分子生物学复习

转录、逆转录及翻译的比较,小 结,DNA重组/ 基因重组,利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。,DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆,将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。,（一）基因（gene） 基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（genetic engineering） 基因工程 有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为:,2.利用相同的酶切位点双酶双切点（定向克隆） 优点（1）避免载体/目的基因的自身环化；（2）可控制外源基因插入方向。 （3）单拷贝插入。（4）提高连接效率 构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoR，Pst酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。,核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。,探针：用于检测的带有标记的已知核苷酸片段。,核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。,探针：用于检测的带有标记的已知核苷酸片段。,五、分子杂交的过程,1、印迹：把待测的DNA或RNA 转移到固相支持物上的过程。,Southern印迹：转移DNA。,Northern印迹：转移RNA。,Southern blot,提取基因组DNA定量：1 OD260=50 gDNA酶切进行1%琼脂糖凝胶电泳,正常人,病人,按分子大小分离,变性：NaOH中和：Tris.cl （pH 8.0）中和强碱,转移到固相支持物上,虹吸法电转移法真空转移法,Northern blot,提取RNA,注意事项：,避免外源性RNase的污染,用新的离心管等都是的，高压灭菌的干净的玻璃器皿戴手套操作试剂用DEPC处理的高压灭菌的三蒸水配试剂 0.1%焦碳酸二乙酯（100 ml水中加入0.1 g）,37 过夜后,高压灭菌,避免内源性RNase的污染,应用RNase抑制剂：RNasin（特异性抑制剂）应用蛋白变性剂：酚、SDS、氯仿其他：硫氰酸胍，异硫氰酸胍（非特异性抑制剂）,RNA定量,定量：1 OD260=40 gRNA纯度：OD260/OD280 1.8完整性：电泳,完整,部分降解,全部降解,28s 18s 5s,变性电泳,1%琼脂糖甲醛变性电泳： 1%琼脂糖30 ml，60 时加入1.62 ml甲醛原液 （37%），再加入EB，灌胶，走电泳。甲醛可使RNA局部的双链打开,二极结构解体,泳动时严格按照分子质量大小分级.,转膜：任选一种固定保存备用,探针标记,探针：用于检测的已知核苷酸片段。探针种类：,基因组DNA探针：酶切基因组DNA，得到某个片段； 克隆化的各种基因片段。 含内含子，不适用Northern杂交,cDNA探针：只含外显子，Southern、Northern都可用。RNA探针：单链，不用变性，特异性高，本底低，但易降解。寡核苷酸探针：人工合成的一小段核苷酸序列，15-30 bp，简单， 杂交时间短，适用于点突变分析， 但标记物掺入少，灵敏性差。,标记方法,切口平移法,得到的探针是片段,注意事项：,一定是32P，因为掺入的是位的P，而不是、位的P。用DNApol（不能用Klenow片段，因为没有5 3外切活性)DNase浓度：太多,易切碎;太少片段大,但标记物掺入率低。反应温度：14-16 。标记的是双链。,随机引物法,随机引物：4种碱基按照6或8个长度随机组合得到所有寡核苷酸片段。,得到的探针也是片段，其长度与随机引物的长度有关。,注意事项：,标记的链是新合成的链，对母链没有进行标记。避免了DNase加入量的不确定。现用现标，不要放置时间过长,因为高放射性破坏DNA链。可标记双链、单链DNA或RNA。,3末端标记法,标记的是双链，不破坏完整性。,（酶切后必须是3凹陷）,注意事项：,根据不同的酶切位点选择不同的标记核苷酸。 例如：EcoR位点 5GAATTC 3CTTAAG不能用于3凸端的DNA标记。一般两端标记，否则标记量太少。,5AATTC,3TTAAG,5末端标记法,5,3,3,5,碱性磷酸酶,-32P-ATPT4DNA激酶,注意事项：,只能选-32P-ATP，供能。要求DNA纯度高，末端不能包裹蛋白。,聚合酶链反应(PCR)是 80年代中期发展起来的 体外核酸扩增技术。它 具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出 优点；能在一个试管内 将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小 时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观 察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个 细胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,六、引物的设计原则,引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。,引物设计好坏与PCR结果密切相关,1、引物长度,一般为15-30个核苷酸，一般为2027mer。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,2、 （GC）含量,GC含量一般40-60%，一般 50%。引物Tm值一般要求：55-65。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性；GC含量太高也易于引发非特异扩增。,3、 碱基的随机分布,A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布同一碱基连续出现不应超过4个,4、引物自身不应存在互补序列,引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。