临床医学检验临床免疫学与检验

第四篇 临床免疫学与检验,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫应答的过程1、识别阶段：巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原 进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞 （Thc）及相关淋巴细胞的过程。2、活化阶段：B细胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞； T细胞在接受抗原刺激和协同刺激双信号后活化、增殖、 分化为效应细胞。3、效应阶段：浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能；T细胞中 的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细 胞毒效应功能。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。（一）中枢免疫器官1、骨髓：造血干细胞（HSC）分化、发育、成熟2、胸腺：T细胞发育的重要中枢器官（二）外周免疫器官及组织1、淋巴结2、脾：最大的外周淋巴器官3、粘膜伴随的淋巴组织：如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结、阑尾淋巴细胞再循环与归巢 淋巴细胞在体内依靠归巢受体由定居地经淋巴循环及血液循环不断往返于外周免疫器官、二级淋巴组织及全身器官组织、淋巴循环汇集于胸导管，经上腔静脉进入血液循环。 血液循环中的淋巴细胞及各类免疫细胞在毛细血管后微静脉处穿越高壁内皮细胞，进入淋巴组织及淋巴器官，再次进入淋巴循环。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫细胞（一）淋巴细胞1、T细胞：胸腺依赖淋巴细胞；约占淋巴细胞的70%75%。 T细胞受体（TCR）：又称T细胞抗原受体，是T细胞特有的表面标志。T细胞识别抗原和转导信号是由TCR特异识别MHC分子递呈的抗原肽，CD3分子转导T细胞活化的第一信号。 簇分化抗原（CD）：T细胞发育不同阶段的亚群存在不同的分化抗原，这是区分T淋巴细胞的重要标志。2、B细胞：骨髓依赖性淋巴细胞，约占淋巴细胞的5%25%。主要功能：产生抗体、递呈抗原、分泌细胞因子参与免疫调节。B细胞受抗原刺激后可分化为产生抗体的浆细胞和长寿记忆细胞。3、自然杀伤细胞（NK） NK细胞无需抗原刺激，可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的细胞，因此在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。活化NK细胞可分泌IFN和TNF等细胞因子，参与免疫调节作用。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫细胞（二）免疫辅助细胞1、单核-巨噬细胞系统共同特点是表达MHC类分子及具有吞噬作用。2、树突状细胞专职抗原递呈细胞,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（一）免疫球蛋白分泌型（sIg）：主要存在于体液中，具有抗体的各种功能。膜型（mIg）：表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白，为抗原 受体。化学结构：2条重链（H）和2条轻链（L）以二硫键连接在一起。 V-可变区；C-恒定区按照体内含量的多少分为：IgG、IgA、IgM、IgD、IgEIg的轻链分为链和链，一个天然Ig分子的两条轻链相同。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（一）免疫球蛋白1、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次应答的主要抗体， 也是唯一能通过胎盘的抗体。大多数抗菌抗体、抗病毒抗 体都是IgG，某些自身抗体及超敏型抗体也是IgG，免疫 检测中第二抗体也以IgG为主。2、IgA：大部分血清型Ig为单体；分泌型sIgA为二聚体。每一个sIgA 分子含一个J链和一个分泌片。sIgA性能稳定，主要存在于 胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，是参与黏 膜局部免疫的主要抗体。3、IgM：五聚体，Ig分子中最大的，主要存在于血液。是个体发育 最早合成的抗体，也是抗原刺激后最先产生的抗体。感 染过程中IgM水平升高，说明近期感染；新生儿脐血中若 IgM增高，说明有宫内感染。4、IgD：作用不明，B细胞膜上的IgD可作为B细胞分化成熟的标志。5、IgE：单体结构，血清中最少。亲细胞抗体，介导型超敏反应， 在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（二）补体系统 补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。补体的大多数组分都是糖蛋白，多属于球蛋白。含量最高的补体：C3、C4含量最低的补体：C2 补体性质不稳定，加热56、30min可使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭活。补体的激活途径：1、经典途径：以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体 C1C9共11种成分全部参与了激活途径。2、替代途径：又称旁路途径。病原微生物等细胞壁成分提供接触面 直接激活补体C3，然后完成C5C9的激活过程。激活 物主要是细胞壁成分。3、MBL途径：由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）与病 原体结合后启动激活。补体既可参与机体的防御效应和自身稳定，亦可引起免疫损伤。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（三）细胞因子免疫细胞分泌的多肽或小分子蛋白质。通过自分泌、旁分泌、内分泌的方式发挥作用。按生物学功能分：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、 肿瘤坏死因子、集落刺激因子。细胞因子受体分：免疫球蛋白基因超家族、I型细胞因子受体家族、 型细胞因子受体家族、型细胞因子受体家族、 趋化性细胞因子受体家族。（四）黏附分子 黏附分子（CAM）是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互结合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受体-配体的结合形式发挥作用。