【基金标书】2010CB833600-抗体-抗原分子识别的结构基础和功能研究

1 项目名称： 抗体 首席科学家： 郭亚军 中国人民解放军第二军医大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 总后勤部卫生部 上海市科委 2 一、研究内容 拟解决的关键科学问题包括： 1. 抗体研究平台的系统性 抗体分子 识别 研究的一个重要条件是建立 系统的、多层次和多角度 的抗体研究平台。目前采用生物学方法 结合原子层面的结构分析 远远不能满足研究的需要。如何建立一个 可针对多状态（静态与动态）、多层次（原子分子细胞）和多角度（量子力学、牛顿力学 和热力学） 的 系统 研 究 平台是本项目拟解决的一个关键问题。我们采用 结构生物学结合计算生物学和功能验证的策略， 建立抗体“ 虚拟 设计预测 和验证 ” 研究体系，发展和完善已建立的抗体研究生物技术平台。 2、抗体抗原特异识别的可模拟性 免疫识别和结合是发生在抗体分子与抗原分子特定位置、特定片段之间的互相匹配和吻合的过程。这种特异性相互作用是完全基于一级序列折叠后的三级结构，对应的蛋白质空间表面特征是揭示分子识别规律的基础。在已构建的抗体 台）和前期 973 所建立的技术平台 基础上，跨生物学、计算机、统计、数学等学 科，引入地理信息系统（ 的 “ 空间 信息 分析与模型分析 ”功能 ，对抗原抗体分子识别进行分析与模拟， 并结合其它子课题进行生物学试验验证。 3. 抗体抗原分子相互作用 的规律性 分子识别 必然存在着其普遍意义上的规律 ,在遗传密码之外还应该存在着“ 结构 密码 ”, 对 分子识别 规律的了解将能够大量获得特定功能的蛋白质。 抗体分子的一系列重要生物学功能均与抗体分子 特异性识别 有紧密关系，对抗体分子识别 规律的阐明，是本项目需要解决的重要关键科学问题。利用已建立的各种生物抗体库和抗体虚拟 设计 平台， 通过抗体的虚拟设计 抗体分子 的结构，预 测抗体功能，结合 生物手段和生物信息技术，解析抗体分子的 识别 规律 。 对抗体分子 识别 规律的阐明也将为其它生物大分子 识别 规律的研究奠定理论基础。 以我们已有的晶体结构明确的抗原表位为研究模型，在虚拟 设计 和生物验证的研究平台上采用从生物 虚拟 模拟 生物的策略才有可能准确、全面 地研究 抗体分子识别的规律 。 3 主要研究内容包括： 1 利用地理信息系统（ 间信息分析技术寻找抗体抗原表面结合位点识别规律 : 在生物信息大规模抗体虚拟库和抗体抗原分子识别的结构基础上，统计抗体抗原结合界面两侧的空间信息特征和特征， 建立基于空间特征的蛋白质抗原空间表位预测方法，进行抗体抗原分子识别的分子动力学模拟， 采用 地理信息系统（ 的 “ 空间 信息 分析与模型分析 ” 功能 ,发展空间比对技术，寻找抗体抗原表面结合位点识别规律 。 2 抗体抗原相互作用结构学基础 ： 综合 运用结构生物学、计算生物学、免疫学、分子生物学 和 生物化学的方法，以具有重要 生物学功能的抗原和 抗体分子 为研究目标， 构建抗原和抗体分子结构测定平台，抗原表位测定的技术平台，以及抗体生物学功能机制的分析平台 。综合运用 液核磁共振、冷冻电镜、 生物学手段测定 抗体 和抗原 分子 以及它们的复合物 的 在不同分辨率尺度上和不同测定方法基础上的 三维结构 信息，确定抗原分子上具有重要活性的功能表位，揭示抗体特异性高效识别靶标抗原的结构基础，阐明抗体发挥其生物学功能的分子机理。 3. 抗体抗原复合物的分子分布特征及功能识别基础 ： 利用近场光学显微术结合荧光量子点标记技术对单个抗原抗体在细胞表面的动态分布状态进行可视化研究及数量化分析，结合单分子力谱测量技术和原子力显微成像术对抗原抗体分子间结合，解离的动态过程给以精细探讨。进一步阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制 ，修正已建立的数学理论模型。 4 基于计算生物学的抗体分子设计及功能进化规律研究 基于分子动力学（牛顿力学）和周期性边界条件下的密度泛函理论（量子4 力学）探讨抗原 立基于结构的计算机虚拟突变技术并用于抗体分子的功能进化。