【毕业学位论文】（Word原稿）拟除虫菊酯降解菌株分离及生化分子基础研究生化与分子生物学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 拟除虫菊酯降解菌株分离及生化分子基础研究 o: 要 本试验从常州农药厂排污口所采的土壤样品中分离得到了一株生长快，菌落规则，传代稳定，降解能力较高的细菌菌株，并对其进行了生化、分子生物学基础研究，结果如下： 据 6S 列分析，初步 鉴定为： 不动杆菌），该菌株在农药降解和微生物修复方面还未见正式报道。因此， 4对该菌株及其相关性质的研究具有原创性。 该菌株为革兰氏阴性 ，能以拟除虫菊酯、有机磷等多种农药为唯一碳源，具有广谱性 ； 生长温度范围较广， 4、 50时， 菌株仍具有一定的生长能力 ,最适生长温度为 28 ； 定 有明显变化 ，最适生长 对农药的耐受浓度可以达到 0.5 g/L， 最适生长的农药浓度为 0.2 g/L； 40.2 g/L） 28、 180 4 高效氯氰菊酯降解率为 三氟氯氰菊酯为 46，溴氰菊酯为 联苯菊酯为 共培养 108 h 时，对高效氯氰菊酯降解率为 三氟氯氰菊酯为 溴氰菊酯为 75，联苯菊酯为 对其酶学性质做了研究。结果表明：该降解酶属于组成型胞内酶，在 解酶对高效氯氰菊酯的降解率均在 45左右，最适反应 为 4与 50温 度条件下与高效氯氰菊酯保温 8h，降解率在 25左右，最适反应温度为 30；在最适反应温度和 件下，降解酶粗酶液与高效氯氰菊酯保温 8h，其降解率为 78。 粗酶液经丙酮沉淀， 胶层析和 离子交换层析分离纯化。凝胶层析中降解酶的洗脱体积大约在 70 90 离子交换层析中，降解酶存在于含500 洗脱液中。 泳检测结果表明：最终纯化的降解酶为单一蛋白组分，其分子量约为 55 粗酶液对 高效氯氰菊酯 的降解速率为每毫克蛋白 胶层析分离后降解速率为每毫克蛋白 离子交换层析分离后降解速率为每毫克蛋白 10.8 终的降解速率比分离纯化前提高了33倍。 选到 1株对高效氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯表现出良好的降解活性的重组菌株，提取重组质粒进行酶切鉴定，结果发现：插入的外源片段约 5 外源片段进行测序 ,将所得的部分序列登陆 基因片段与9%。但 族蛋白是否与拟除虫菊酯农药的降解有关有待于更进一步的分析研究。 关键词： 拟除虫 菊酯 降解酶 基因文库 n in of as of It is of to on by be by In a as 6S we of of as -D 6S It is to as a of pH 8 Its pH 0 , t on pH 9, on t of -D by 070 of its of in 00, it a an 5 103pH 0 of on 1 It 0.8 1 By -D as of is hs 9%. he hs be 录 第一章 绪论 . 1 . 1 . 2 . 3 . 7 . 9 . 10 第二章 拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力检测 . 11 料与方法 . 11 验材料 . 11 验仪器 . 11 剂与培养基 . 11 株的分离筛选 . 11 株的鉴定 . 12 株对农药降解率的测定 . 14 长曲线及最适生长温度、 . 16 果与分析 . 16 种拟除虫菊酯农药的 . 16 株的初步分离 . 19 株鉴定 . 19 . 25 . 26 . 29 第三章 拟除虫菊酯降解酶的初步分离及酶学性质的研究 . 30 料与方法 . 30 验材料 . 30 验仪器 . 30 剂 . 30 液 . 30 解酶在细胞上的初步定位 . 