【毕业学位论文】口蹄疫病毒Hankou99株全基因组序列测定及全长cDNA分子克隆的构建硕士论文

密级：机密 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 口蹄疫病毒 9 株全基因组序列测定及全长 子克隆的构建 9 请 人： 曾江勇 指 导 教 师：刘在新 研究员 郭建宏 博士 申请学位类别：农学硕士 专 业： 预防兽医学 研 究 方 向： 病毒基因工程 培 养 单 位： 研 究 生 院 兰州兽医研究所 提 交 日 期 2006 年 12 月 9 r. of 2006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 口蹄疫病毒 9 株全基因组序列测定及全长 子克隆的构建论文作者 曾江勇 指导教师 刘在新 研究员 郭建宏 博士 培养单位 兰州兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 罗建勋 研究员 博导 中国农业科学院兰州兽医研究所 动物寄生虫系统发生学与分子免疫学 伏小平 副教授 硕导 甘肃农业大学动物医学院 动物微生物与免疫学 评 阅 人 王永录 研究员 硕导 中国农业科学院兰州兽医研究所 动物病毒学 答辩 主席 才学鹏 研究员 博导 中国农业科学院兰州兽医研究所 分子生物学 张永光 研究员 硕导 中国农业科学院兰州兽医研究所 动物病毒学 吴润 教授 博导 甘肃农业大学动物医学院 动物微生物学刘湘涛 研究员 硕导 中国农业科学院兰州兽医研究所 动物病毒学 刘磊 教授 硕导 甘肃农业大学动物医学院 动物免疫学答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006 年 12 月 11 日 中国农科院兰州兽医研究所 综合楼五楼学术厅 记 录 王建东 摘 要 口蹄疫（由口蹄疫病毒（起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（列为 A 类传染病之首。为了建立一个有用的“技术平台” ，进一步研究 命周期中宿主蛋白的作用、体的选择和利用等一系列问题，我们对 9 株全基因组序列进行了测定，借助生物学软件对结构蛋白二级结构及其 B 淋巴细胞抗原表位进行了预测， 利用反向遗传学技术构建了全长 子克隆,使对 研究迈入到一个新的阶段。 1. 9 株全基因组序列的测定与分析：以 9 为参考毒株，从感染9 株的细胞液中提取病毒基因组 把全基因组分为彼此重叠的 5 段 （S, L, C, D, E） ，分别进行扩增、克隆和测序，其结果为：99 株全基因组长 80995 1040编码区核苷酸全长 6966编 码 2322 93其后是至少30个)结构。 根据绘制了9株与9株参考株的系统发育树, 结果表明 9 株与 O 型的 7、O/ 8、 O/同源性较高， 为同一基因型，其遗传关系较近，而与其它毒株遗传关系较远，在基因组功能未知区域和 3A 蛋白编码区各有一段基因片段缺失，其中 3A 编码区域缺失 30 7 相同。此项研究基本了解了这个毒株的一级结构、基本特征及遗传关系，为 行的疫源分析提供了理论依据。 9 株结构蛋白二级结构及其 B 细胞抗原表位的预测：应用 物学软件，采用各种方法，对 9 株结构蛋白基因编码的蛋白质二级结构和 B 淋巴细胞的抗原表位进行了预测和分析，结果发现， 此株 B 细胞抗原表位不仅局限在 存在抗原表位。因此，本研究丰富了 原表位的研究内容，为研制疫苗提供了可靠的科学数据，同时也提示我们，在免疫接种失败后，应充分考虑病毒抗原位点变异等问题。 3 9 株全长 子克隆的构建：以克隆的 5 个重组质粒 、C、D、E 为基础，用 合和酶切连接的方法分别构建 5半分子和 3半分子，其中，在扩增 过沉默突变引入一个分子遗传标记（ ）,用于区分自然毒株和基因工程毒，通过 S、 L 片段 合，合成 17 个 )结构，然后用 消化所构建的 5半分子和 3半分子，借助 接酶将二者相连，构建成重组质粒 9 株全长 子克隆，采用 、限制性内切酶酶切法和基因组测序法进行了鉴定，为获得感染性克隆、研究 宿主的相互作用、病毒嗜性及免疫变异等问题奠定了基础。 