利用 De 模、微观组态相互作用理论获得抗体模拟 多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗体分子功能进化规律，为新型抗体分子功能的预测提供理论依据。 5、 抗体分子 识别的功能进化 规律： 利用 现 有的 人源 体库和噬菌体抗体库 技术与分子对接矩阵模式 ， 结合 人 人单克隆抗体技术及小鼠杂交瘤技术 ，进行基于抗体表位的高通量抗体筛选 ； 收集所产生的功能性抗体分子数据，建立 充实 “ 生物抗体数据库 ” ，结合 结构生物 学 的数据和计算生物学 手段对 抗体分子识别特点进行 研究，寻找抗体分子识别和发挥 功能的规律。 利用分子生物学、细胞生物学等方法对 通过计算生物学获得 的抗体分子进行克隆和表达， 在细胞或动物模型上研究抗体分子的生物学功能，对抗体分子 识别的作用规律 进行系统研究 。5 6 二、预期目标 总体目标： 以建立 “抗体结构和功能” 的创新研究体系、寻找抗体 抗原 分子 识别 的结构基础和作用规律 为研究目标，本着 “ 突出我国优势领域、着重解决符合重大需求的关键问题、瞄准国际基础理论前沿 ” 的原则，在 上一个 973 计划项目中所 建立的生物信息学、生物大分子立体结构研究、数据挖掘技术以及抗体分子功能研究等技术平台上，建立抗体 抗原相互作用规律 研究的创新体系，探讨适用于功能性抗体分子发现的通用性规律，争取获得源头创新性研究成果，加快我国生物信息学、计算 生物学、结构生物学 和生物学的衔接和交叉，培养出一批高水平的各学科交叉型学术研究梯队。 五年预期目标 : 1建立抗体分子 识别及作用规律 的 系统 研究 平台 ，开发并丰富生物信息学和计算生物学新算法 ， 模拟抗体 抗原相互作用 进程，发现抗体分子 识别及发挥作用 的规律。 2结合与交叉利用分子生物学，免疫学，结构生物学，计算机科学等众多相关领域的基础理论和技术，通过 “ 表位预测与验证抗体分子模拟结构解析分子设计及预测生物功能验证 ” 这一流程，建立抗原和抗体相互作用研究系统。 3 基于已建立 的生物信息数据库，通过理论模拟和数理统计方 法进行抗体分子设计及功能预测 。采用 地理空间信息分析系统 和计算生物学等方法抽提推导抗体与抗原相互作用的规则或模式，从而虚拟 设计 出与抗原结合 的抗体分子结构， 推测其功能，并 用可视化手段进行 动态检测和验证 。 4对 “ 虚拟 设计 ” 所得抗体分子采用生物技术实验手段进行克隆和表达，分析抗体分子与功能性抗原表位相互作用方式，在细胞和（或）动物模型上研究抗体分子的生物学功能，对抗体分子 “ 虚拟 设计预测 体系 ” 进行系统研究，找出抗体 分子识别 的通用性规律。 5 在 录的学术期刊上发表论文 120 篇以上， 30 篇 以上 发表在相关领7 域的国际权威刊物；取得具有国际影响的原创性学术成果 4，申报发明专利20 项。 8 三、研究方案 1学术思路： 本研究以阐明 “ 抗体分 子 识别的结构基础 与 作用 规律 ” 为目标，采用 地理空间信息分析 技术平台 和扫描探针 /量子点标记技术 ，结合已拥有的抗体生物功能分析系统，组织 计算生物 学、结构生物学、功能基因组学、蛋白 质 组学和免疫学等优势力量， 开展多学科综合性研究。力图通过对抗体分子 识别机制 与 作用 规律的发现 ， 为快速寻找满足人们需要的特定功能的蛋白质（抗体）奠定理论基础。 2技术途径： 本项目基于 前 一个 973 计划项目 已建立的 抗体虚拟筛选技术平台、晶体结构解析平台和高通量抗体功能验证平台， 利用生物信息技术和 生物抗体数据 库 ，总结抗原抗体相互作用的表面 分子特征，预测参与相互作用的关键位点，进行抗体分子模拟，采用多种结构生物学手段，在不同层面和角度解析抗原抗体复合物的结构，并在此基础上，利用计算生物学的技术途径进行分子设计及预测，最后通过生物、物理、化学等综合技术手段在细胞水平和动物模型中进行功能验证 ， 寻找 适用于 功能性 抗体分子 识别和作用的 通用性规律。 3创新点与特色： 1） 在前一 个 973 计划项目研究的基础上，开创性地 建立 可针对多状态（静态与动态）、多层次（原子分子细胞）和多角度（量子力学、牛顿力学和热力学） 的 抗体结构与功能系统 研 究 平台。 