROFCONFIRMEDPSORIASISRISKLOCIKEYWORDSPSORIASIS/SINGLENUCLEOTIDEVARIANTS/EXOMESEQUENCING/SUSCEPTIBILITYGENE/GENETICS10安徽医科大学博士学位论文正文中国汉族人银屑病外显子测序发现3个新的易感位点博士研究生盛宇俊导师张学军教授杨森教授1引言11研究背景银屑病（PSORIASIS）【OMIM177900】是一种常见的反复发作、以表皮增殖和炎症为特征的免疫相关性皮肤病，严重的影响健康和生活质量。该病属于皮肤病领域常见重大疾病，一直困扰世界各地广大患者，尚缺乏有效的治疗方法，被称为“不死的癌症”。临床上多见于青壮年，以红斑、鳞屑为主要表现，易复发、难根治，约1040的患者具有关节损伤，常伴发肿瘤、自身免疫等其他系统疾病，且多数患者终身患病。银屑病的患病率在世界各地差异较大，与种族、地理位置、环境等因素有关。总体上，高加索人群的患病率约为23，而日本人的患病率较低且绝大多数银屑病患者为散发1,2。我国银屑病的患病率约为0123，总患病人数接近1,000万例3,4，分布趋势表现为男性患病率高于女性，北方高于南方，城市高于农村。该病容易复发、难以根治、大多数患者终身患病，约40患者具有关节损伤，常伴发癌症及自身免疫等其他系统疾病，因此给患者身心带来11安徽医科大学博士学位论文极大痛苦。然而到目前为止，银屑病的发病机制尚未完全清楚，多数学者认为银屑病的发生是遗传与环境相互作用的结果，其中遗传因素在银屑病的发病中起到重要作用，并且该病是由多个易感基因共同参与的复杂性疾病5,6。家系研究表明银屑病具有明显家族聚集现象，并且银屑病表型的严重性及其病情的发展程度优先受父系的影响，从父亲遗传来的发病年龄早一些且病情要相对严重。双生子调查时发现，同卵双生中银屑病的同时发病率为3573，异卵双生中银屑病的同时发病率为12307,8，此外，同卵双胞胎银屑病患者在发病年龄、分布类型，严重程度和病程等方面极其相似，而这种相似性在异卵双胞胎患者中得不到相应体现。银屑病的遗传度约为60909，这在所有多因素遗传疾病中为数不多10，例如，克罗恩氏病的遗传度为5011，高血压的遗传度为305012和类风湿关节炎的遗传度为406013。国内1043例寻常型银屑病患者及其家族成员的遗传流行病学调查，发现一、二级亲属的发病率明显高于一般人群，一、二级亲属的遗传度分别为6704和465914，且随亲缘系数的增加呈现降低的趋势。随着遗传学研究技术的发展和研究方法的更新，国内外学者在银屑病遗传学领域研究方面作出了大量的工作，发现了一批有价值的疾病易感基因/区域。“定位克隆”和“定位候选克隆”的方法是研究孟德尔遗传模式疾病遗传学基础、发现疾病致病基因的主要方法。在上个世纪末，科学家们尝试着把遗传连锁分析研究的方法应用到银屑病的易感基因研究中。目前，通过连锁分析方法运用定位克隆和全基因组扫描的方法共计在全基因组范围内发现了10个银屑病易感位点1Q2115,16、1P17、3Q2118,19、4Q20、4Q31Q3421、6P213317,18,2126、16Q23,26、17Q2522,23,2628、18P112329和19P1325，这10个银屑病易感位点被OMIM（ONLINEMENDELIANINHERITANCEINMAN,在线人类孟德尔遗传）收录，分别命名为PSORS4、PSORS7、PSORS5、PSORS3、PSORS9、PSORS1、PSORS8、PSORS2、PSORS10和PSORS6，其中的PSORS1、PSORS2、PSORS4和PSORS5位点与银屑病的连锁在多个人群中得到了重复。12安徽医科大学博士学位论文虽然连锁分析在银屑病遗传易感位点研究中取得了较为丰硕的成果，但是对于确定诸如银屑病这种复杂疾病的真正易感基因却存在一定的局限性。首先，连锁分析所利用的微卫星标记STR信息量有限，所定位区域往往较大，很难从中寻找出真正的易感基因；其次，目前连锁分析研究发现复杂疾病易感位点只用少部分能够在其他种族和人群中得到重复验证；最后，毕竟复杂疾病发生明显家族聚集的比例较小，这些连锁的位点是否能够代表大部分散发的病例还不得而知3032。