参与机体免疫应答、炎症发生、凝血、创伤愈合和肿瘤转移等病理生理过程。（五）CD抗原 人类白细胞分化抗原（HLA）是指血细胞在分化成熟及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,一、抗原抗体反应的原理抗原抗体是一种非共价结合、不形成共价键。1、静电引力；2、范德华力；3、氢键结合力；4、疏水作用力：是这些结合力中最强的。亲和性：是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相 适应而存在的引力，它是抗原抗体间固有的引力。亲和性用平衡常数K来表示，K值越大，亲和性越强，结合越牢固。抗体是球蛋白，溶解在水中为胶体溶液，不会发生自然沉淀。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,二、抗原抗体反应的特点1、特异性；2、可逆性：亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体。3、比例性：只有当抗原抗体分子比例合适时充分结合，沉淀物形 成快而多，称为抗原抗体反应的等价带； 若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象， 抗体过量时，称为前带，抗原过量时，称为后带。4、阶段性：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快； 第二阶段为可见反应阶段，反应慢。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗体反应,三、影响抗原抗体反应的因素 抗体的浓度、特异性和亲和性都影响抗原抗体的反应。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适于沉淀反应。颗粒性抗原出现凝集反应；可溶性抗原出现沉淀反应；单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀反应。环境因素1、电解质：抗原抗体发生特异性结合后，由亲水胶体变为疏水胶体， 此过程需要电解质参加，常用0.85%NaCl。2、酸碱度：一般在pH 69之间。3、温度：一般以1540为宜。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,免疫原：指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与 抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。一、颗粒型抗原的制备各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒型抗原1、细胞抗原（如绵阳红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配置一定浓度即可。2、细菌抗原多用液体或固体培养基，经集菌后处理。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。二、可溶性抗原的制备与纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等。胃蛋白酶或胰酶处理，可获得游离的单个细胞。溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。木瓜酶将IgG裂解成2个Fab片段和1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab，）2片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,三、半抗原性免疫原的制备半抗原：某物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性。半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。载体1、蛋白质类：以牛血白蛋白最常用。2、多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。3、大分子聚合物和某些颗粒。半抗原性免疫原的鉴定一般认为至少要20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效刺激免疫动物产生抗体。因此，在半抗原与载体连接后，应测定半抗原与载体的比例。1、吸收光谱分析法2、放射性核素标记半抗原渗入法,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,免疫佐剂佐剂的种类1、化合物，如弗氏不完全佐剂2、生物制剂，经处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗； 细胞因子及热休克蛋白等。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂=弗氏不完全佐剂+卡介苗使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳剂。佐剂和抗原的比例为1:1。佐剂的作用1、改变抗原的物理性状、延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；2、刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和递呈抗原的能力；3、刺激淋巴细胞增殖和分化；4、致变抗体的产生类型和诱导迟发型超敏反应。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的制备含有抗体的血清即抗血清。抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。R型抗血清：用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比 例合适范围较宽，适于作为诊断试剂。H型抗血清：用马等大型动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例 合适范围较窄，一般作为免疫治疗。某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差。如：IgE对绵羊；胰岛素对家兔；多种酶类对山羊。,吉普塞舞神,免疫程序1、免疫原的剂量： 剂量过大或过小都有可能产生免疫耐受，在一定剂量范围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。2、免疫途径： 皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径。皮内或皮下免疫时一般采用多点注射。