2）在已 建立的“抗体生物信息库”的基础上，引入地理信息系统（ 的 “ 空间 信息 分析与模型分析 ” 功能 ，对抗原抗体分子识别结构进行分析与模拟，并对功能进行预测。 3） 采用 结构生物学并结合计算生物学以及功能验证的策略， 建立抗体 “ 虚拟 设计预测 和验证 ” 研究体系， 利用 De 模、微观组态相互作用理论获得抗体模拟 多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗体分子功能进化规律。 9 4）利用近场光学显微术结合荧光量子点标记技术对单个抗原抗体在细胞表面的动态分布状态进行可视化研究及数量化分析，结合 单分子力谱测量技术和原子力显微成像术对抗原抗体分子间结合，解离的动态过程给以精细探讨。阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制。 5）本项目可为已立项的重大基础研究项目，如免疫学、蛋白质组学、肿瘤学、干细胞 研究 和国家新药创制重大专项 等 以及其他前沿技术领域 提供有利的支持。 4可行性分析： 1) 研究目标明确： 在 前一 个 973 计划项目的支持下 已建立 的 生物信息学、生物大分子立体结构研究、数据挖掘技术以及抗体分子功能研究等技术平台 的基础上 ，建立拥有自主知识产权的抗体分子与功能研究的创新体系，找出适用于功能性抗体分子 识别 的 通用性规律，并将研究成果推广到其它的生物大分子的研究中，争取获得源头创新性研究成果，加快我国生物信息学、计算 生物学、免疫学 、蛋白质组学 和 功能基因组学的衔接和交叉，培养出一批高水平的各学科交叉型学术研究梯队。 2) 研究队伍： 本项目的科研队伍主体均为来自国家及部门重点实验室的优秀中青年专家， 团队成员包括 国家杰出青年基金 获得者、总后科技金星和新星、教育部新世纪创新人才、上海市“曙光计划”和“浦江计划”人才，还拥有教育部和上海市科技创新团队 。 项目 组在 计算生物学 、 机构生物学 、生物信息学及抗体分子 功能研究 等领域积累了丰富的 经验。 3) 五 年来在 前一 个 973 项目的支持下，在 相关研究领域取得的工作基础与积累为协作攻关奠定了基础： 建立了国际领先水平的抗体信息数据库和结构分析及大规模筛选的技术平台，尤其是利用抗原表位与抗体共结晶进行立体建模，并在此基础上利用计算机虚拟突变技术制备高亲和力功能性抗体分子。应用抗体抗原共结晶技术，在国际上首次解析了两种重要的单抗药物“ “ 晶体结构，并比较了不同抗体亲和力差异的结构学基础；阐明了“ 与 与 章分别发表于 此基础上，设计表10 达了全新结构和高效功能的抗 价抗体。文章发表于 以上成果 为功能性抗体分子的研究提供了理论基础和新的技术方法。 这些基础研究领域的突破为 本项目的 研究奠定了 坚实的 基础。 4) 国家发改委、国家科技部和 上海市科委 也相继 投入经费用于本项目相关 基础设施的建设 。 本项目的研究单位均具有优良的研究条件，并在 计算生物学 、生物信息学 、结构生物学 及抗体分子研究领域积累了丰富的工作基础。在 前一 个 973 项目的基础上，国家发改委批准建立了“ 抗体药物国家工程研究中心”，为本项目的顺利进行，提供了有力的技术及硬件设备上的支持。 通过多方面协作攻关，形成了一支各学科配置合理，组织协调得力，攻关能力较强的科研队伍，为本项目的顺利实施奠定了基础。 5、课题设置 课题 1、基于生物信息学的抗原抗体分子识别与系统模拟 预期目标： 在已经建立的生物信息大规模抗体虚拟库和已知抗原信息的基础上， 解析抗体抗原分子识别的结构基础和特征，结合计算生物学、分子动力学技术， 引进地理信息系统（ 间信息分析技术来扫描提炼抗体抗原表面结合位点识别规律，实现蛋白质 抗原的空间表位预测以及抗体结合位点模拟预测。 研究内容： 1. 抗体抗原结合界面两侧的空间信息特征统计研究 外界抗原千变万化，但是抗体在几个氨基酸上的变化就能特异性识别不同抗原，抗体识别抗原空间结构的策略 具有重要科学意义 。目前抗体 往对蛋白质表面三维空间信息特征描述不够充分，影响进一步的抗体抗原相互作用本质研究。