【毕业学位论文】（Word原稿）Delftia tsuruhatensis AD9邻苯二酚2，3－双加氧酶基因的表达和功能研究微生物学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 ， 3 双加氧酶基因的表达和功能研究 of ,3- s of ,3- 略 词 缩略词 英文名称 中文名称 p m 胺降解菌 苄青霉素 四环素 卡那霉素 氯霉素 Bp 基对 ,3苯二酚 2， 3双加氧酶 代十六烷基三甲胺 氧核糖核苷酸 MS 化乙锭 2羟粘糠酸半 丙基硫代 Kb 碱基对 养基 钟 合酶链式反应 分钟转速 二烷 基磺酸钠 4 3 I 摘 要 苯胺是一种危害性极大的污染物，对人体有致癌作用。利用微生物降解这类化合物受到全世界各国的重视。 本实验中 前期研究中， 从印染 厂 活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的丛毛单胞菌 隆了完整的 苯胺降解基因簇 ，其中包含两个赖氨酸型调控基因和 有两个编码邻苯二酚 2， 3双加氧酶（ 基因 （ 分别位于苯胺降解基因簇的两个操纵子上 。 键 酶。 本研究对 发现 在核苷酸水平上 5， 对两个基因推导的氨基酸序列分析表明 。但是， 预测两个酶的蛋白三 维 结构 却惊奇的 相似。 首先我们测定了 苯胺和 邻苯二酚耐受性，发现 胺 的浓度达 4500mg/l， 相比 对 邻苯二酚的耐受 浓度 低于 600mg/l， 超过该浓度时， 同时 ，也发现 在苯胺降解初期， 伴随着 2羟粘糠酸半醛（ 积累。 表明 邻苯二酚 2， 3双加氧酶 对中间产物的进一步降解起到重要作用。 为 了 分析 苯二酚 2， 3双加氧酶 们 利用 验结果表明 苯胺诱导物存在下， 为了进一步分析 研究分别 克隆 并构建原核蛋白 表达载体 获得 两个基因的表达菌株 对 提取 的 行了 酶活 测定，发现 提液 对邻苯二酚的降解速率明显高于 提 液 。从上述实验结果中，我们 推测 ， 3双加氧酶在苯胺降解中起主要作用， 而由 苯胺降解过程中起着补偿机制的作用。 关键词 ： 苯胺， 苯二酚 2， 3双加氧酶，酶活测定， 解 途径 is a a in of to of in an a 5 at 7 in of ,3 in of in of by 5% of at is of is In we of to or . D9 D9 in of ,500 l, D9 00 l of In we of ,3a To 23on D9 we of at to by of of of To 23Os by we of of of ,3a in of , 3 录 第一章 引 言 . 1 胺降解微生物的研究进展 . 1 胺特性 . 1 胺微生物降解的特点 . 1 胺降解细菌 . 2 胺降解途径的研究进展 . 3 胺降解基因簇的克隆 . 3 胺降解代谢途径 . 5 苯二酚双加氧酶的研究进展 . 6 苯二酚 1， 2双加氧酶 . 6 苯二酚 2， 3双加氧酶 . 8 苯二酚 2， 3双加氧酶结构 . 8 同来源的邻苯二酚 2， 3双加氧酶及其性质 . 8 苯二酚 2,3. 10 苯二酚 2,3. 12 苯二酚的间位裂解途径 . 12 胺降解菌 研究进展 . 13 胺降解菌 分离 . 13 胺降解菌 生理生化特性 . 13 胺降解基因簇的结构及功能 . 13 题依据和研究目的意义 . 17 术路线 . 18 第二章 实验材料与方法 . 19 株和质粒 . 19 物化学试剂 . 19 和试剂盒 . 19 养基 . 19 列分析及蛋白结构预测 . 20 苯二酚含量的测定（ 法） . 20 取 . 20 转录 . 20 苯二酚双加氧酶基因的克隆 . 