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射。3、免疫间隔时间 第1次与第2次免疫间隔时间以1020天为好，第3次及以后的间隔一般为710天。采血法1、颈动脉采血法2、心脏采血法3、静脉采血法,第三章 免疫原和抗血清的制备,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的鉴定1、抗体特异性的鉴定常用双向免疫扩散法，观察沉淀线。2、抗体效价的测定颗粒型抗原-凝集试验可溶性抗原-双向免疫扩散试验、ELISA等稀释方法：将经过系列稀释的血清分别与一个浓度的抗原反应；同时稀释抗原和抗血清，分别与不同浓度的抗血清进行双向免 疫扩散实验（棋盘滴定）3、抗体纯度的鉴定SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳等抗血清的保存短期保存：28；冷冻：-80-20，分为小包装，一般保存5年，避免反复冻融。真空干燥：510年,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制备,抗血清的纯化IgG类抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法。杂质的去除：1、亲和层析法 2、吸附剂法,吉普塞舞神,第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备,杂交瘤技术：利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外生长繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体。这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。小鼠骨髓瘤细胞：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺 嘧啶激酶（TK）的缺陷株肿瘤细胞合成DNA一般有两条途径：一条是生物合成的主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA，叶酸拮抗物（甲氨蝶呤）可阻断该途径；另一条是替代途径，当叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK利用核苷酸的前体合成核苷酸，进而合成DNA。因此筛选杂交瘤细胞用HAT培养液。HAT培养液：在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。细胞的选择：有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。,吉普塞舞神,第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备,单克隆抗体的特性：1、高度特异性2、高度的均一性和可重复性3、弱凝集反应和不呈现沉淀反应4、对环境敏感性局限性：单克隆抗体反应强度不如多克隆抗体基因工程抗体1、人源化抗体：减少抗体异源性，利于临床应用。嵌合抗体：从杂交瘤细胞里分离出可变区基因，与人Ig恒定区的基 因连接，表达鼠-人嵌合抗体。改型抗体：将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改成鼠 源单抗CDR序列。2、小分子抗体：可在大肠杆菌等原核细胞内表达。3、抗体融合蛋白：指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活 性蛋白融合得到的产物。4、双特异性抗体：两个抗原结合位点具有不同的特异性。5、噬菌体抗体库技术：可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒 感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,凝集反应是一个定性或半定量的检测方法，将抗体做一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。两个阶段：抗原抗体特异性结合；出现可见的颗粒聚集。直接凝集反应原理：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。抗原凝集原 抗体凝集素1、玻片凝集试验：定性分析，一般用来鉴定菌种和ABO血型测定。2、试管凝集试验：半定量，用定量抗原悬液与一系列梯度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，判断待检血清中有无相应抗体及效价。如肥达试验诊断伤寒、副伤寒； 外斐试验诊断立克次体； 输血时的交叉配血试验。,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,间接凝集反应 是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。间接凝集反应的类型1、正向间接凝集反应：可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应。2、反向间接凝集反应：特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应。3、间接凝集抑制试验：先将可溶性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）试剂混合，然后再加入抗原（抗体）致敏的载体颗粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向（或反向）间接凝集抑制试验。4、协同凝集反应：用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）做载体，它能够与IgG的Fc段结合，称为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接血凝抑制试验。可用于细菌、病毒的直接检测。间接血凝抑制试验载体常用红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒,吉普塞舞神,第五章 凝集反应,明胶凝集试验：血清中含有病毒抗体则呈肉眼可见的粉红色凝集。广泛用于HIV-1抗体和抗精子抗体等的检测。自身红细胞凝集试验 抗人O型红细胞的单克隆抗体能与任何型红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原。反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞，因此反应中的标本为受检者的全血。可用于HIV抗体，HBsAg的检测。抗球蛋白试验又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种有效方法。