我们将跨学科收集所有可能的空间结构描述特征，在前期抗体结合界面的统计基础上，重点开展结合位点两侧的三维界面微环境分析，包 括凸凹性，相邻性，构象性，结合片（ 化学和物理特征等，结合不同种属，不同抗原类别，与非免疫复合物相互作用界面的分析特征进行比较，得出抗原抗体界11 面三维特异性 . 2. 基于空间特征的蛋白质抗原空间表位预测方法 基于上面抗原一侧空间表位的特性，从中提取出分辨效果较好的特性，用于不连续表位的计算预测。通过生物信息学方法将特征进行量化和程序化，并与现有的各种线性表位特性，包括氨基酸倾向性、疏水性、表面可及性等化学性质结合，建立新的 B 细胞不连续抗原表位预测方法。交给其它课题验证 . 3. 抗体抗原分子识别的分子动力学模拟 与统计研究 蛋白相互作用实际上是在溶剂环境下的柔性吸引与对接，抗体抗原的识别与相互作用其实就是抗原抗体的相互接近与选择，我们将采用多轨迹的分子动力学模拟研究抗体抗原全原子的溶剂模型，通过长时间的模拟，然后通过数理统计的方法研究界面每一残基在三维空间的疏水与氢键相互作用，以及它们出现的几率，从而确定稳定抗体抗原识别的一系列关键残基。此外 我们将采用高温下的分子动力学模拟研究抗原表位与抗体的结合如何影响抗原的折叠，通过动力学与等高线图分析确定抗原折叠的时间尺度以及可能的折叠路径，从而阐明抗体与抗原分子识别的结构 动力学基础。 4. 抗原空间表位相似性搜索，以及与抗体结合界面的空间比对与模拟 免疫识别和结合是发生在抗体分子与抗原分子特定位置、特定片段之间的互相匹配和吻合的过程。这个过程中间，化学性质的匹配和结构特征的匹配起着主导作用。具有相似结构特征的抗原空间表位与相似抗体虚拟识别的可能性较大。目前没有人 做过抗原空间表位的相似性搜索分类，也没有人做过抗原空间表位与相应 抗体结合界面的空间比对。我们计划在对抗原抗体结合位点结构信息量化，引入地理信息系统（ 的 “ 空间 信息 分析与模型分析 ” 功能 ,发展空间比对方法，通过对抗原表位 空间结构特征的相似性搜索，在虚拟抗体库中进行配对筛选与亲和性改造 . 综合上述的模拟结果，找出对应识别位点附近的更多特征和规律，结合一维二维结构和其它生物特征 , 提炼抗原 5 虚拟筛选和模拟结果的实验验证 与 改进 选取一些重要的蛋白质抗原及对应抗体（例如 抗体、 抗体等 ，以及 与人类疾病密切相关的抗体 ， 如 抗体） ，通过虚拟表位预测、空间表位相似性搜索，以及结合界面的12 空间比对及虚拟配 对筛选，研究其识别和结合的结构基础，交由实验室验证，并根据实验结果进一步改进模拟方法。 经费比例： 15% 承担单位： 同济大学、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 曹志伟 学术骨干： 黄金艳、杜嘉木、朱瑞新 课题 2、抗体抗原相互作用规律的结构生物学基础 预期目标： 综合 运用结构生物学、计算生物学、免疫学、分子生物学 以及 生物化学的方法，以一些具有 重要生物学功能的抗原和抗体分子为 研究目标， 通过 研究这些特异性抗体 及其相应抗原 分子 在不同分辨率水平上的三维 结构 模型以及功能表位信息 ， 与其他分题协同合作，从多 个层次和方位揭示 抗原 构 基础 ，阐明抗体分子特别是 功能性 抗体发挥其生物学功能的分子机制 。 研究内容： （ 1） 具有重要生物学功能的抗原和 抗体分子 的原子尺度结构 研究 以一些有重要生物学功能的抗原和抗体分子作为研究对象，进行抗原、抗体以及抗体 获得晶体的基础上，解析它们的三维空间结构，分析原子尺度上抗体特异性识别抗原的结构基础。根据结构分析选择参与相互作用的潜在关键氨基酸，与第 4、 5 分题合作进行突变并对进行功能验证，从而最终锁定抗原 明抗体 分子高亲和力专一性识别对应抗原分子的分子机制以及特定功能表位的生物学功能。对于分子量不大而又难于结晶的抗原分子，用溶液核磁共振技术来测定其溶液状态下的三维结构。将所获得的结构信息作为基于计算生物学的抗体分子设计的模板，完成抗体分子的优化改造，为探讨抗体分子功能进化的规律奠定基础。同时将结构信息提供给第一分题，用于抗原 统计及抗体识别分子动力学模拟，总结抗体特异性识别抗原分子的作用 规律。 13 （ 2） 具有重要生物学功能的抗原 一些新型抗体（比如双功 能抗体、多价抗体等）和病毒中和性抗体功能的发挥不仅与其在原子尺度上的识别机制有关，更重要的是与它们在分子层面上的结合模式以及空间效应有关。