HbAc行业标准化解读

HbA1c行业标准解读,内蒙古医科大学附属医院张军力,目录,一、HbA1c检测标准化意义与进展二、HbA1c行业标准要求三、HbA1c检测标准化现状,糖化血红蛋白（HbA1c）相关基础知识,成人血红蛋白（Hb）通常由HbA（97%）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）组成。对HbA进行色谱分析发现了几种次要血红蛋白，即：HbA1a、HbA1b和HbA1c，统称为HbA1，它们的糖基化位点是链N末端的缬氨酸残基。没有连接糖类的血红蛋白称为HbA0。,血红蛋白组成,HbA1c,HbA1c是糖化血红蛋白的主要组成成分,占总糖化血红蛋白的60%,目前临床定量测定及应用的是HbA1c结果。HbA1c由葡萄糖的游离醛基与HbA的链N末端缬氨酸的氨基经非酶促结合反应,先形成不稳定的Schiff碱(醛亚胺),然后经过Amadori(葡糖胺)重排,最后形成稳定的酮胺化合物,糖化血红蛋白的个体内生物学变异小于2%。,反应过去6-8周的平均血糖浓度，可为评估血糖的控制情况提供可靠的实验室指标。HbA1c为糖尿病患者心血管事件的独立预测危险因素。,糖尿病诊断标准,2010年美国糖尿病学会（ADA）推荐糖尿病诊断标准1、HbA1c6.5%（48mmol/mol）。或2、FPG126mg/dl（7.0mmol/L）。空腹定义是至少8小时没有进食热量。或3、OGTT试验两小时血浆葡萄糖200mg/dl（11.1mmol/L）.该试验应遵循WHO要求，服用75g葡萄糖的糖水。或4、在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖200mg/dl（11.1mmol/L）无明确高血糖症时，应通过重复检测来证实标准1-3,2010年糖尿病诊疗指南正式确定将HbA1c作为糖尿病诊断的一种方法，诊断界值为6.5%如无明确高血糖，则HbA1c与血糖检测应通过重复检测来证实将HbA1c 5.7%-6.4%的患者归类为“糖尿病高危人群”,HbA1c（糖化血红蛋白）患者无需准备（任何时间段，无需空腹）标本稳定性：非常好生物学变异小：个体内生物学变异小于2.0%阈值与眼底病变风险高度相关，比FPG提早预测当结果是7.0%时，变化范围为0.5%（6.5-7.5%）相对来讲不受急性的血糖波动的影响,中国2型糖尿病防治指南（2010版）,原因1：提出的诊断切点（6.5%）是否适用于中国人群有待验证,原因2：我国HbA1c测定标准化程度不够，各实验室间结果差异较大，如果采用HbA1c诊断糖尿病必然会造成很高的漏诊率和误诊率,鉴于HbA1c检测在我国尚不普遍，检测方法的标准化程度不够，测定HbA1c的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求。本指南仍不推荐在我国采用HbA1c诊断糖尿病。但对于用标准化检测方法，并有严格质量控制，正常参考值在4.0%-6.0%的医院，HbA1c6.5%可作为诊断糖尿病的参考。,糖化血红蛋白标准化,实验室指标：以数字形式参与临床评估,美国I型糖尿病控制及并发症试验（DCCT ）英国II型糖尿病控制及并发症关系研究（UKPDS ）表明：糖化血红蛋白是糖尿病长期血糖控制的最佳评估指标,HbA1c检测标准化至关重要,若HbA1c检测应用于临床，需实验室测定结果具有跨时空、跨检测系统的一致、可比性：才能建立起普遍可用的参考区间，而不是某个具体方法的参考范围才能够有效地应用循证医学和检验医学实践才可以合并分析、比较不同医学中心的研究资料，促进医学研究和研究成果的转化,标准化工作是实现临床实验室测定结果可比性的关键,目前糖化血红蛋白测定标准化最著名的是美国国家糖化血红蛋白标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）国际临床化学和检验医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC）糖化血红蛋白标准化计划,NGSP糖化血红蛋白标准化,1、NGSP成立1996年美国国家糖化血红蛋白标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）替代了美国临床化学学会（AACC）成立的糖化血红蛋白标准化委员会，7月开始工作。