包括直接C试验和间接C试验，分别检测红细胞上的不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。广泛应用于血液病的检测，如自身免疫性溶血性贫血、药物诱导的贫血、新生儿溶血症等，还可采用专一特异性的抗球蛋白的血清，如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗补体血清等，分析结合于红细胞上的不完全抗体的免疫球蛋白亚类。,吉普塞舞神,第六章 沉淀反应,沉淀反应：指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时 出现的沉淀现象。沉淀反应的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。第一阶段：抗原抗体发生特异性结合，肉眼不可见，时间短。第二阶段：形成可见的免疫复合物，如沉淀线、沉淀环， 约需几十分钟到数小时。,吉普塞舞神,液体内沉淀实验 抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。1、抗原稀释法；2、抗体稀释法；3、方阵滴定法（棋盘滴定法）。免疫浊度测定本质上属于液体内沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。抗原过量：形成IC（免疫复合物）分子小，且会发生再解离，浊 度下降，这叫做高剂量钩状效应。抗体过量：IC的形成随着抗原的增加而增加，抗原抗体最适比例 处达到高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。免疫比浊法的基本原理就是在反应体系中保持抗体适当过量。抗体的选择：特异性强、效价高、亲和力强，使用R型抗体。pH6.58.5 使用磷酸盐缓冲液做反应液增浊剂：聚乙二醇（PEG）、吐温-20,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,凝胶内沉淀试验 利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶支持物：琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶等。1、单向扩散试验 在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，形成沉淀环。Mancini曲线（M曲线）：适用大分子抗原和长时间扩散（48h）结 果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。Fahey（F曲线）：适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果， 用半对数纸画线，浓度对数与扩散环直径呈线性关系。双环现象：出现两种抗原性相同成分。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,凝胶内沉淀试验2、双向扩散试验 让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。平板法是最常用的方法。抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计：抗原抗体相对分子量的估计：扩散慢者圈子小，局部浓度大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方，如果分子量大致相等，则呈直线。抗原性质的分析：两条沉淀线相互吻合，说明抗体和两个抗原的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同；沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同；两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。抗体效价的滴定：出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体效价。抗原或抗体纯度鉴定：多条沉淀线说明抗体不纯。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,免疫电泳技术1、对流免疫电泳实质是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。抗原带负电荷向正极移动；抗体在电渗作用下随水流向负极。2、火箭免疫电泳实质是加速的单向扩散试验。3、免疫电泳是区带电泳与免疫双扩散相结合的免疫分析技术。 抗原经电泳分区带，沿电泳方向挖一平行抗体槽，加入相应抗血清做双向扩散，形成弧形沉淀线。 多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。4、免疫固定电泳电泳加沉淀反应技术，可用于各种蛋白质鉴定。 先将待测样品做区带电泳，覆盖抗血清，形成抗原抗体复合物而沉淀。分辨率强，敏感性高，操作周期短，结果易于分析，目前作为常规检测。5、交叉免疫电泳将区带电泳和火箭免疫电泳相结合，可一次同时对多种抗原定量。,第六章 沉淀反应,吉普塞舞神,第七章 放射免疫分析,放射免疫分析（RIA） 是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析方法。免疫放射分析（IRMA） 是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。常用的放射性核素：125I、131I、3H、14C 放射性碘原子通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子。比较：IRMA反应速率、特异性、灵敏度和检测范围都较RIA高。应用：常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等测定。,吉普塞舞神,第八章 荧光免疫技术,常用荧光色素：1、异硫氰酸荧光素（FITC）：黄绿色荧光，最常用；2、四乙基罗丹明（RB200）：橘红色荧光；3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：橙红色荧光；4、藻红蛋白（R-RE）：橙色荧光。其他荧光物质：某些3价稀土镧系元素，其中铕（Eu3+）应用最广，其荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是一种非放射性核素免疫分析技术，用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异性荧光的干扰，极大提高了分析灵敏度。荧光偏振免疫测定：利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。常用FITC标记小分子抗原。