1996年，RISCH等33研究显示在常见复杂疾病的遗传学研究中关联分析较连锁分析研究有更高的效力，对于发现疾病的微效基因具有更高的效力，更适宜于研究复杂疾病背后的致病基因或位点。从此，关联研究在常见的多基因遗传模式疾病中迅速开展起来，该研究手段已成为研究复杂疾病的主导方向。在银屑病易感基因研究中关联分析研究也得到迅速发展和广泛应用。关联分析的基本原理是在一定人群中选择病例组和对照组，某个等位基因或基因型在病例出现的频率明显高于或低于健康对照，说明它与疾病有关联性。通过观察标记位点与致病基因位点间存在连锁不平衡现象，得到某一遗传标记和引起疾病基因关联的相对危险度。例如，在糖尿病患者中一个等位基因A的频率是030，而在健康对照中的频率是020。经过统计分析发现差异有显著性，可以说等位基因A与疾病存在关联性。在连锁分析研究的基础上，研究者们对易感区域进行候选基因关联分析研究确定了一批银屑病的易感基因，如SEEK134、CDSN35、RUNX136、VEGF37等。随着研究技术的发展，人们对人类基因组的认识不断加深。2003年人类基因组计划（HUMANGENOMEPROJECT,HGP）揭示了人类基因组是由30亿个碱基对和大约39,000多个编码蛋白的基因组成。随后，国际人类基因组单体型图计划（HUMANHAPLOTYPEMAP,HAPMAP）确定了人类基因组中的300多万个单核苷酸多态性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM,SNP，即平均约每1000个碱基会有一个SNP38。HGP和HAPMAP计划带来了深远影响，为世界各国的研究者提供了人类基因组的相关序列信息，研究人员可以利用这些开放的信息对多基因遗传疾病以及个体对药物和环13安徽医科大学博士学位论文境因子反应的差异进行遗传关联分析研究，把遗传多态位点和特定疾病的发病风险联系起来，寻找并发现与疾病易感性相关的基因，从而为预防、诊断和治疗疾病提供新的方法和思路。在HGP和HAPMAP计划推动下，关联分析研究获得了长足的发展，被广泛应用于复杂疾病的研究中。随着分型技术的迅速发展和分型成本的不断降低、覆盖整个人类基因组的高通量商业化SNP检测芯片的出现和不断更新，全基因组关联研究（GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDY，GWAS）得到发展。该研究是在人类全基因组的范围内根据HAPMAP计划选择标签SNPS进行基因分型，比较病例和对照间等位基因频率的差异，并分析等位基因变化对疾病发病风险的作用大小。简而言之，即从整个人类基因组的遗传变异中，筛选出与疾病性状关联的变异，再根据其在基因组中的位置和连锁不平衡推测出可能的疾病易感基因，并对这些基因和疾病的关系进行验证及相关的功能研究39。2005年科学杂志报道了全球首个复杂疾病的GWAS研究，KLEIN等40利用AFFYMETRIX100K的基因芯片对年龄相关性视网膜黄斑变性（AGERELATEDMACULARDEGENERATION,AMD）进行了GWAS研究，该研究发现一个位于CFH基因的第9号外显子上的错义变异与AMD显著相关。此后，一系列复杂疾病的GWAS研究相继发表在科学、自然、新英格兰医学杂志和自然遗传等世界顶级学术杂志上。在复杂疾病的基因组学研究中，GWAS显示出了卓越优势，人类基因组学和疾病的相关性研究进入了一个新的阶段。美国国立人类基因组研究院（NATIONALHUMANGENOMERESEARCHINSTITUTE,NHGRI）和美国国立癌症研究院（NATIONALCANCERINSTITUTE,NCI）对世界各国研究者发表的复杂疾病或性状的GWAS研究结果进行分类汇总（HTTP/WWWGENOMEGOV/26525384），并进行定期更新。如同其他复杂疾病一样，GWAS在银屑病的基因组学研究中的应用也显示出其显著优势。