,NGSP糖化血红蛋白标准化,2、NGSP标准化对厂商的测定方法进行校准，使厂商实验室糖化血红蛋白结果和NGSP网络实验室结果具有可比性；厂商确认他们的产品，也和NGSP的网络实验室结果具有可比性；各临床实验室参加室间评估，对具有NGSP实验室网络定值的新鲜全血样品检测，验证他们日常报告的结果可比性。,NGSP对实验室的认证,由NGSP的二级参考实验室来对实验室进行认证工作得到认证的实验室所测结果是可靠的认证标准：逐步提高认证有效期：1年/docs/labs.pdf我国目前有近20家实验室得到认证,IFCC糖化血红蛋白标准化,1、IFCC1995年IFCC成立HbA1c标准化工作组，旨在建立具有高计量学水准的参考系统，实现检测的统一国际标准，发展和确认了2个候选参考方法和HbA1c、HbA0（非糖化血红蛋白）参考物，作为全球可比性分析准确度的基础。,首先确定HbA1c被测量-糖化部分-链N-缬氨酰-1-果糖基血红蛋白（HbA1c）可被IFCC参考测量程序特异地测量，所以计量上可溯源至具有“毫摩尔每摩尔（mmol/mol）”计量单位某物质组分。IFCC参考测量系统-发布了参考物质，是人全血分离的血红蛋白-发表了检测人全血中HbA1c的IFCC参考方法-实施参考检测实验室的网络-在IFCC参考检测实验室和NGSP实施比较研究-产生二级参考物质，分发给厂商和实验室，使其方法校正至IFCC参考系统,地区标准化和国际标准化的区别,CAP SURVEY (mean 2SD),2003年，99%实验室以HbA1c报告结果，室间CV 5%， 测定值与靶值的偏倚 0.8%HbA1c,国内、外变异度对比,靶值：5.4 最大值：6.3 最小值：4.6 变异系数：3.5,我国室间质评,CAP能力验证,中国糖化血红蛋白教育计划,临床实验室质量控制流程,样品采集、处理和储存,影响检测质量的因素,检测方法的原理,不同方法测定糖化血红蛋白不同的组分HbA1c、HbA1（A1a + A1b + A1c）或总糖化血红蛋白目前皆以HbA1c或等同于HbA1c来报告结果,6.1 分析系统选择6.1.1 应选用测定结果可溯源至IFCC参考方法的分析系统,包括仪器、试剂及校准物。例如:获得NGSP认证。可选用专用糖化血红蛋白分析仪,或全自动生化、免疫分析仪。6.1.2 NGSP认证的分析系统(方法)有效期为1年。注:查询网址:/docs/methods.pdf。,6.1.3 不同分析系统干扰因素是不同的,实验室应知晓所选分析系统可能存在的干扰因素。注1:常见的变异及衍生血红蛋白对HbA1c测定的影响参见/factors.asp。注2:多数POC(point-of-care)方法的精准性不能满足临床需求,目前不能用于糖尿病的诊断。,IFCC参考方法,特异测定HbA1c：-链N-缬氨酰-1-果糖基血红蛋白（HbA1c）,测定HbA1c国际公认的参考方法为IFCC推荐的高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳。测定方法主要分为三步:1、首先制备溶血液;2、采用蛋白内切酶Glu-C将溶血液酶解消化,得到糖基化和非糖基化的链N 末端六肽(HbA1c六肽 HbA0 六肽);3、采用高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳对HbA1c六肽和HbA0 六肽进行定量分析。,参考方法流程,HbA1c测定指定比对方法(Designated Comparison Method,DCM),1、美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)使用离子交换高效液相色谱法为参考方法,目前为HbA1c测定的指定比对方法。