21 因片段的回收 . 22 达载体的构建 . 22 受态细胞的制备 . 24 达载体的转化及筛选 . 24 化子的鉴定 . 24 白电泳 . 24 第三章 结果与讨论 . 27 验结果 . 27 个基因的序列分析及蛋白结构比较 . 27 苯胺和邻苯二酚为唯一碳源的生长情况 . 28 究基因在不同诱导物诱导条件下的表达情况 . 29 核表达载体 构建 . 32 核表达载体 达产物的 析 . 33 2,3O 酶活的测定 . 34 论 . 35 胺代谢途径的特点及其邻苯二酚双加氧酶在代谢途径中的作用 . 35 胺降解基因簇中调控机制的研究 . 36 第四章 结论 . 38 参考文献 . 39 附录 . 49 致谢 . 51 个人简历 . 52 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 近些年来，随着生产力水平的提高，工业的发展，工业废水所造成的环境污染越来越成为人们所关注 的焦点问题。在这些污染物中，芳香族化合物占了很大的比例。芳香族化合物在自然界广泛存在，仅次于葡萄糖残基，苯环是自然界中分布最广的化学单元。目前，芳香族化合物：苯、甲苯、乙苯、二甲苯、苯乙烯正以每年百万吨的数量被制造出来，这些化合物广泛的用于燃料和工业溶剂，而且它们和多环芳香化合物、氯代联苯是生产医药、农药、塑料聚合物、炸药和其它日用品的最初原料（孙艳，钱世钧 2001）。具有苯环结构的化合物是一类难降解的有机物，并且具有相当大的毒性和致癌、致突变作用。人工合成的芳香族化合物在利用时不可避免的泄漏到环境中，造 成严重的环境污染，尽管人们已经认识到了问题的严重性，这一问题仍呈上升的趋势。 自然界中，存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌，这些细菌可以以这类化合物作为唯一碳源生长，并将芳香族化合物完全降解为水和 生物降解环境污染物由于投资少、占地小又不需特殊设备而成为最有前途的治理环境污染的方法。目前世界各国的科学家们都致力于降解芳香族化合物微生物的研究，已经从工业废水及污染土壤中分离得到了多种此类微生物。本实验室也于 2002年从南方一印染厂污染土壤种分离得到了一株稳定高效的苯胺降解菌 梁泉峰，林敏 2005） 在芳香族化合物降解过程中，邻苯二酚是一个重要的中间产物。邻苯二酚的降解是通过邻苯二酚双加氧酶催化的。 胺降解微生物的研究进展 胺特性 苯胺，俗名阿林尼油，外观为无色或浅黄色透明油状液体，具有强烈的刺激性气味，有毒，分子式 胺是重要的有机化工原料之一，由其制得的化工产品和中间体有 300多种，广泛应用于染料、医药、炸药、香料、橡胶硫化促进剂、药品等行业，尤其是可作为聚氨酯产品主要原料 胺对生物具有毒性作用 ，引起中枢神经系统、心血管系统以及其它脏器的损害，而且苯胺类化合物还具有致癌作用（司航， 1995）。 胺微生物降解的特点 目前国内外对苯胺类污染物的处理方法中，微生物降解相对于现有的物理化学处理系统而言，具有投资少、速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点。微生物降解处理方法具有很大的发展潜力。 但是微生物降解苯胺与降解其它芳香族化合物相比较，仍然属于难于降解的一类。芳香族化合物生物降解性与其化学组成、结构有密切关系，氨基和硝基的引入增加了降解的难度。单个取代基芳香 化合物降解性由易变难的顺序是：苯酚苯甲酸甲苯苯苯胺硝基苯。目前将芳香化合物按生物降解的速率分为五类：第一类 启 动期短，降解速度快，属于这一类降解类型的化合物有：苯酚、邻苯二酚、苯甲酸、邻苯二甲酸、甲苯。