30 液的制备 . 30 除虫菊酯降解酶酶学性质的研究 . 30 白质含量测定方法 . 31 降解酶的初步分离 . 31 解酶分离产物的电泳检测 . 32 果与分析 . 32 解酶在细胞上的分布 . 32 白质含量标准曲线 . 33 V . 33 解酶分离纯化及 . 35 论 . 37 第四章 4株基因组文库的构建及重组质粒的筛选 . 39 料和方法 . 39 . 39 养基 . 39 验仪器 . 39 液及试剂 . 39 验方法 . 39 . 42 . 42 . 42 的片段与载体的连接、转化 . 43 . 44 组质粒对菊酯农药的降解 . 44 组质粒 1. 45 . 46 . 47 结 论 . 48 参考文献 . 49 致谢 . 54 作者简历 . 55 附 1：几种菊酯类农药的相关信息 . 56 附 2：发表文章 . 58 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 除虫菊酯类农药简介 早在二个世纪以前，人们就发现除虫菊花的提取物 然除虫菊酯是一类十分理想的杀虫剂。它有高效、广谱，对人畜十分安全，不污染环境，没有致癌、致畸和诱变等不良效应，在体内迅速降解等优点，因此不会发生积累中毒，但其持久性太差，药效维持不到一天，特别是见 光氧化分解，难以在田间使用（高永闯， 1997）。 在上世纪 20 年代，研究鉴定出其有效成分为除虫菊酯 I 和 六十年代中已经了解，除虫菊酯之所以易于光解，是因为它的结构上具有两个光不稳定的中心，一个在醇的部分，一个是在菊酸的乙烯侧链上的偕二甲基。 1973 年 他的同事们用苯氧基苄醇取代了除虫菊的醇部分，以氯取代了偕二甲基，形成了一个残效期长的拟除虫菊酯（ 振祥， 2002）。它的光稳定性是天然除虫菊酯的 10 100 倍，这是第一次成功地合成的能 应用于大田的拟除虫菊酯类杀虫剂。从此，开拓了探索对光解稳定的、残效性长的拟除虫菊酯类杀虫剂的道路。 1974年日本的 学公司的研究人员 人发现环丙烷类拟除虫菊酯杀虫剂的功能部分是苯乙酸酯。不用环丙烷也能合成药效相当的拟除虫菊酯，并于 1976 年合成了光稳定性的商品拟除虫菊酯 氰戊菊醋，又称杀灭菊酯。它的毒效比二氯苯醚菊酯还高，这是由于在其醇的部分含有一氰基，据此合成了另一大类高效杀虫剂，如溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、功夫菊酯 (三氟氯氰菊酯 )等等。拟除虫菊酯克服 了天然菊酯持久性差，易光解这一致命缺点，但不幸的是，在克服这一缺点的同时，也没有天然菊酯那样安全 (王筠， 1997)。 人根据电生理特征，中毒症状，结构特点把拟除虫菊酯类杀虫剂划分为两个类型，即类型 I 和类型 型 I 包括天然除虫菊酯、无苯氧苄基醇的拟除虫菊酯 (例如丙烯菊酯、胺菊酯 )和无氰基的 3如二氯苯醚菊酯、 类型 含有 3如氯氰菊酯、氰戊菊酯 )。三者的毒性比较如下：无苯氧苄基的拟除虫菊 酯 溴氰菊酯 氯氰菊酯 氰戊菊酯 氯菊酯，即含氰基比不含氰基毒性大，有卤原子取代则毒性增加，且毒性随卤原子相对分子质量的加大而增加（王朝晖等， 1997）。而且，氯菊酯的毒性相对最弱，并且在环境中易于降解，主要应用于家庭害虫的防治，而氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯等毒性较高，在环境中也不易降解，在农业生产中应用非常普遍。 有关拟除虫菊酯农药残留转化和微生物降解早在上世纪 80 年代，部分科研工作者已经开始着手研究。 1988年， . 将土壤与拟除虫菊酯混合培养一段时间，分别隔 1月、2 月、 3月、 4月取出一定量的土壤，检测其中细菌、真菌、放线菌的含量，结果发现：细菌和放线菌与拟除虫菊酯的降解有密切关系，而真菌对之影响不大（ . et 1988）。