通过冷冻电镜和 示这些抗体分子在整体上发挥特定生物学功能的结构基础和分子机制。结合局部原子分辨率水平的结构模型，能够得到整体复合物在多个层次上更全面的结构信息，为更详尽地揭示抗原 （ 3） 抗原抗体识别机制的动态结构研究 抗原 个动态的 过程， 涉及复杂的分子动力学和热力学的变化过程。采用表面等离子共振技术检测抗原抗体识别过程中的分子动力学变化；用等热滴定方法检测相互作用过程中的热力学效应；用溶液核磁共振技术来研究抗原（或者抗原表位肽段）在被抗体识别过程中各个氨基酸的变化情况，得到抗原 合静态晶体结构信息，阐明抗原被抗体特异性识别的分子动力学机制。与第五分题合作，通过点突变反映抗原或者抗体上各个氨基酸对于抗原抗体相互作用的分子动力学贡献和热力学贡献，从而获得更为详尽的结合参数。实验数据可以为计算生物学基础 上的分子设计和结合规律的探讨提供有价值的修正参照。 （ 4） 具有重要生物学意义的功能表位的研究 抗原上不同的表位往往代表着不同的生物学功能活性位点，对于线性表位的抗体的共结晶实验，可以采用抗原表位肽段来模拟整个抗原，而简化结晶和分析过程，因而我们还计划开展针对重要抗原分子上有重要生物学意义的抗原表位的搜索。我们将采取传统的截断体构建、噬菌体展示等免疫学方法对线性抗原表位的搜索；对于难以用传统免疫学方法鉴定的空间表位，我们计划采用生物物理学核磁共振技术，蛋白质组学氕氘交换质谱技术，与第 4 分题合作采用计算生物学分子模 拟和分子对接等新型技术，一起完成重要抗原表位的鉴定。并在此基础上设计多肽模拟抗原表位，进行抗体 原表位的生物学14 功能的研究 以及用核磁技术进行抗原在抗体结合过程中的动力学研究。结果可以与 第 1 分题进行抗原空间表位相似性数据的汇总 分析 。 （ 5） 抗原抗体结构的计算机模拟和分子对接结果的验证 第 4 分题涉及用计算生物学分子模拟和分子对接方法得到的抗原 用冷冻电镜或者小角散射等方法得到抗原 核磁共振方法来验证表位 的正确性和动态过程。 经费比例： 27% 承担单位： 中国科学院微生物研究所、第二军医大学 课题负责人： 刘一苇 学术骨干： 陈勇、李博华、马颖、周旭宇 课题 3、抗体抗原复合物的分子分布特征及功能识别基础 预期目标： 近场光学显微术结合荧光量子点标记技术对单个抗原抗体在细胞表面的动态分布状态进行可视化研究及数量化分析，结合单分子力谱测量技术和原子力显微成像术对抗原抗体分子间结合、解离的动态过程给以精细探讨。进一步阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制，建立抗体分子识别的数学理论模型。 研究内容： 取抗原抗体分子在生物膜上的超微形貌，探讨生理条件下抗体分子识别的结构特征与功能的关系； 细胞表面抗体分子的分布状态进行超高光学分辨率的荧光成像、偏振光成像，深入探讨分子分布状态的生物学功能并确定抗体分子的空间取向； 分子力谱测量技术探测单个抗原抗体分子间的作用力和15 离解力，在皮牛顿力量级上 精确量化抗原抗体间的作用力，对抗原抗体间的结合、解离过程进行实时分析， 建立抗体分子识别的 数学理论模型 ； 子调谐技术实现对单细胞表面多种抗原抗体分子高区分度的并行探测，对分子分布状态在外界条件刺激下的动态变化进行可视化研究和数量化分析，进一步阐明抗原抗体分子在不同细胞时期的作用机制。 经费比例： 14% 承担单位： 暨南大学、南开大学 课题负责人： 蔡继业 学术骨干： 陈凌懿、潘运龙、杨培慧、周立新 课题 4、基于计算生物学的抗体分子设计及功能进化规律研究 预期目标： 基于分子动力学（牛顿力学）和周期性边界条件下的密度泛函理论（量子力学）探讨抗原 立基于结构的计算机虚拟突变技术并用于抗体分子的功能进化。利用 De 模、微观组态相互作用理论获得抗体模拟 多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗体分子功能进化规律，为新型抗体分子功能的预测提供理论依据。 研究内容： 1. 通过计算生物学方法合理模拟在考虑溶剂效应下的抗原 而借助量子化学方法下的密度泛函理论及周期性边界条件的合理设定，对牛顿力学下确定的抗原表位关键位点的电子结构特征、热力学参数及振动光谱的变化进行 探讨，确定抗原表位构象及理化性质。 