,吉普塞舞神,第八章 荧光免疫技术,荧光酶免疫测定：利用酶标记抗原或抗体，与待检物反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。常用碱性磷酸酶ALP标记。荧光免疫技术的应用1、自身抗体检测；2、病原体检测；3、免疫病理检测；4、细胞表面抗原和受体检测。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,酶免疫技术：在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。常用酶及其底物1、辣根过氧化物酶（HRP）：由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团。底物：邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）应用广泛2、碱性磷酸酶（AP）底物：对硝基苯磷脂酸（p-NPP）3、-半乳糖苷酶（-Gal）：因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。底物：4-MUU,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,酶免疫技术：1、酶免疫测定（EIA）：用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量。2、酶免疫组织化学技术：用于组织切片或其他标本中抗原的定位。均相酶免疫测定 利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变而确定抗原或抗体的含量。异象酶免疫测定是目前应用最广泛的一类，分为液相和固相酶免疫测定两类。如ELISA。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技术,ELISA三个必要的试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体； 酶反应的底物。抗原测定：双抗体夹心法：常用。双位点一步法：针对抗原上的两个不同的抗原决定簇的两种抗体，一个用来包被，一个用来酶标记。当抗原过量时可分别结合固相抗体和酶标记抗体，出现钩状效应。竞争法：针对只有单个抗原决定簇的小分子。抗体测定：间接法：固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物。双抗原夹心法竞争法：多用于乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。捕获法：又称反向间接法，常用病原体急性感染诊断中的IgM抗体。应用：ELISA可用于病毒（甲肝、乙肝两对半等）风疹、疱疹、轮状病毒等；细菌如结核、HP等，也用于各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物等。,吉普塞舞神,第十章 化学发光免疫分析技术,直接化学发光剂：1、吖啶酯；2、三联吡啶钌酶促反应发光剂：标记酶有HRP和碱性磷酸酶； HRP催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物； AP催化的发光底物为AMPPO。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-亲和素放大技术,生物素（biotin，B）、亲和素（avidin，A）生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。生物素：可以标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸。亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物素的天然特异性结合物。1个AV和SA能结合4个生物素分子，因此具有放大效应。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-亲和素放大技术,BAS的应用1、BAB法：也称侨联亲和素-标记生物素法（BRAB），以游离的亲和素 作为侨联剂，利用亲和素的多价性，将检测体系中的抗原-生 物素化抗体复合物与标记生物素连接起来。 抗原-生物素+亲和素+生物素-标记2、ABC法：预先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，当其与反应体 系中的生物素化抗体相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位 即可与抗体上的生物素结合。 抗体-生物素+亲和素-生物素-酶标复合物3、BA法：也叫LAB法，以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗 体连接进行检测。 酶标记-亲和素+生物素-抗体BAS用于荧光抗体技术，通常用BA法，用荧光素直接标记亲和素。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫测定,以微孔膜作为固相，固相膜的特点：多孔性、高度吸附抗体或抗原、易于漂洗，可被液体穿过流出，液体也可通过毛细管作用在膜上向前移行。标记物可用酶、彩色乳胶、胶体金、胶体硒等。常用固相膜：玻璃纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和 硝酸纤维素（NC）膜，最长用NC膜免疫金标记技术：标志物在配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。免疫渗滤实验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。用以检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂也已广泛使用。结果：膜中央有清晰的淡红色或红色斑点为阳性，反之阴性。免疫层析实验（ICA）：常用胶体金，称为金免疫层析实验（GICA）与IFA的不同在于液体的移动不是直向穿流，而是基于层析作用的横流。结果：阴性为一条棕红线条带；阳性为两条，无条带为试剂失效。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫测定,斑点酶免疫吸附实验（Do-ELISA）：与ELISA不同之处在于载体为蛋白质、NC膜，没作用于底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。结果：阳性者在膜上出现肉眼可见的染色斑点，灵敏度比ELISA高。酶联免疫斑点实验（ELISPOT）：体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞。检测活细胞。结果：阳性PVDF膜出现紫色斑点。1个斑点代表一个细胞，灵敏度高。