快速胶体免疫层析法检测临床应用

胶体-金-免疫层析法检测在医学实验室应用的需要注意若干问题,王洛平 ,2015-10大兴区质控中心专项,1,免疫标记学可追溯到60年代。随着新理论涌现、单克隆技术与纳米工艺开发，70年代以胶体金为代表的标记免疫分析技术突起，迅速进入实验室常规工作中，成为继酶免放免荧光免疫三大技术之后，又一个庞大的试验技术应用体系，其产品广泛用于健康体检，流行病学调查，临床疾病快筛筛查，酒驾测试，毒品检测，食品安全检测等方面，,2015-10大兴区质控中心专项,2,发展历史, 基层医院实验室或者大型医院门诊部为满足临床患者急迫 诊疗需要，采用胶体（金/硒）免疫层析法检测 基于胶体金免疫层析法属于定性实验（无室内质控，有些 用仪器半定量结果表达）范畴，灵敏度无法与定量实验比 较，检测低水平抗原或抗体有时会发生漏检，目测方法会 受到实验室光线影响等干扰，容易产生一些假阴性或假阳 性结果 如何做好技术防范？,2015-10大兴区质控中心专项,3,使用现状,1、乙型肝炎表面抗原检测试纸卡2、HIV（1/2）抗体检测试纸卡3、潜血（Hb）检测试纸卡4、轮状病毒（F-RV， A群）抗原检测试纸卡5、HCG检测试纸卡6、降钙素原（PCT）检测试纸卡7、甲/乙型流感病毒抗原检测试纸卡、达百种,2015-10大兴区质控中心专项,4,临床实验室胶体金检测条（卡）常用种类,2015-10大兴区质控中心专项,5,产品种类之一,认真阅读产品说明书，了解方法学种类熟知产品检测灵敏度及时告知临床方法局限性：限于初步筛查； 限于操作人员判断经验；限于单一项目检测,2015-10大兴区质控中心专项,6,检测原理,快速诊断技术之一：免疫胶体金免疫层析分析检测 (colloidal gold immunochromatography assay, GICA ) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术 有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法见下面图示3-5,2015-10大兴区质控中心专项,7,方法学图示,胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。,2015-10大兴区质控中心专项,8,衬板,样品垫,金标垫,吸收垫,膜,胶体金免疫层析试纸条的构成,图示1,2015-10大兴区质控中心专项,9,标本处理后，加样行进方向,图示2,2015-10大兴区质控中心专项,10,夹心法反应原理,C 阴性,B 阳性,图示3,2015-10大兴区质控中心专项,11,间接法反应原理,C 阴性,B 阳性,图示4,2015-10大兴区质控中心专项,12,阳性,弱阳性,阴性,竞争抑制法反应原理,检测线颜色强度与SD（磺胺嘧啶）浓度负相关,图示5,2015-10大兴区质控中心专项,13,抗原/抗体检测试纸卡 两条（红或紫或绿）线， 阳性 一条线， 阴性 无线， 实验失败或试纸失效,2015-10大兴区质控中心专项,14,结果判定,2015-10大兴区质控中心专项,15,GICA优势,GICA确实是一种便捷检测方法，具有简单快速、通过肉眼或小型台式仪判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、无污染、携带方便等优点,限于初步筛查限于操作人员判断经验限于单一项目检测，目前已有组合项目试条出现，如甲/乙型流感病毒检测,2015-10大兴区质控中心专项,16,GICA技术问题,最大问题：没有室内质控，其结果解释只作筛查，不作疾病诊断依据， IQC质控豁免试验。