2. 通过模拟体内微环境，合理判定抗体与抗原作用过程中影响复合物稳定性的关键因素及影响抗原构象的关键结构域，为抗体分子 模拟设计 及功能进化提供理论依据和技术支持。 接方法获得相应的抗体模拟多肽。利用 De 模 、微观组态相互作用理论获得多肽结构，并利用分子对接、牛顿力学优化获得多肽抗原16 作用模式，在确定抗体模拟多肽生物学功能基础上，设计构建全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子。 4. 结合本项目其他分题得到的抗体结构数据及生物信息数据库，对抗原 建立计算机虚拟突变技术并用于抗体分子的功能进化。 经费比例： 16% 承担单位： 中国人民解放军军事医学科学院 课题负责人： 张毅 学术骨干： 冯健男、毛宁、吕明 课题 5、基于功能表位的高通量抗体筛选及功能研究 预期目标： 利用课题组 现 有的 大型 人源 体库和噬菌体抗体库技术与分子对接矩阵模式 ， 结合 人 人单克隆抗体技术及小鼠杂交瘤技术 ，进行确定抗体表位的高通量抗体筛选 ； 收集所产生的功能性抗体分子数据，建立 充实 “ 生物抗体数据库 ” ，结合 结构生物 学 的数据和计算生物学 手段 对 抗体分子识别特点进行 研究，寻找抗体分子 识别和发挥 功能的规律。 利用分子生物学、细胞生物学等方法对 通过计算生物学获得 的抗体分子进行克隆和表达， 在细胞或动物模型上研究抗体分子的生物学功能，对抗体分子 识别的作用规律 进行系统研究。 研究内容： 1、 利用 大型 人源 体库和噬菌体抗体库技术，结合经典的细胞融合 杂交瘤技术 ，利用亲和层析或表位芯片等方法，采用路标选择和平行筛选等策略，高通量 筛选表位特异的 单克隆抗体 ； 采集抗体分子数据，建立 并完善 “ 生物抗体数据库 ” 。 所收集的数据反馈给第一分题进行空间比对和模拟，并可为第 四分题提供计算生物学的原始序列。 2、 根据生物抗体信息库和计算生物学 得到抗体分子序列进行全基因合成、克隆和表达， 利用表面等离子共振技术 测定抗体分子的抗原结合活性，并对抗体分子的亲合力常数进行测定。 所制备的抗体为第二分题提供抗原抗体共结晶结构17 分析的原始材料，并为第四分题计算生物学和第一分题生物信息学为基础的抗原抗体相互作用规律提供印证数据。 3、 在细胞模型上 对基于计算生物学设计合成或模拟筛选获得的抗体分子进行功能活性检测， 分析它们具有的激动、中和或是抑制功能， 结合分题三抗体在生理状态下的分子识别规律，印证基于 生物信息学和计算生物学的抗体功能模拟预测。 通过动物模型对抗体的体内生物学功能进行验证，从而 对基于“抗体分子识别规律” 的 抗体结构与功能预测的 有效性和准确性进行分析。 以进一步阐明 抗体分子 识别的作用机制 。 经费比例： 28% 承担单位： 中南大学、中国人民解放军第二军医大学 课题负责人： 郭亚军 学术骨干： 戴建新、任彩萍、王皓 6、各课题间相互关系以及与项目目标之间的关系 本研究 在前一个“ 973 项目”取得的进展和建立的技术平台的基础上， 围绕抗体分子 识别 与 作用 规律这个关键 科学 问题， 组织免疫学、 结构生物学，生物信息学 ， 计算生物 学 和量子化学 等基础和前沿交叉学科的优势力量，进行系 统 的 研究。 项目 共设置 五 个课题： 课题一 “ 基于生物信息学的抗原抗体分子识别与系统模拟 ”是 在 前期 生物信息大规模抗体虚拟库和抗体抗原分子识别的结构基础上，统计抗体抗原结合界面两侧的空间信息特征和特征，建立基于空间特征的蛋白质抗原空间表位预测方法，进行抗体抗原分子识别的分子动力学模拟， 采用 地理信息系统（ 的 “ 空间 信息 分析与模型分析 ” 功能 ,发展空间比对技术，寻找抗体抗原表面结合位点识别规律 ，并对抗体分子识别的关键位点和能力进行预测 。所建立的抗原抗体数据库 ， 可在 本项目各课题组之间共享 ， 所编制的表位预测软件、空间构象模拟软件 及预测结果，可为第 5 分题构建高亲和力抗体提供有价值的线索。也可为第 4 分题的抗体分子功能进化提供生物信息学参考。 