方法原理主要基于HbA1c与其他组分所带的电荷不同,分别洗脱检出,由于受技术条件的限制,不能特异测定HbA1c,有其他组分同时检出,因此,测定结果高于IFCC结果。,NGSP高于IFCC,IFCC参考实验室及NGSP参考实验室经过几年的比对,得出结论:NGSP测定结果与IFCC测定结果之间存在非常确定的相关性,可用回归方程表为:NGSP-HbA1c =0.0915 (IFCC-HbA1c)+2.15%(r2=0.998),因此,现行的NGSP结果可以溯源到IFCC参考系统,即可以溯源到溯源链的最高等级国际单位(SI单位)制。,2、另外还有两个HbA1c测定的指定比对方法,一个为日本的KO500方法,另一个为瑞典的MonoS方法。三个指定比对方法测定结果与IFCC测定结果之间存在非常确定的相关性,皆可用回归方程表示,方法特异性从高到低的顺序依次为:IFCC方法、瑞典方法、日本方法、美国方法,因此,测定结果从高到低的顺序依次为:美国结果、日本结果、瑞典结果、IFCC结果。,IFCC 结果与比对方法结果的转换,IFCC与指定比对方法结果之间的关系,HbA1c-NGSP = 0.0915 HbA1c-IFCC + 2.15% (r2= 0.998),IFCC 结果与比对方法结果的关系,IFCC参考系统的地位及应用,IFCC参考系统是HbA1c测定标准化唯一有效的参考系统。厂商应提供可溯源至IFCC参考方法的证明。,NGSP单位(% ) / IFCC (mmol /mol)的双重报告,NGSP&IFCC 溯源性证书,6.2 分析系统性能指标6.2.1 报告结果以“HbA1c”或相当于“HbA1c”报告结果。6.2.2 精密度室内变异系数(CV)小于3%,以小于2%为宜。注1:目前许多测定方法的室内CV 小于2%。注2:只有控制室内CV 小于2%,才能实现室间CV 小于3.5%。注3:HbA1c测定质量目标:小于0.5% HbA1c。,6.2.3 精密度实验方法分别采用不少于两个水平的质控物或样品(高、低值),每天测定两次(两次时间间隔不少于两小时),每次重复测两个结果,测定20个工作日,以20个工作日的80个结果计算平均值、标准差及变异系数。,6.2.4 正确度与可接受参考值的差值在0.5% HbA1c范围内,以控制在0.3% HbA1c范围内为宜。正确度验证方法,包括但不限于以下方式:参加室间质量评价(能力验证)计划;采用适当的有证标准物质;与运行经过认证分析系统的有资质实验室的测定结果进行比对。只有无法得到验证实验方法的其他替代材料或过程时,才宜使用厂商产品校准物或正确度控制物。,6.3 分析系统使用6.3.1 实验室在准备使用一个新的分析系统(或新仪器、新试剂)测定临床样品前,应对系统性能进行验证。6.3.2 使用经过认证的分析系统,如厂商给出的性能指标不符合6.2要求时,应对系统性能进行验证; 符合6.2要求时,只验证正确度即可。6.3.3 使用未经认证的封闭系统或开放系统1,应对分析系统性能进行充分验证,性能指标除6.2要求外,还应包括干扰因素、测量范围等。6.3.4 不宜使用组合系统2。注： 1 试剂和校准物来自同一厂商,仪器另选。 2 试剂、校准物和仪器分别来自不同厂商,由实验室自己组合。,实验室管理文件的基本内容,实验室应认真实现质量管理，按照相关标准做好实验室管理文件：,管理文件至少应包括以下基本内容：,ISO 15189医疗机构临床实验室管理办法（卫医发（2006）73号）临床检验操作规程编写要求（WS/T227-2002）厂家的操作指南等,人员要求质量控制要求检测系统操作规程样本采集、样本处理和储存结果报告仪器和试剂实验室生物安全记录,7.实验室应制定标准操作程序,至少包括以下内容: 项目名称; 方法学原理; 样本(采血管/抗凝剂、储存); 校准程序(校准日期间隔、校准方、校准方法); 室内质量控制程序(参见附录C); 样品的测定程序; 干扰因素; 参考区间(范围); 试剂; 色谱柱(可测定样品数量,适用于使用色谱柱的方法); 维护程序。