,ATACAGT GTAT,5、两引物之间也不应互补,尤应避免3端的互补，以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。,6、引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。,7、引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。5端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,8、引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70。,9、上游引物与模板一致，下游引物与模板互补,5ATCGAT CGTAA 3,上游引物：,5ATCGAT 3 20mer,下游引物：,5TTACG 3 20mer,1、引物长度,一般为15-30个核苷酸，一般为2027mer。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,2、 （GC）含量,GC含量一般40-60%，一般 50%。引物Tm值一般要求：55-65。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性；GC含量太高也易于引发非特异扩增。,3、 碱基的随机分布,A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布同一碱基连续出现不应超过4个,4、引物自身不应存在互补序列,引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。,ATACAGT GTAT,5、两引物之间也不应互补,尤应避免3端的互补，以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。,6、引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。,7、引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。5端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,8、引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70。,9、上游引物与模板一致，下游引物与模板互补,5ATCGAT CGTAA 3,上游引物：,5ATCGAT 3 20mer,下游引物：,5TTACG 3 20mer,四、基因表达调控的研究技术（一）核蛋白的制备（二次裂解提取核蛋白）,上清是胞浆蛋白沉淀是细胞核、细胞骨架,胞浆蛋白溶出,离心收集沉淀,收集上清 （ 含核蛋白）,破核膜 （NP-40打孔、高盐溶解）,破胞膜,电泳迁移率改变分析（ electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA ）1.原理: 同位素标记的DNA片段与核蛋白提取物孵育一定时间,用电泳检测,当蛋白质与DNA片段结合后,分子量远远大于游离的核苷酸片段,其电泳迁移率下降,出现滞后条带。,Free probe,DNA-蛋白质复合物,2.目的： 1）可检测目的基因调控序列是否存在反式因子的结合位点。 2）可检测核内是否存在与顺式作用元件结合的反式因子。3.基本过程: 1) 提取核蛋白 2) 合成探针: 合成所需的顺式作用元件(8-12bp的DNA片段) 3) 标记探针: 末端标记(37,10分钟) 4) 结合反应: 核蛋白+标记探针室温反应30分钟 5) 电泳: 高压电泳,低温下进行 6) 放射自显影: -70,注意事项:探针不宜过长, 200bp必须做竞争抑制实验核蛋白用量适中,一般 25ug体系中加入dIdC 或鲑精DNA探针用量1.0ng电泳缓冲液的离子强度不能太强电泳要在低温进行,报告基因分析 报告基因: 编码可供检测的酶与蛋白质的基因。 可作为报告基因的条件: 编码产物的活性不受宿主细胞的干预。 编码产物在宿主细胞中不存在, 易于区别。 编码产物的活性的测定必须具有快速、简便、 灵敏度高、重复性好的特点。 常用的报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、 -gal、荧光酶基因(Luc),原理 ： 将顺式元件插入报告基因的上游, 导入细胞，检测报告基因的活性，证明顺式元件是增强子还是启动子。,报告基因,插入的顺式元件,载体类型：1）basic 载体：不含 P/E, 用于检测启动子活性2）control载体：含启动子，用于检测增强子或 沉默子的活性。实验技术： 基因重组 转染细胞 产物检测,DNase 足纹法： 是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点的实验方法。原理及操作过程： DNA结合蛋白与其特异的DNA序列结合，可保护其结合序列免受 DNase 的作用。,首先将待测双链DNA片段中的某一条单链的一端进行标记，然后用适当浓度的 DNase 与其作用，使DNA双链上形成随机的切口，经变性电泳分离和放射自显影后，在X光片上可见只差一个碱基的梯形DNA条带。但当DNA结合蛋白与标记的DNA作用后，结合的序列未受DNase 的作用，因而在放射自显影图谱上就形成一个空白区。,2. 注意事项：1）DNase I 消化后，需要充分除去反应中的蛋白质。2） DNase I 的用量是关键，其 终浓度为0.11.0 ug /ml。3）核蛋白提取物最好进行部分纯化。4）确保只有一条链的5 或3 端被标记 。5）进行化学测序可直接读出被结合的精确序列。,甲基化干扰足迹法 甲基化干扰法原理与DNase 足纹法正好相反，即DNA先用甲基化试剂进行随机修饰，然后用DNA结合蛋白与此DNA进行结合反应，由于被修饰的DNA结合位点，不能与DNA结合蛋白结合，这样就可以分离并回收结合和未结合蛋白的DNA，并用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，而结合蛋白的DNA由于未被修饰而不能被切割，但结合位点外的被修饰区域仍有切割，这样结果与DNase 足纹法相同，在结合位点形成一个空白区。,染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP） 是一种在