提醒临床多结果核对，例如血常规，CRP，PCT，室间比对：卫生部或北京市临检中心发已知仪器结果质控品，各家发回结果给予EQA评价,2015-10大兴区质控中心专项,17,室内/室间质控,术前或孕期12周检查或创伤输血： 艾梅乙检查已纳入必检项目，择期手术或正常孕检标本可采用EIA或MEIA或ECL方法上机检测 急诊情况，快速筛查使用试条检测，如筛查结果是阴性，血清学仪器复检结果是阳性结果，临床大夫问：是否存在实验室检测方法学问题 回答：肯定会这种情况，方法学自身局限性问题,2015-10大兴区质控中心专项,18,案例一,HIV（1/2）抗体检测试条,1513-1514阳性?（胶体硒法）,1513-1514阳性（胶体金法）,2015-10大兴区质控中心专项,19,2015-10大兴区质控中心专项,20,仔细观察后！,案例二,某公司便潜血检测试条,HGB检测浓度: 试剂标定灵敏度0.2ug/ml(检测范围0.22000ug/ml=0.00020.2g/L)换算公式: 1ug/ml=0.000001g/0.001L=0.001g/L判定： 预试验0.2ug/ml根本肉眼看不出。所以科室要求只要看见检测线就报阳性,HBsAg检测试条,曾验证4家市场上最常用试条检测灵敏度实验发现，仅美国雅培试条能检出说明书标定检测灵敏度，其他试条均捡不出,2015-10大兴区质控中心专项,21,案例三,轮状病毒抗原检测试条,曾收集150例婴幼儿腹泻便标本，进口试条快筛获得阳性与阴性结果，再经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法检测轮状病毒基因组RNA，发现阴性标本中有3例C群轮状病毒血清型阳性均为A群轮状病毒血清型，感染人群中主要血清型,甲型/乙型流感病毒抗原检测试条,市场上最常用产品标注：甲型流感病毒：Flu A (A2/Aichi/2/68,H3N2)乙型流感病毒：Flu B (Hong Kong5/72)事实上，流行毒株 Flu A有16个亚型； Flu B 有5个亚型；检测阳检率与流行株 紧密相关,2015-10大兴区质控中心专项,22,解决对策(1-1),方法学互相补充,多种方法（厂家）验证必要时复查（尤其遇到临床对阴性结果质疑）或多次不同批号试条核查HIV抗体检测流程为典范,2015-10大兴区质控中心专项,23,以CDC结果报告临床,2015-10大兴区质控中心专项,24,解决对策(1-2),质疑时，双法验证,解决对策(2),产品选购目标,改良最好结果是用仪器测定，去除人为干扰。例如PCT，用血清50ul或全血75ul；性能指标与临床意义：检测范围 0.1-100ng/ml灵敏度 0.1ng/ml参考范围：0.5ng/ml,仪器法参考性强,2015-10大兴区质控中心专项,25,免疫方法学遇到技术问题，在这一技术领域几乎都能遇到，须事先想到：例一 便潜血试条：柏油便阴性，抗原过多后带现象，稀释后再做 为强阳性例二 肺炎支原体试条：自身免疫型疾病患者可能出现假阳性干扰例三 Flu A/B试条：取材不足，假阴性。临床质疑，可以重新再送 一次，反复多次例四 工艺问题： RV一盒试条多一半无C线，更换批次正常； 潜血检测两家医院结果不一致，更换批次一致,2015-10大兴区质控中心专项,26,解决对策(3),项目操作规范一致性培训无论如何开展正式实验前，须让全体参加发报告的检验人员每人操作一遍，最好能覆盖阳性与阴性标本目的：发现纠正个人习惯性操作与随意性，防止造成边缘性结果有出入。例如使用移液器手法；重要试剂从冰箱回到室温时间；目测判断标准；观察结果时间（计时器定时）,2015-10大兴区质控中心专项,27,解决对策(4),与临床经常沟通，检验项目手册告知该方法检测结果可靠性，强调临床质疑可复检（更换批次！）强调低浓度抗原或抗体，因其检测下线灵敏度受限：1）报告注明：XXXXX试验筛查2）建议临床多次开单复检，便潜血3）关注流行季节特点：RV试条或Flu A/B试条4）重要检验项目，须同时进行同期预留标本血清学检测， Anti-HIV或梅毒特异性抗体/RPR5) 4周后血清抗体复查,2015-10大兴区质控中心专项,28,解决对策(5),中小型实验室，尤其民营医院，仪器设备受限，人员技术