,室内质量控制,室间质评：测定质量的监测,室间质量评价（能力验证，PT）计划是目前验证实验室测定结果是否具有可比性的有效手段:室间质评样品应与临床样品同样对待,是实验室质量改进的积极组成部分,保证HbA1c检测质量,实验室从四个质量环节保证HbA1c测定结果质量：,选用一个可靠的分析系统，其测定结果应可溯源至IFCC参考系统,规范化操作，整个检测过程应严格按照标准操作规程进行,知晓HbA1c检测的干扰因素,参加室间质量评价：目前为止国际通用的评价实验室测定结果可靠性从而改进检测质量的有效手段,HbA1c报告现状,HbA1c的结果报告还没有实现全球标准化SI (mmol/mol)及NGSP (%)mmol/mol英国 意大利 德国 荷兰加拿大 澳大利亚 新西兰美国报告NGSP (%)单位及eAG（估算的平均血糖）我国有几种报告方式NGSP (%)NGSP (%)+ eAGmmol/mol+ NGSP (%),NGSP与IFCC,2007年: ADA、EASD、IFCC、IDF联合声明：HbA1c检测结果将在全球范围内标准化，包括参考系统和结果报告全新的IFCC参考系统是HbA1c检测标准化唯一的参考系统在全球范围内，HbA1c结果应采用SI单位（mmo/mol）以及NGSP单位（%）单位共同报告,结果报告,8.1 单位以NGSP的传统单位%HbA1c报告糖化血红蛋白测定结果,并同时报告IFCC的国际单位制单位(mmol/mol)结果。NGSP的传统单位与IFCC的国际单位制单位换算的回归方程为: HbA1c(NGSP)=0.0915HbA1c(IFCC)+2.15%(适用范围为:4%HbA1c-12%HbA1c)。以%HbA1c为单位的结果小数点后保留1位小数。如临床需要,应提供方法学名称。,8.2 参考区间HbA1c源于DCCT/UKPDS3)的参考区间为4%HbA1c -6%HbA1c(20 mmol/mol-42mmol/mol),实验室应对此参考区间进行验证,如不适用,应建立适用于自己实验室的参考范围,并在报告中注明。,7.4 异常结果的处理7.4.1 对于测定结果低于参考区间下限或高于15%HbA1c(140mmoL/moL)的样品应进行复查,并与临床医生沟通。7.4.2 对测定结果与临床表现不符的样品应进行进一步检测。,无论你的实验室采用什么方法检测HbA1c，都应该认真学习Hb变异体对HbA1c检测结果的影响。选择HbA1c检测产品时，一定要详细了解具体的资料，阅读厂商提供的说明书。使用免疫方法或酶法检测HbA1c的实验室，最好能另外具有诸如离子交换HPLC的产品。它将在确定有无Hb变异体时发挥作用。对于正在使用离子交换HPLC的实验室，应有诸如免疫方法或酶法的产品备用。一旦在层析图上出现确定为Hb变异体时，使用其他方法比较，并应及时与临床联系。检查患者的糖化白蛋白、近期使用血糖仪自我监视的资料和临床表现等，防止发出错误报告。,针对我国情况，还有很多经济欠好的地区。特别要注意因营养不良、近期有出血事例、近期有输血的过程等。因为这些均会影响红细胞的寿命。对于这样的患者不应使用HbA1c作为糖尿病诊断或监视的指标。应该采取糖化白蛋白、果糖胺、以及直接葡萄糖检测等项目替代，方能避免错误诊断和延误治疗。,HbA1c的结果的干扰,非方法学特异的干扰因素,红细胞生存周期的异常：缩短红细胞寿命的疾病使结果降低 溶血性贫血、大量失血、脾肿大、风湿性关节炎、慢性肝脏疾病等。引起红细胞寿命增加的疾病使结果增高脾切除、再生障碍性贫血、缺乏维生素B12、肾损伤等。,血红蛋白病：特殊的变异血红蛋白干扰测定结果目前许多测定方法可以在一定程度上克服大部分常见的变异血红蛋白的干扰,但仍有特殊的变异血红蛋白干扰测定结果。药物：维生素C和维生素E使结果降低，乙酰水杨酸盐、慢性麻醉剂、羟基脲等使结果升高特殊时期：妊娠时血容量增加, 结果假性降低。,非方法学特异的干扰因素,疾病状态：黄疸、高脂血症，使结果假性升高进展迅速的1型糖尿病，HbA1c不能真实反映急性血糖变化情况,测定结果假性降低其它因素：种族和年龄,非方法学特异的干扰因素,方法学特异的干扰因素,血红蛋白病：-变异血