应用非常广泛：如移植中排斥反应的预测，疫苗发展、Th1/Th2分析、自身免疫性疾病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选。免疫印迹法（Western Blot）：常用多克隆抗体。,吉普塞舞神,第十三章 免疫组织化学技术,标本：1、活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交织处。2、各种体液、穿刺液：直接涂片或经离心涂片。3、培养细胞：单层细胞直接固定。固定剂：10%福尔马林制片方法1、冰冻切片：使抗原得到最大限度保存，但形态保存不佳2、石蜡切片：研究形态学的主要制片方法常用抗原暴露方法：微波法、高压锅法标本的保存：最好直接镜检，4干燥可保存1个月。 但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，需-20下保存。,吉普塞舞神,第十三章 免疫组织化学技术,酶免疫组织化学技术的优点（与荧光免疫技术相比）：可长期保存、可用普通光镜观察、可观察组织细胞的细微结构、敏感度高。1、直接法：将酶标记在特异抗体上，直接与组织内抗原反应。2、间接法：将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的组织抗原结合， 再连接二抗。应用广泛。免疫组化中常用的酶及显色底物1、HRP：底物为二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色。2、氨基乙基卡巴唑（AEC）：反应产物呈橘红色。3、4-氯-1-萘酚：产物灰蓝色。广义的亲和组织化学染色包括：抗原与抗体；植物凝集素与糖类；生物素与亲和素；SPA与IgG；阳离子与阴离子；配体与受体。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,外周血单个核细胞的分离密度梯度离心2份6%聚蔗糖蒸馏水+1份34%泛影葡胺生理盐水，比重为1.0770.002；作为淋巴细胞分离液，即Ficoll液。上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。淋巴细胞的分离利用单核细胞在37和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料等材料上的特性，从单个核细胞悬液中去除单核细胞，从而获得淋巴细胞。也可用Percoll分离液法。分离细胞的保存1、短期保存：将细胞用含10%20%灭活小牛血清的培养液稀释重悬， 4保存。2、长期保存：液氮，加DMSO。活力测定：台盼蓝蓝色，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,淋巴细胞表面标志及亚群分类一、T细胞表面标志及其亚群T细胞共同的标志抗原：CD3辅助性T细胞（Th）：CD3+CD4+CD8-；细胞毒性T细胞（Tc/CTL）：CD3+CD4-CD8+；调节性T细胞（Tr/Treg）：CD4+CD25+。CD2：表达于全部人T细胞和NK细胞，因能与绵阳红细胞（SRBC） 结合，又称绵羊红细胞受体。CD3：表达于全部T细胞表面，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。CD4/CD8：表达CD4的主要是辅助性T细胞、表达CD8的主要是细胞 毒性T细胞。其他表面标志：致有丝分裂受体辅助性T细胞分为：Th1、Th2Th1主要分泌IL-2、IFN-或TNF-等细胞因子辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反应，本身具有明显的细胞毒作用。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子辅助体液免疫，参与速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。细胞毒性T细胞分为：Tc1、Tc2都有典型的细胞毒作用。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,淋巴细胞表面标志及亚群分类二、B细胞表面标志B细胞的重要表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体。SmIg为B细胞特有，是鉴定B细胞的可靠指标。SmIg又称BCR，mIg的主要作用是结合特异性抗原，故又称抗原受体。成熟的B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。B细胞的表面特异CD分子有CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。B细胞及其亚群的检测是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫调节紊乱的重要指标。三、NK细胞表面标志NK细胞典型标志：CD3-CD16+CD56+CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，行使针对靶细胞的定向非特异性杀伤作用，也即NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。,吉普塞舞神,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,其他免疫细胞抗原递呈细胞（APC）“专职”抗原递呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，它们均可表达MHC-类分子；“非专职”抗原递呈细胞，包括内皮细胞、上皮细胞和激活T细胞等。单核-吞噬细胞系统（MPS）典型表面标志是CD14。DC细胞的主要特征表面标志是CD1a、CD11c和CD83。免疫细胞表面标志的检测方法：1、抗体致敏花环法2、免疫细胞化学法3、免疫荧光法4、流式细胞分析法CD4/CD8比值升高常见于自身免疫性疾病；而CD4/CD8比值降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再障等。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,一、淋巴细胞的功能检测体内试验：主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对 抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外试验：主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增值反 应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。（一）T细胞功能试验1、T细胞增殖试验体外刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A、白喉类毒素、破伤 风类毒素、白色念珠菌等。