自2007年首次银屑病GWAS研究发表在美国人类遗传学杂志以来，目前已有15篇关于银屑病GWAS研究或GWAS相关研究在自然遗传等著名杂志上发表，发现了一大批银屑病易感基因（表1），如位于11Q224上的ETS1基因14染色体位置基因参考引文1P313IL23R46NAIRETAL1P36RUNX341TSOIETAL1P3611IL28RA43STRANGEETAL1P362SLC45A1,TNFRSF941TSOIETAL1Q213LCE3D,LCE3A4243ZHANGETALSTRANGEETAL2P15B3GNT241TSOIETAL2P161REL4443ELLINGHAUSETALSTRANGEETAL2Q242IFIH143STRANGEETAL3P24无43STRANGEETAL5Q15ERAP14345STRANGEETALSUNETAL5Q311IL1346NAIRETAL5Q331TNIP14546SUNETALNAIRETAL5Q333IL12B424846ZHANGETALCARGILLETALNAIRETALHFFMEIERET495043ALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL5Q333PTTG145SUNETAL6P2133HLAC51424652CAPONETALZHANGETALNAIRETALLIUETAL495043HFFMEIERETALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL安徽医科大学博士学位论文41、1Q213上的LCE3D和LCE3A基因42,43、2P161上的REL基因43,44、5Q15上的ERAP1基因43,45、13Q1211上的GJB2基因45、9Q3413上的TSC1基因46和10Q223上的ZMIZ1基因47等。此外还证实了既往通过定位克隆和候选基因关联分析研究发现的一些银屑病易感基因，如HLA、IL12B、IL23R和TRAF3IP2等。利用目前已发现的银屑病易感基因得出参与发病机制可能包括先天性免疫、获得性免疫和皮肤屏障功能等三个方面。表1GWAS研究及其相关研究发现的银屑病易感基因/位点TAB1PSORIASISSUSCEPTIBILITYGENES/LOCIIDENTIFIEDBYGWASSANDRELATIVESTUDIES155354KNIGHTETALFENGETAL6P2133MICB53KNIGHTETAL6P2133HLAA53KNIGHTETAL6P2133HCG953KNIGHTETAL6P2133HLAB5754FENGETAL6P2133HLAB4054FENGETAL6P253EXOC2,IRF441TSOIETAL6P253TAGAP41TSOIETAL6Q21TRAF3IP2495043HFFMEIERETALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL6Q233TNFAIP346NAIRETAL7P141ELMO141TSOIETAL8P232CSMD145SUNETAL9P12DDX5841TSOIETAL9Q31KLF441TSOIETAL9Q3413TSC146NAIRETAL10Q223ZMIZ147ELLINGHAUSETAL11Q13PRDX547ELLINGHAUSETAL11Q223ZC3H12C41TSOIETAL11Q224ETS141TSOIETAL12Q132IL23A,STAT246NAIRETAL13Q1211GJB245SUNETAL13Q133COG652LIUETAL14Q132NFKBIA,PSMA65543STUARTETALSTRANGEETAL16P112FBXL1955STUARTETAL16P133PRM3,SOCS141TSOIETAL17Q112NOS255STUARTETAL安徽医科大学博士学位论文1617Q212PTRF,STAT3,STAT5A/B41TSOIETAL17Q25CARD1441TSOIETAL18Q121POL1,STARD6,MBD241TSOIETAL18Q221SERPINB845SUNETAL19P13TYK243STRANGEETAL19P132ILF3,CARM141TSOIETAL19Q1341ZNF816A45SUNETAL20Q13ZNF3135155CAPONETALSTUARTETAL安徽医科大学博士学位论文虽然GWAS研究取得了丰硕成果，但GWAS也存在难以回避的缺陷。