课题二“ 抗体抗原相互作用结构学基础 ” ， 在前期已经建立的 抗原和抗体分子 晶体 结构测定平台 的基础上， 综合运用 液核磁共振、冷冻电镜、 体 和抗原 分子 以及它们的复合物 的 在不同分辨率尺度上和不同测定方法基础上的 三维结构 信息，确定抗原分子上具有重要18 活性的功能表位，揭示抗体特异性高效识别靶标抗 原的结构基础， 验证课题一提出的抗体分子识别规律和关键位点。 课题三 “ 抗体抗原复合物的分子分布特征及功能识别基础 ” ，利用近场光学显微术结合荧光量子点标记技术，研究 抗体抗原复合物的分子分布特征及功能识别基础，以 阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制；在上述 结构生物学 研究的基础上，进行 课题四“ 基于计算生物学的抗体分子功能进化研究 ”， 建立基于结构的计算机虚拟突变技术并用于抗体分子的功能进化， 利用 De 模、微观组态相互作用理论获得 抗体模拟 多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗 体分子功能进化规律，为新型抗体分子功能的预测提供理论依据 ； 获得的相关靶蛋白高亲和力抗体可提供第五分题用于进一步的实验研究，同时相关的模型可提供给第一分题用于抗原表位预测模型的进一步优化，相关的抗原、抗体结构信息可以与第二分题进行理论与实验的相互叠合，进一步优化结构，确定的抗原抗体作用的微观结构信息可对接第三分题，进一步探讨其规律性。 最后通过 课题五 “ 基于功能表位的高通量抗体筛选及功能研究 ” 结合分子生物学、细胞生物学方法，对抗体分子 体内外 功能 及其 相互作用 规律进行 验证 。 收集获得的生物功能数据，结合课题 4 计算生物 学、课题 2、 3 结构生物学的信息，通过课题 1 的生物信息手段的汇总和分析，总结抗体分子识别规律。 上述 五 个课题，既相对独立，又密切关联，相互交叉为用， 结合与交叉 ， 利用分子生物学，免疫学，结构生物学，计算机科学等众多相关领域的基础理论和技术，通过 “ 表位预测与验证抗体分子模拟结构解析分子设计及预测生物功能验证 ” 这一 流程 ， 形成一个 有机整 合的 抗原和抗体相互作用研究系统。 19 20 四、年度计划 第一年研究内容： (1)利用 传染病、肿瘤和自身免疫病 患者及正常人外周血 B 淋巴细胞，分别建立人源抗体库。抗体库包括 全人全抗体细胞库和 噬菌体抗体库。同时收集 100例左右典型的 肿瘤 组织，进行组织培养，为下一步的抗体筛选提供抗原载体。 (2)利用已知结构的 病毒、毒素肿瘤 相关抗原（ E 析其抗原表位，制备抗原肽，免疫小鼠，制备出一系列识别相同抗原表位，但具有不同结构和亲和活性的抗体。 (3)对我们现有的特异性抗体 及抗原对（抗 登革热 相应抗体分子的制备 ，开始 其第一批晶体生长和条件优化工作和结构分析 ； 开展冷冻电镜样品的 制备工作 。 (4)收集项目所需要的数据，主要从结构数据库， 实验室和文献里收集已知的抗原抗体结合位点结构信息， 以及对应抗原，抗体功能等其他信息；根据收集的数据计算各种结构特征参数，选择合适的方法对特征参数进行统计分析。 (5)在金膜上修饰 原，摸索并优化针尖修饰技术将上述抗原对应的特异性抗体修饰在针尖上并测量抗原抗体间的相互作用力；对 行在体纳米尺度光学成像，研究 T 细胞上的分布情况。 (6)利用蛋白质结构数据库 及第二分题的结构，对靶蛋白（ 间构象进行理论模拟；借助第五分题获得的相应功能抗体（抗及本分题通过免疫小鼠获得的鼠源抗体（抗 通过序列分析、结构模拟获得其空间结构；利用分子对接、力学优化及动力学模拟确定抗原抗体作用的动态模式，初步判定相互识别的关键位置，并通过点突变以及缺失突变技术对确定的靶位进行实验验证。 第一年 预期 目标： (1) 制备库容达到 105的全抗体细胞库和 108的噬菌体抗体库，同时具备一定的多样性。 获得 8 种抗原的表位，并建立表位特异的特殊免疫小鼠；完 成现21 有 4 6 种抗体抗原对的功能学验证 (2) 完成 2大尺度 抗原 登革热病毒抗体）冷冻电镜样品的准备工作； (3) 完成对（抗 登革热 E 蛋白抗体等）复合物的结晶及数据收集工作； (4) 探讨抗原抗体相互识别的动态模式以及影响其相互作用的关键因素。