第二类 启 动期短，降解速度较快，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 属于这一类降类型的化合物有：间苯二甲酸、对苯二甲酸、苯、间二甲苯和对二甲苯。第三类 启动期长，降解速度快，属于这一类降解类型的化合物有：乙基苯、苯胺、邻苯二甲酸和三甲苯。第四类 起动期较短，降解速度慢，属于这一类降解类型的化合物有；邻、间和对硝基苯酚、对羟基苯磺 酸、硝基苯。第五类，起动期长，降解速度较慢，其中最为典型的是邻苯二胺和间硝基苯胺。综上所述，苯胺在芳香族化合物的生物降解中，属于较为难降解和降解启动时间长的一类(王思菊等， 1995)。 因此 ， 寻找和构建高效、快速降解苯胺的菌株，成为生物降解苯胺研究的关键因素之一。 胺降解细菌 基于上述原因，世界各国政府和科学家十分重视对苯胺降解微生物资源的开发和利用，已经从长期受污染的土壤或活性污泥中分离鉴定出藻类，真菌，多种细菌等 苯胺降解微生物，显示出该类生物的多样性（ 表 1。 表 1多样性 of 研究者及参考文献 降解菌株 刘志培等 ,1999； 2002 嗜酸性丛毛单胞菌 A., D et 1989 单孢菌 R. C,1989 酸钙不动杆菌 et 2000 N. C. et 臭假单胞菌 T et 998a;1998b 动杆菌 K et 1984b 拉特氏菌 S. I et 1998 ;1999 ;2001 ; 2002 24 鲁氏不动杆菌 K. et 串红球菌 G. et 2001 镰刀霉 韦海潮等 ,1998 苍白杆菌 K., et 单胞菌 N. et 2000 ;2001 C. 2, D. . D. . 8c 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 本实验室 从 印染 厂 活性污泥中分离到的一株 新 的 苯胺降解菌株 该菌 具有降解速率 快 和耐受苯胺浓度 高等 明显的优势 ， 具备 良好 的应用和理论研究价值 （ 梁 泉峰 ，林敏 2005） 。 胺降解途径的研究进展 众所周知，微生物在物质循环包括有机污染物降解中起到不可取代的重要作用。 至今已从环境中分离到许多不同种属的芳香化合物降解微生物，并对 降解微生物的重要生化、遗传和生理学特点 以及降解代谢途径开展了大量富有成效的研究（ 994, 001, 002, 001, 001, 998）。上述 提到了 许多苯胺降解菌 已经 被分离，从一些菌株的克隆到了 苯胺降解相关基因，对苯胺代谢途径有了较明确 的了解。 胺降解基因簇 的克隆 迄今世界上只有少数 4 5个苯胺双加氧酶基因簇得到真正克隆并注释 ： 997）， (997)， et 1998,2003； 003） 和 （ 004） (图 1这些降解基因簇均位于质粒上 ， 都含有 个基因簇中前几个基因（ 6 8个）位于同一操纵 子 上，包括编码多组分的苯胺双加氧酶的 5个基因以及调控基因。可见这些苯胺降解基因在遗传组织结构上具有极高的相似性。这种相同的基因组成表明上述苯胺降解基因可能来源于同一祖先（ F et S et T et 1998 ; S et 。 本研究室从污染环境中分离到一株能高效降解苯胺的细菌菌株 最高能耐受 4500mg/8小时内完全降解起始浓度为 1000mg/从该菌基因组图 1 为首次报道染色体编码的完整的苯胺降解 基因簇 （ 005）， 报道中其余得到的完整 的苯胺降解基因簇均位于质粒中。 其 苯胺降解基因紧密连锁成簇，两侧由转座酶基因（ 列环绕，具有典型的基因岛（ 征。 序列比对分析表明 该基因簇与 P. 