2、T细胞分泌功能测定分别检测细胞因子的含量、生物活性和基因表达水平。3、T细胞介导的细胞毒试验适当的靶细胞（肿瘤细胞）与待检淋巴细胞共培养，观察肿瘤细胞杀伤情况。4、体内试验正常机体对某种特殊抗原建立了细胞免疫后，如用相同抗原做皮肤试验，常可出现阳性的迟发型超敏反应。目前临床上用来诊断某些病原生物感染（结核、麻风等）和细胞免疫缺陷等疾病。结核菌素皮肤试验；PHA皮肤试验用于检测机体的细胞免疫水平。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,（二）B细胞功能检测1、B细胞增殖试验：小鼠B细胞用LPS刺激； 人B细胞用含SPA的金黄色葡萄球菌及抗IgM抗体刺激。2、溶血空斑试验：经典溶血空斑试验：检测动物抗体形成细胞的功能。被动溶血空斑试验：人抗体形成细胞产生的Ig与SRBC上的抗原结合， 在补体作用下出现溶血反应。3、酶联免疫斑点实验（ELISPOT）既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。4、体内试验 常用白喉毒素、破伤风毒素、多价肺炎链球菌菌苗等，将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并与免疫前后分别采血，测定受试者相应抗体效价，判断B细胞功能。（三）NK细胞活性测定NK细胞与肿瘤细胞共同培养，观察肿瘤细胞的存活情况。测定人NK细胞常用K562细胞株；测定小鼠NK细胞活性常用YAC-1细胞株。,吉普塞舞神,第十五章 免疫细胞功能检测技术,二、吞噬细胞功能检测技术（一）中性粒细胞功能检测1、趋化功能检测Boyden小室法、琼脂糖平板法2、吞噬和杀菌功能测定显微镜检查法、溶菌法、NBT还原实验（二）巨噬细胞功能检测1、炭粒廓清试验2、吞噬功能检测3、巨噬细胞溶酶体酶的测定4、细胞毒作用测定5、巨噬细胞促凝血活性测定,吉普塞舞神,第十六章 细胞因子与细胞黏附因子的测定,细胞因子的本质是蛋白质或多肽；黏附分子的本质是糖蛋白。常见的测定方法：分子生物学测定基因或mRNA； 生物活性测定；生物活性测定法1、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法常用放射性核素掺入法和MTT比色法2、细胞毒活性测定法 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，会导致细胞死亡，检测细胞死亡数作为检测指标，本法常用作TNF等测定。3、抗病毒活性测定用于IFN等细胞因子的检测。4、趋化活性测定法 趋化因子诱导中性粒细胞、单核-巨噬细胞或淋巴细胞等定向迁移，其诱导迁移的方式包括趋化性和化学增活性。趋化性：诱导细胞由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处定向移 动的特性。采用Boyden小室趋化试验测定。化学增活性：指细胞因子增强细胞随机运动的能力，采用琼脂糖小 滴化学动力学试验测定。,吉普塞舞神,第十六章 细胞因子与细胞黏附因子的测定,免疫测定方法1、ELISA法：测定细胞因子和可溶性黏附分子。2、流式细胞分析：主要检测细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子。3、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）： 用于类风湿因子、IFN-等细胞因子分泌细胞的定量测定。,吉普塞舞神,第十七章 流式细胞仪分析技术及应用,FCM常用染料有：异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白类（PE）、罗丹明AID检测中的应用T淋巴细胞总数减少、T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc1，Th细胞数量显著下降，Tc细胞正常，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞处于正常范围。自身免疫性疾病相关HLA抗原分析强直性脊柱炎：外周血HLA-B27的表达及表达程度与疾病发生有很 高的相关性。,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,一、血清IgG、IgA、IgM测定IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，其中IgG1最多、IgG4最少。 是血液和细胞外液中的主要抗体，也是机体再次免疫应答的 主要抗体，大多数抗感染抗体与自身抗体都是IgG。IgA：血清型主要以单体形式存在； 分泌型由J链连接的二聚体和分泌成分组成。 是参与黏膜局部免疫的主要抗体，分布于胃肠道和支气管分 泌液、初乳、唾液和泪液中。IgM：五聚体、分子量最大，又称巨球蛋白，主要存在于血液中。 是个体发育中最早合成和分泌的抗体，也是抗原诱导的体 液免疫中最早出现的抗体。测定方法：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。临床意义：1、IgG分子量小、可透过胎盘，故新生儿血液中IgG含量接近成人。2、3中Ig均升高：见于慢性肝脏疾病。3、IgG升高：见于慢性细菌性感染，如慢性支气管炎、肺结核。4、IgM升高：宫内感染、类风湿性关节炎。5、SLE（系统性红斑狼疮）：IgG、IgA升高。,吉普塞舞神,一、血清IgG、IgA、IgM测定单一免疫球蛋白升高： 指患者血清中某一类免疫球蛋白显著增多，大多在30g/L以上，称为单克隆蛋白（MP），也叫M蛋白。此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，又称副蛋白。见于免疫增殖病，如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、 重链病、轻链病等。免疫球蛋白降低：先天性：见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。获得性：IgA缺乏，易发生反复呼吸道感染； IgG缺乏，易发生化脓性感染； IgM缺乏，易发生革兰氏阴性菌败血症。,第十八章 体液免疫球蛋白测定,吉普塞舞神,第十八章 体液免疫球蛋白测定,二、血清IgD和IgE测定IgD：膜结合型IgD（mIgD）构成B细胞BCR，是B细胞成熟的标志。 未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞同时表达两种。 活化的B细胞或记忆B细胞mIgD逐渐消失。IgE：含量最少，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。 IgE为亲细胞抗体，可诱发型超敏反应，也和抗寄生虫有关。检测方法：ELISA三、尿液及脑脊液Ig测定1、尿液中Ig测定 正常人尿液中Ig含量极微，肾小球滤过膜损伤轻微时，尿液中IgG滤出增多；滤过膜损伤严重时，