例如，GWAS发现的复杂疾病相关遗传变异大多位于基因的非功能区内，仅能够解释月15的疾病易感性，因此，单独用SNP为遗传标记的GWAS并不能发现疾病的全部遗传变异，尤其是很难直接发现与疾病相关的外显子区编码遗传变异（直接导致蛋白结构的改变，影响其蛋白功能）。近几年，DNA测序技术和方法不多得到创新和改良，在保证基因组测序精确度的前提下，操作程序逐步优化，测定通量急速增加，甚至达到传统SANGER测序法的数百倍至数千倍，测序成本也在不断下降。在此背景下，“新一代测序技术”（NEXTGENERATIONSEQUENCING，NGS）即全基因组外显子测序应运而生，成功实施弥补了GWAS的上述缺陷。今后通过全基因组外显子测序和靶向测序技术，使得我们有望找到银屑病相关罕见变异和少见变异，与GWAS发现银屑病常见变异形成优势互补，全面揭示银屑病的发病机制，进而为药物研发、疾病预防、诊断和治疗提供新的契机，为将来实现优化的个体化诊断、治疗奠定坚实的基础。12本课题的研究设计方案本研究拟在中国汉族人群中进行一项大样本量全基因组外显子测序研究、靶向测序研究和基因分型研究。第一阶段研究（即781例患者和676例对照的全基因组外显子测序）采用NIMBLEGEN21M探针测序捕获芯片进行每个样本的外显子DNA捕获和富集（可捕获18,654个CCDS基因9886的编码序列），并通过ILLUMINA17安徽医科大学博士学位论文HISEQ2000平台对捕获区域进行测序（平均覆盖度约为34X），经过数据处理、质量控制和统计分析后筛选出一批可能的银屑病易感SNV。第二阶段研究（即9,946例患者和9,906例对照的靶向测序）采用定制SEQCAPEZLIBRARY芯片（NIMBLEGEN）对1,326个基因（包括第一阶段单点分析发现的最为显著133个非MHC区域的SNVS和GENEBASED关联分析发现的最显著的742个基因以及与免疫疾病相关的622个基因）进行靶向捕获和富集，同样利用ILLUMINAHISEQ2000平台对捕获区域进行测序（平均覆盖度约为64X），经过数据处理、质量控制和统计分析后获得一批与银屑病易感易感性相关的SNVS和提示SNVS。第三阶段（即基因分型）在另外一个独立的中国汉族人群（包括4,480例患者和6,521例对照）中采用SEQUENOMMASSARRAY基因分型系统进行多重PCR以及基因分型，经过数据处理、质量控制和统计分析，合并三个阶段基因分型数据进行综合分析，再次筛选出与银屑病相关联的SNVS，查阅相关文献以及专业网站分析研究结果。本研究设计方案概况见图1。图1研究设计方案概况FIG1THEOVERVIEWOFSTUDYDESIGN18安徽医科大学博士学位论文2实验材料与方法21研究对象本研究中的所有银屑病和对照样本均由国内多家医院和研究中心收集而来，全基因组外显子测序研究阶段的样本包括781例患者和676例对照样本（表2），主要来自于前期GWAS样本；靶向测序研究阶段包括9,946例患者和9,906例对照样本（表2）；基因分型阶段包括4,480例患者和6,521例对照样本（表2）。所有患者和对照使用相同的样本收集标准，病例和对照的临床和人口信息通过相同的结构式问卷收集。本研究中所使用的对照样本均不患银屑病、自身免疫性疾病和系统性疾病，并且没有任何银屑病家族史（包括一、二、三级亲属）。病例组和对照组在年龄、性别和地域上相匹配。所有参与者提供书面的知情同意书。该研究经过了各家医院和研究机构的伦理委员会批准，并按照赫尔辛基宣言的条款执行。表2本研究样本总结TAB2THESUMMARYOFSAMPLESANALYZEDINTHISSTUDY全基因组外显子测序靶向测序基因分型病例对照病例对照病例对照样本量平均年龄（SD）78130921247676341212929,946351514499,906358116014,480351614806,52129201517平均发病年龄（SD）22459392702134727261344男女比例458/323407/2695,864/4,0825,361/4,6422,220/2,0603,378/3,14322实验试剂221DNA提取试剂1）基因组DNA提取试剂QIAGENDNA抽提试剂盒（250），包括FG1（细胞裂解19安徽医科大学博士学位论文缓冲液），FG2（蛋白变性缓冲液），FG3（DNA溶解缓冲液），QIAGEN蛋白酶（QIAGENPROTEASE）。