并且 U. 球菌）；随后 et et 1988）从土壤中筛选分离了 状芽孢杆菌）， 光假单胞菌）和 无色菌）；近些年，我国陆续也有 衣芽孢杆菌）（丁海涛等， 2003）、 沟肠杆菌）和中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 8 虞云龙等， 1997）的报道。目前，有关拟除虫菊酯农药微生物降解工作主要集中在筛选菌株方面，已经筛选的菌株不仅数量有限，对拟除虫菊酯的降解率也不是很高。而且有关与拟除虫菊酯微生物降解相关的 建工程菌株等借助分子生物学技术更深一步的研究还未见报道。 拟除虫菊酯类农药的微生物降解和其它杀虫剂的微生物降解一样，其实质都是酶促降解。而且降解酶具有广谱性、耐受环境等优点。因此，有关拟除虫菊酯降解酶的研究也成为拟除虫 菊酯类农药残留微生物降解研究中的一个重点，它为蔬菜、瓜果、茶叶等农副产品和环境中拟除虫菊酯农药残留的清除提供一个新的思路和方法。然而在拟除虫菊酯降解过程中，是什么酶在起着关键性作用，又是如何参与到其降解过程中来的呢？ 1998年， . 微生物在纯培养条件下对拟除虫菊酯的降解途径做了深入研究。见图 1氯菊酯为例）。 图 1除虫菊酯微生物转化途径 of of by of 图 1氯菊酯微生物降解过程中，其代谢方式只有氧化和水解两种。在它的代谢产物中，有羟化代谢物，羟化代谢后与葡萄糖结合的产物；水解代谢产物，即二氯苯醚菊酸及二氯苯醚菊醇；水解代谢后的轭合产物；羟化代谢后又水解的产物或水解后又羟化的产物。氯菊酯的羟化部位有四个（标箭头处）。在这四个部位中，就是环丙烷上的两个甲基，与其它类似物相同，另外两个在间苯氧基苄醇上的，是新的氧化部位。溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、 杀灭菊酯都有这两个氧化部位。研究证明：除虫菊酯 虫菊酯 菊酯、溴氰菊酯等）氧化、水解同样重要。拟除虫菊酯是在酸的部分上两个甲基被氧化。但是对于一级醇的酯类，氧化代谢可能不是这样重要，因为酯解更容易发生。而且在好氧条件下，拟除虫菊酯农药的微生物降解中，氯菊酯最容易被转化，溴氰菊酯最难发生转化。在许多新的除虫菊酯类似物中，酯解比氧化更为重要，但氧化在酯解后仍然发生。 目前国内外有关降解酶的报道仅有两例： 1993 年 , 从 株中分离纯 化得到了氯菊酯酶，并且发现该氯菊酯酶属于羧酸酯酶，它的分子量大约 61 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 9 变性蛋白），为丝氨酸酶类（ et 1993）； 1997年，我国广州地球物理研究所的虞云龙等人从降解菌株 也分离纯化了氯菊酯酶，并对其酶学性质做了研究。研究结果表明并且该酶适宜的 、温度范围较广，酶活性不受 的影响，在 70、 20保存 3个月依然保持较高酶学活性。但是，以上两例研究都是以氯菊酯为反应底物的。有关该降解酶对氯氰菊酯等其它拟除虫菊酯的降解能力未 有正式报道。 究中存在的问题及发展方向 目前，对于农药微生物降解的研究方兴未艾。但是，大部分的工作还只局限于实验室，还不能完全使农药降解菌从实验室走向实际应用。这是因为：受农药污染的环境不能集中统一处理，尤其使受农药污染的食品不能进行有效处理；农药污染环境的化合物组成很不稳定，经常波动，对于农药降解菌的生长很不利，温度、 可能抑制降解菌的生长，直接从环境中筛选获得的农药降解菌降解速度慢，不能满足实际需要或经常发生变异导致降解能力的丧失、不能够继续降解农药；另 外，投放到环境中去的降解菌还会受到该环境原有菌落的影响，甚至受到拮抗而不能在该环境中长期生存，使农药降解菌在受污染环境中不能成为优势菌等。