胺降解基因簇 为 005） 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 图 1同菌种中的苯胺双加氧酶基因 1同菌种中的 苯胺降解基因 簇 1997 年 997 年 002 本实验室 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 胺降解代谢途径 1975年 证明了在诺卡氏菌通过加双氧反应形成邻苯二酚。 1975年第一次提出苯胺降解的邻位裂解 （ 0， 1975和 ,1990证明了苯胺降解途径中邻苯二酚 1,2双加氧酶催化邻位裂解开环。 1979 第一次提出苯胺降解的间位裂解（ 等人 1990证明苯胺降解间位裂解途径的邻苯二酚 2,3双加氧酶作用。 大多 芳香族化合物 的生物 降解 过程中， 均生成称之为中心代谢 中间产物 邻苯二酚，微生物在好氧条件下，降解途径的第一步是苯胺氧化成邻苯二酚（图 1而邻苯二酚降解可以通过两种代谢途径，即邻位 (间位 (谢 途径，分别由邻苯二酚 1,2双加氧酶或邻苯二酚 2,3双加氧酶催化。当苯胺通过邻位代谢途径时，在两个羟基之间切割邻苯二酚，再经多步反应产生三羧酸循环的中间代谢物琥珀酸和乙酰辅酶。当苯胺通过间位代谢途径时，在其中一个羟基的旁侧切割儿茶酚，最后产生丙酮酸和乙醛。 假单胞菌 属的 某些菌株可 以通过间位代谢途径降解苯胺。诺卡氏菌通过双加氧酶反应将苯胺转化为邻苯二酚，进而既可以通过邻位代谢途径也可以通过间位代谢途径降解邻苯二酚。 992年还对苯胺降解酶进行了基因定位，发现假单胞菌的邻苯二酚 2,3双加氧酶 的基因可能定位于质粒上。 图 1 3 芳香化合物生物降解 成邻苯二酚是降解途径中的关键第一步 of is 985年报道 ， 在厌氧条件下苯胺脱硫杆菌 (先使苯胺羧基化形成对氨基苯甲酸 ， 然后进行还原脱氨作用。 不同微生物降解苯胺的途径不同，表明苯胺微生物降解 代谢的多样性。另外需要特别指出的 O C O O H C O O O O C O O A n t h e a n i l i c a c i dM a n d e l i c a c i dB e n z o i c a c i dT r y t o p h a nN a p h t h a l e n eS a l i c y l i c a c i dA n t h e a c e n eP h e n o lC a t e c h o 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 是，上述苯胺的降解代谢途径的研究都是通过测定细胞中所含的酶类来确定的，建立分子基础上的苯胺代谢途径仍鲜有报道。 苯二酚双加氧酶的研究进展 微生物可以降解芳香族化合物，根据微生物对氧的需求可分为好氧降解和厌氧降解。好氧降解以分子氧作为最终电子受体，而厌氧降解以除氧以外的物质如硝酸盐、硫酸盐、二氧化碳或铁等作为最终电子受体。目前普遍认为单环芳烃和一些多环芳烃的降解途径一般是先生成中间产物，这些中间产物再降解为 2O，从而进行有氧降解。需氧细菌中，邻苯二酚降解途径 是由苯环转变为中心代谢物的主要途径，细菌可以通过间位裂解 ( T et J et J, 1984; K et N. C et A et K et 邻位裂解（ K et S et S. I et N et 2000） 两种途径 降解邻苯二酚 (如图 1 4)。 邻苯二酚 2， 3双加氧酶是典型的间位氧化开环酶，也称作外二元醇双加氧酶，它催化邻苯二酚的间位裂解途径；邻苯二酚 1， 2双加氧酶是典型的邻位氧化开环酶，又称为内二元醇双加氧酶，它催化的是邻苯二酚的邻位裂解途径。它们的功能之所以不同，是由其活性中心的不同结构决定的。 苯二酚 1， 2 双加氧酶 邻苯二酚 1,2 它催化邻苯二酚转化为顺 ， 顺 目前已在 图 1香族化合物降解 途径中 邻苯二酚降解的邻位和间位途径 in C