确定四种靶抗原的表位结构特征，并通过实验进行验证。 (5) 初步完成结构信息的收集和整理，结构特征的抽提以及统计分析； (6) 制备能单层均匀覆盖金膜表面的抗原膜，初步完成针尖修饰技术的优化，得出在离体状态下 子 的抗原抗体相互作用力。得到 辅助细胞上的分布情况，分析其与 子功能的关系。 (7) 争取在 录的杂志上发表论文 15 20 篇。 其中争取 3 5 篇发表于该领域权威期刊。申请国家发明专利 4 项 。 第二年研究内容： (1)利用已建立的抗体库筛选新的 全人的抗 肿瘤 、病毒、自身免疫抗原的 特异性抗体，同时也利用同样的抗体库大规模筛选 病毒抗原相关的人源抗体。 制备其它的疾病相关抗原（ ）的抗体杂交瘤。 继续制备系列性鼠源性抗体，并对所有获取的单克隆抗体进行基因克隆，以确定其可变 区一级结构信息。 (2)在 建立一系列抗体功能检定体系 （ 包括生物学活性、亲和力、结合位点的高通量检测方法 ）的基础上，进一步验证抗 抗 抗 抗 6 抗体，抗 抗 生物学功能 。 (3)开展 第二批 5 种新抗原（ 及相应抗体分子的制备，结晶和晶体结构分析，找出相互作用的关键残基。开展抗体病毒复合物冷冻电镜结构的解析。 (4)在 T 细胞活化过程中，对其膜蛋白 行纳米尺度的近场光学成像，记录 T 细胞活化过程中分子 的分布情况。利用针尖化学技术在体测量 它们的特异性抗体之间的作用力和离解力。 22 (5)通过统计分析方法对于结构特征参数实现筛选和分类；对结构特征因子进行选择和优化，发现抗原抗体结合界面空间特征的潜在规律。设计算法提高抗原空间表位预测精度，并以文献和实验数据进行校正。 (6)利用抗原表位的宏观分析方法对靶抗原（ 感病毒 白）进行空间构象模拟，并对其功能抗体的空间构象进行理论模拟，并预测其抗原表位，进而通过分子生物学手段进行表位验证及分析。 (7)利用周期性边界条件及微 观计算方法对抗原抗体相互识别的微观结构信息进行计算、分析，结合课题二、三的实验结果对建立的微观模型进行优化，并开展针对靶抗原（ 抗体体外亲和力成熟预测，通过生物学实验进行分析、验证。 第二年 预期 目标： (1) 筛选出 20 40 种人源抗体序列，这些抗体序列均应与已知的抗原表位相结合，具有一定的生物活性。获取 50 种以上，集中针对 2抗原的鼠源抗体序列。 (2) 完成 4 6 种细胞膜表面分子与其抗体的抗体共晶和结构分析，同时 完成 2尺度 抗原 如森林脑炎病毒抗体 )，分辨率达纳米级 。 (3) 得到 子在 T 细胞活化工程中的高分辨光学图，建立并优化同时对多种抗体进行探测的技术和方法。得到 子的抗原抗体相互作用力。 (4) 靠抗原表位结构特征统计分析结果设计空间表位预测算法和软件实现； (5) 建立抗原抗体相互作用动态模式分析平台技术。确定三种靶抗原的表位构象特点，并通过实验进行验证。获得微观条件下抗原抗体相互识别的结构模式，并建立相应的预测及分析方法。 (6) 在 录的杂志上发表论文 20 25 篇 ，其中争取 4 6 篇发表于该领域权威期刊。申请国家发明专利 4 项 。 23 第三年研究内容： (1)对可能获取的新的抗病毒、抗肿瘤和抗自身免疫病抗体等具有潜在功能的抗体，进行必要的体内模型验证。完善抗体结构及功能数据库。实现抗原抗体作用位点结构数据与地理信息系统的数据对接，实现地理信息系统处理生物结构数据； (2)开展 第三批 5 种 可溶性 抗原（ 相应抗体分子的制备、结晶及数据收集 。 (3)研究细胞表面的多潜能性相关表面抗原 白血病抑制因子受体（ 和 原在胚 胎干细胞在分化过程中分布状态的变化。 (4)对课题 1 中归纳总结的抗原抗体作用界面规律，表位预测结果以及动力学模拟规律所选定的抗体相关重要氨基酸进行点突变，尝试制备 10 种以上的改良抗体，并对其功能进行验证，信息反馈给课题组课题 1 和 4，以修正其数学模式和统计规律。 (5)对课题 5 中 的 针对靶抗原（ 抗体 借助分子动力学方法及改进的分子力学力场及统一原子模型模拟抗体分子识别和结合抗原分子的动力学特征。研究不同突变位点对结构功能，识别和结合过程的影响， 通过虚拟筛选及优化获得高亲和力抗体。 第三年 预期 目标 1. 筛选 50人源抗体序列，这些抗体序列均应与已知的抗原表位相结合，具有一