2）异丙醇（ISOPROPANOL），（蚌埠化学试剂厂）。3）75乙醇（ETHANOL），（蚌埠新科电化试剂厂）。222电泳试剂1）琼脂糖（AGAROSE），（上海生工生物工程公司）。2）LAMBDADNA/ECORIHINDIII，（大连宝生物工程公司）。3）超纯水。4）TRIS碱，（上海生工生物工程公司）。5）硼酸，（上海生工生物工程公司）。6）EDTA，（上海生工生物工程公司）。7）溴酚蓝，（上海生工生物工程公司）。8）蔗糖，（上海生工生物工程公司）。9）TRIS硼酸电泳缓冲液（TBE）浓贮存液（每升），5TRIS碱54G，硼酸275G，浓度为05MOL/L的EDTA20ML（PH80）；使用液，05浓度为0045MOL/L的TRIS硼酸，浓度为0001MOL/L的EDTA。10）6加样缓冲液025溴酚蓝，40（W/V）蔗糖水溶液。11）溴化乙锭，10MG/ML贮存液，（上海生工生物工程公司）。223标准化DNA试剂FG3（DNA溶解缓冲液）。224全基因组外显子测序和靶向测序试剂1）TAQDNAPOLYMERASE（TAKARA公司）；2）AGILENTDNA1000KIT（AGILENT公司）；3）AGILENTHIGHSENSITIVITYDNAKIT（AGILENT公司）；4）AMPUREKIT（SPRIXPBEADS）（AGENCOURT公司）；5）ILLUMINAPAIREDENDGENOMICDNA（ILLUMINA公司）；20安徽医科大学博士学位论文6）SAMPLEPREPKIT（ILLUMINA公司）；7）DNTPS（TAKARA公司）；8）HERCULASEIIFUSIONDNAPOLYMERASE（STRATAGENE公司）；9）SURESELECTHUMANALLEXONKIT（AGILENT公司）；10）SURESELEETHUMANALLEXONPLUSKIT（AGILENT公司）；11）DYNABEADSMYONESTREPTAVIDINT1（INVITROGEN公司）；12）GENOMIEDNAEXTRACTIONKIT（TAKARA公司）。23研究仪器231DNA提取器材1）MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）；2）MSIMINISHAKER振荡器（马来西亚）；3）BS60型电热恒温水浴箱，（北京市医疗设备厂）；4）192型超低温冰箱（85）（日本三洋公司）；5）美菱BCD238型冰箱（中国美菱集团公司产品）；6）HAIER20冰柜（中国海尔集团公司产品）；7）0125L、0550L、50200L、2001000L移液器（EPPENDORF，GERMAN）；0510L、20200L、1001000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）；8）EDTAK2（或EDTANA4）抗凝真空管；9）15ML离心管（AXYGEN产品）；10）摇床（TY80R，国产）；11）水浴锅；12）50ML试管架；13）一次性塑胶手套。232电泳仪器1）MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）。2）TANON3500全自动数码凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。21安徽医科大学博士学位论文3）MSIMINISHAKER振荡器（马来西亚）。4）FD201稳压稳流电泳仪（北京通用分析仪器厂）。5）DYY型电泳槽（北京市六一仪器厂）。6）TN100B型托盘式扭力天平（上海第二天平仪器厂）。7）0510UL、20200UL、1001000ULTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）。8）0125UL、0550UL、50200UL、2001000UL移液器（EPPENDORF，GERMAN）。9）HAIER20冰柜（中国海尔集团公司产品）。10）15ML离心管（AXYGEN产品）。11）05ML离心管（AXYGEN产品）。12）超纯水系统（PURELAB，ENGLAND）。233测OD值仪器1）全波长紫外/可见光扫描分光光度计NANODR