关键词： 基因组，抗原表位，全长 子克隆 I is an as IE In to of We 9 of of a We 9 by of of 099nt 3of 0406966nt 3nt ) 0nt in of of 9 be of P1 9 7, O/8 、O/ 、 、 ). in It 9 in of 0nt A LZ W/97its of we of of t in in P2 of be of on of L、 C、 D、 E, of in of of CR a ) 1 ) on we of 4 . a of of a I 目 录 第一章 绪论 . 1 究的目的和意义 .内外研究现状 .究内容和方法 .二章 9 株基因组全序列的测定 与基因特征分析 . 8 料与方法 .果与分析 .论 .9 株结构蛋白的二级结构及其B 淋巴细胞表位的预测 . 19 料与方法 . 结果与分析 .论 .四章 9 株全长. 26 料与方法 .果 .论 .五章 论文结论 . 32 参考文献 . 33 附 录 . 39 致 谢 . 56 作者简历 . 57 图表清单 图 1. 2. 2用于扩增9 株全长. 2全长9 株基因组. 2S 和 2 、片段 物 . 29 株基因组的组成 . 29 株与参考毒株核苷酸和氨基酸序列（斜体）同源性比较 . 29 株功能未知区域缺失与参考毒株的序列比较 . 29 株 3. 2根据因对9 株与参考毒株绘制系统发生树 . 3根据两种不同的方法预测白的二级结构 . 3白的柔性区域 . 3白的亲水性、抗原指数及表面可能性分析 . 3根据两种不同的方法预测白的二级结构 . 3白的柔性区域 . 3白的亲水性、抗原指数及表面可能性分析 . 3根据两种不同的方法预测白的二级结构 . 3白的柔性区域 . 3白的亲水性、抗原指数及表面可能性分析 . 3据两种不同的方法预测白的二级结构 . 3白的柔性区域 . 3白的亲水性、抗原指数及表面可能性分析 . 4扩增9 株S片段的下游引物 . 4长. 4物 、 图 4 4半分子的酶切鉴定结果 . 49 株基因组 3 半分子的酶切鉴定. 29 图 49 株基因组全长 子 的构建. V 英文缩略表 缩写 英文名称 中文名称 A 嘌呤 基酸 苄青霉素 仓鼠肾细胞 bp 基对 血清白蛋白 C 嘧啶 补脱氧核糖核酸 鼠卵巢细胞 氧化碳 式作用复制元件 d 二乙基焦磷酰胺 氧核糖核酸 氧核苷三磷酸 化乙锭 希氏大肠杆菌 二酸四乙酸 嘌呤 g 苷酸序列资料库 h 时 免疫缺陷症病毒 部核糖体进入位点 kb 000 个碱基对 L B 培养基 数致死量 肾上皮细胞 克 钟 升 摩尔 编码区 苷 放阅读框 酸盐缓冲液 V 0 磷酸盐吐温缓冲液 合酶链式反应 乙二醇 （氢离子当量浓度指数） ) 聚腺嘌呤 ) 聚胞嘧啶 糖核酸 抑制剂 分钟转速 转录 冲液 NA 合酶 U 抗生素）单位 g 克 L 升 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪 论 究的目的和意义 口蹄疫（是由口蹄疫病毒(起的多种偶蹄动物高度接触性传染病。在众多的有害微生物中， 一个危害严重的病原体，可以感染多种家畜及野生动物，对畜牧业生产危害极大，是影响动物产品（包括动物）国际贸易的主要疾病之一， 展到现在已超过百年，从全球范围来看，大多数国家有的呈地方性流行，有的呈暴发性，全部消灭 国家很少，尽管各国采取了不少对策，但很难凑效。自 14、15世纪阿拉伯学者就已经记载了类似 疾病。到 19 世纪， 经成为欧洲频繁暴发、危害极大的畜牧业传染病。非洲、亚洲也都有暴发 报道。