只有解决上述问题，才能真正实现利用农药解决农药污染环境的问题。 另外，早期环境中农药污染方面主要集中在 残留污染较为严重，除草剂在国外大量应用，再加上我国杀虫剂尤其是有机磷杀虫剂的大量使用。因此，可降解微生物的研究主要集中在以上几个方面。最近几年，由于 拟除虫菊酯类农药残 留问题而使得我国在进出口贸易方面频频遭遇“绿色壁垒”。于是，有关拟除虫菊酯类农药降解微生物的研究， 便成为国内外近期研究的热点。目前为止，国内外已经筛选得到的降解菌株的数量还不到 10株，相对于环境中丰富的菌种资源而言，菌株的筛选方面还具有很大的利用空间。而且目前已经公布的降解拟除虫菊酯类农药的微生物菌株降解效率不是很高，对于应用生产实践还有很大的距离。除此而外，也有部分科研工作者开始了有关拟除虫菊酯类农药降解酶的研究，但是其局限性很大，已经报道的两例菊酯降解酶都是氯菊酯酶，而氯菊酯由于其本身结构的原因，相对毒性不是很高，在环境中也易于降解，应用不像高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯等那么广泛，尤其是茶叶 、蔬菜等农副产品中主要是氯氰菊酯的残留。所以，分离筛选高效的拟除虫菊酯降解菌株并纯化氯氰菊酯降解酶来解决氯氰菊酯的残留问题显得尤为重要。 分子生物学迅猛发展为农药降解菌真正从实验室走向实际应用提供了可能，如何借助于分子克隆技术构建“高效农药降解菌”，从而提高降解菌降解农药的能力，增加降解菌净化环境的作用，这也是目前微生物降解技术的重点。常用的方法有（ 1）构建“超级菌株”。通过基因重组技术将不同降解农药质粒或降解农药基因构建同一菌株内，构建“超级细菌”，从而扩大降解菌对农药的降解范围，提高其治理效果，增强净化 环境的作用。有些研究者常常选择对自然环境更适应的极端微生物如嗜冷菌或地区优势菌作为基因工程的宿主菌，这样会使得降解菌在环境中成为优势，更有利于环境污染的降解和治理。（ 2）原生质体融合。如果两种微生物在共同存在时才能降解某种农药，单独存在时不能降解该农药，这时，可以采用原生质体融合技术融合 2种微生物，融合子就会具备 2个亲本的基因与优点。（ 3）降解酶或降解基因的改良。通常人们从自然界筛选的降解菌的降解酶活性较低，不能满足实际需要。可以通过定向诱变、随即突变、 组、酶的固定化技术等来提高其活性，以增强降解菌 对污染物的降解能力。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 10 究意义和目的 目前，分离筛选高效的拟除虫菊酯微生物降解菌株，获得相关降解酶。为尽快解决氯氰菊酯等菊酯农药的高残留、重污染问题已非常迫切。因此本试验拟从土壤中筛选出一株或多株具有自主知识产权、降解性能优良的拟除虫菊酯降解菌株 ,丰富国内外拟除虫菊酯微生物降解菌株的资源；纯化氯氰菊酯降解酶，通过分子生物技术手段，获得相关的基因片段。为构建出具有较高降解性能的工程菌株，生产酶制剂消除农副产品中拟除虫菊酯的残留，生产灵敏、快捷的检测拟除虫菊酯农药残留的生物反应器以及进行相关转基因操作奠定 基础。 解决拟除虫菊酯农药的残留及对环境的污染问题，不仅具有一定的理论意义也有很大实际意义。主要表现在以下几点：（ 1）满足国际、国内市场的需求。目前，我国大米、小麦、玉米等主要粮食作物的产量不同程度均出现供大于求的局面，国内市场基本趋于饱和，高产不高价，但与国际市场价格相比，却高出 10 70%。很明显，粮食基本上失去了贸易竞争市场。随着中国加入世贸组织后，这种冲击还会加大。畜产品、水产品、优质水果、蔬菜、茶叶和中药材等劳动密集型产业存在发展优势，制约其发展的因素主要是农产品的品质问题，比如风味、营养、农药残 留等问题，其中农药残留问题尤为突出，特别是在蔬菜、茶叶、水果、中药材等农产品生产中。