1997 年 击台湾地区，引发猪养猪业造成了毁灭性的灾难，先后屠宰猪 400 余万头，仅日本当年终止进口台湾猪肉的合同额就达 美元，台湾当年的经济增长率因此下降了一个百分点；2001 年 陆以英国为主的欧洲数国，使这些地区的猪、牛、羊惨遭厄运，导致相关产业瘫痪不振。 早期对 研究主要停留在血清学、流行病学水平上。 20 世纪 80 年代以来，随着分子生物学技术的出现，对 研究有了突破性的进展，主要是测定了病毒基因组全序列，鉴定了病毒表面的抗原决定簇等，从而为在分子水平上阐述 致病机制以及积极研制抗病毒疫苗提供了可能。反向遗传学是近几年出现的一项新型技术，它能为我们清楚地了解和掌握更多的息提供一个十分有用的技术平台，利用反向遗传操作技术，我们不仅能从分子水平上了解结构、复制、转录和表达的详尽过程，而且可以应用基因工程技术，根据研究需要对基因组进行各种必要的修饰或改造，以研究其结构和功能、表达调控机制、致病机理、病毒毒力变异的机制、抗原的漂移性以及该病持续性感染发生的原因和疫苗的研制等诸多问题，从而为控制和消灭 下坚实的基础。 内外研究现状 小 毒科( ( 典型成员，有 7 个血清型，多种亚型，型间无交叉反应，由于 遗传不稳定性和抗原多变性而不断有新的分离株出现，完整的 粒包括衣壳和 部分，基因组为单股正链 有 8 500 个核苷酸（，5端连接一种特殊的小蛋白 A M Q., et 1980）， 紧接着是约 1300 5 非编码区 （；3端有 )，其上游是约 90 3非编码区(基因组的中部是一个大的开放阅读框架( 编码一多聚蛋白，多聚蛋白在翻译的同时，经二级裂解后形成 3病毒结构蛋白 （ 8 种非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D） ，其中， 60 个分子构成病毒衣壳蛋白，部分暴露在病毒粒子的表面，是决定病毒抗原性的主要成分，可诱导感染动物产生中和抗体，部分埋在病毒内部， 于 种结构多肽都参与免疫原性的构成,其基因组结构与空衣壳的构成如图 1示。 1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2图 1因组结构及空衣壳的构成 一定程度上使深入研究受到了限制，近年来，科学工作者采用反向遗传学技术开展对极大地推进了分子病毒学的发展进程，如： P. 基因组全长体外研究. et 2005)； 病毒全基因组上扩增 3 个重叠继连到成全长重组质粒，经体外转录和转染， 该转录本能在6 和胞上启动病毒复制(Ru et 2001)，等等。 反向遗传学技术的核心是首先构建使之受控于过体外/体内转录再次得到活病毒到拯救病毒的目的。在构建感染性学家们根据他们所研究的不同病毒，采取不同的策略，)序列和)尾巴， 这些结构与病毒的感染性密切相关，始终保持以获得病毒的忠实性全长用基因操作的手段研究开展术平台”。目前，病毒拯救技术在源基因表达、基因治疗和疫苗研制等许多方面的研究都是强有力的工具和手段，发挥着越来越大的作用。 构与功能 至今，人类经过大量的科学研究，已基本清楚了要确定其各个基因的精确功能还有大量的工作，特别是要彻底弄清究竟是哪些基因决定了病毒的毒力、抗原位点的转移以及持续性感染的原因等等，通过构建全长感染性中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 析其感染性，结果证明来源于全长但该拯救病毒 147 位点的氨基酸变成P， 对2003），这个研究提供了在体内对毒力研究一个非常有用的工具。 )的分离株，认为)序列的长度与毒力无关（et 1984） ，而 、6、16、25、35 个过转染细胞和接种动物，结果表明，一定长度的)序列对维持病毒的毒力是必需的（, et 1993） 。 从 染性 获得 录本，删除所有 码区和 94% 码序列不会明显影响 制水平，由此得出，因组的这些区域没有顺式作用复制元件( ., 2000)。组 P1(过调整 号通路，可用于有效诱导人癌症细胞凋亡(M, et 2004)，同时，也发现 染猪会引起细胞凋亡（K ， et 2005）。 把 因整合到马铃薯叶绿体基因组中，并用 定量 析证明 因已在马铃薯叶绿体中表达( et 2006) 。 L 和 3C 蛋白酶在 胞上诱导切割 列, 从而阻止蛋白的合成(, et 2004) 。 等发现A 能与一个逆转录病毒载体的4 个蛋白共表达(, et 2004)。不同小毒非结构蛋白对影响分泌途径可能是不同的，如： 23A 则可能在免疫逃避和病毒的持续性感染上起一定的作用(, et 2005) 。起 初在作为疫苗毒株，但聚丙酰胺凝胶分析的结果显示et 1987）,这些变化是3et 1990），另外，在O/7株中也发现了类似的缺失，这些缺失降低了病毒对牛的致病性以及病毒在牛源细胞中生长的能力 （et 1999） ，（W,et 2000）。 3此，研究者们认为此酶能成为抗病毒药物的亮点(R, et 2005) 。 在3D 上作了3 处诱变（ 239M,，结果表明, , et 2005)。 等确定了3D 聚合酶的晶体结构，为进一步研究复制和抗病毒剂提供了必要的信息(, et 2004) 。 毒的复制是由于细胞内小泡的酸化开始(O, et 2005)。 ，而宿主细胞的受体主要有两类，即整联蛋白和硫酸乙酰肝素（ul 蛋白，它们的结合就是整联蛋白识别-H 序。于参与病毒对靶细胞的结合。 第一章 绪论 长生感染性病毒，而几乎所有在它们和表达野型染细胞，结果证明，et 1997)。则使用一个含有是列）(24)，在感染性毒株转染细胞仍表现出感染性，并可将此病毒传播给易感动物（et 2005） 。 认为 是 联蛋白是 , et 2005)，而且可释放病毒进入酸性的内涵体中(, et 2005)，溶解的12 型标记过的附胞( , et 2004)， 4型感染性含44秘密子上存在一个核苷酸置换或两个置换)和突变细胞株，含序列仍存在，并能表达牛的 含不是 而体外对整联蛋白的结合不起作用，表明着此序列（不是病毒,但是接近它的序列，仍能通过整联蛋白受体对易感动物感染、传播（et 2005）。 2型感染性型 现二十面体病毒子五倍轴上的一组蛋白残基决定宿主范围，影响对猪的致病性，这些残基包括在108和174位点上的芳香氨基酸，1了检测是否这些残基参与非依赖性整联蛋白细胞的结合，在两个不同的嵌合体中，把1果表明，它们在细胞的成长不依赖于中一头猪检测到了病较轻（et 2003）。 用两种不同的展示方法，把 白（含 23 个氨基酸）导入加利福利亚核型多角体病毒(表面，直接修饰 主要包膜蛋白 把修饰过的 入病毒表面以展示抗原表位,实验表明，有 插入的包膜蛋白 提高杆状病毒在哺乳细胞中的特异吸收（ et 2006） 。 合病毒 人工改造的细胞培养后对动物无感染性， 通过但了提高这个质粒的感染性，把编码 肝炎病毒核酶的端，结果是，此重组质粒在细胞培养上感染性有轻微提高，当接种乳鼠，能产生病毒（et 1997 ） 。 为了避免选择疫苗株的繁杂过程，用适当的野毒株替代而得到建成苗株的感染性),再用此病毒与A 12果是，明在选择传统疫苗株中，此嵌合体是有潜力的，而第二个嵌合体病毒 12则显示出H G et 2004)。4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 个是小的、透明斑病毒，能在一种是混浊蚀斑病毒， 仅仅在把编码这两种衣壳的生出嵌合病毒，通过对这些病毒和衣壳基因片段置换重组病毒的分析，确定3056位点）是细胞嗜性和阳性斑的决定因素，清的阳性斑主要依赖于3056位点上有高电荷造救的病毒丢失在过对人工获得的病毒和其它自然、改造的病毒的对比表明，2134和3056位点上正电荷残基对结合肝磷脂是必要的( et 1997)。 在疫苗效果、抗原变异和细胞结合上发挥着重要的作用。 建了 A 型 染性 其中的 被 O 和 C 型的同源序列替换，这些嵌合病毒高度复制，有蚀斑现象，类似于野型病毒，该嵌合病毒制备的化学弱毒疫苗诱导豚鼠产生抗体，中和A 、O、 C 型病毒，用 A/C 嵌合疫苗接种的猪也产生交叉作用的抗体，保护动物免受