国际市场对我国农产品的贸易壁垒将不再存在，而技术壁垒主要是农产品品质与卫生指标，尤其是农药残留则成为主要的限制性因素。对于国内市场，随着人民生活水平的提高，环保意识的增强，对无公害蔬菜、茶叶等绿色农产品的需求也越来越迫切。因此，如何解决蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留，提高其品质，生产更多的无公害蔬菜、茶叶等绿色农产品，已成为当务之急。农药残留微生物降解技术解决蔬菜与茶叶等农产品中的农药残留问题，且技术本身无毒、无二次污染。用 微生物降解方法解决农药残留问题也为绿色食品生产提供一条新的途径。（ 2）通过农药残留微生物降解技术在绿色农产品生产上的示范应用，探索出一条科技兴农和规模化管理的农业生产技术体系的新路子，使中国的农业生产与世界农业生产接轨，降低生产成本，提高农产品品质，增加农民收入，并在此基础上大力发展生态农业，保护生态环境，推动农业可持续发展（ 3）有利于解决日益严重的农业面源污染问题。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力的检测 11 第二章 拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力检测 料与方法 验材料 H 5，天为时代 常州农药厂排污口附近采集的土样 4份 验仪器 超声波细胞破碎仪（美国 台式高速冷冻离心机（德国 司）、低温冷冻干燥机（德国 司）、电热恒温水浴锅（北京六一仪器厂）、气相色谱仪（ C 德国 通摇床（购于中国科学院武汉科学仪器厂）、 500 双光束紫外 /可见分光光度计（无锡科达仪器厂） 剂与培养基 剂 丙酮、环己烷均为分析纯 药品。高效氯氰菊酯原药，工业纯、有效含量 溴氰菊酯原药，工业纯、有效含量 三氟氯氰菊酯，工业纯、有效含量 95；联苯菊酯，工业纯、有效含量 甲基对硫磷原药，工业纯、有效含量 95；二嗪磷原药，工业纯、有效含量95；辛硫磷原药，工业纯、有效含量 毒死蜱原药，工业纯、有效含量 97；乳化剂学纯（进口分装），购自广州市医药公司化学试剂玻璃仪器批发部。 农药原药用丙酮溶解 ,再加入 1倍体积的乳化剂 备成浓乳液形式使用。 10 1 50 葡萄糖， 25 ， 10 200 1 5 乙酸钾，冰乙酸 11.5 28.5 养基配方 1000 .2 g； .8 g； .2 g； .1 g；g； g； ( g； 固体培养基再加入 琼脂粉） 筛选培养基： 机盐培养基农药 全培养基（ 1000 0 g;蛋白胨 10 g；酵母粉 5 g；用 5 121高压灭菌 30 使用。 株的分离筛选 株的驯化培养 取 农药厂车间下水道长期受拟除虫菊酯类农药污染的污泥 4 份，分别拌匀，各取 5 g，在无菌操作条件下，制成 20的菌悬液，并加入适量灭菌玻璃珠，在 28、 180 床上振荡 68 h，静置一段时间后，按 5的接种量取上层菌悬液，接种到 30 药浓度为 0.1 g/L。置于 28、 180 隔 7的接种量将其转接到另一批液体筛选培养基中，相同条件下摇床培养 7d，且培养过程中农药的浓度逐步提高 ,每次提高 0.1 g/L，中国农业科学院硕士学位论文 第二章拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力的检测 12 驯化培养 1月。 株的分离纯化 取 驯化培养 1月后的培养物，稀释 10 6涂布于筛选平板上，农药浓度为 0.2 g/L，置于 28恒温培养箱中培养 72 h，选取在农药培养基中生长快，菌落规则，传代稳定的单菌落转入斜面保存，进行相关性能研究。 株的鉴定 选取生长迅速、性状稳定而且对各类菊酯类农药降解明显的菌株通过传统的显微镜技术、6S 培养过程中记录各个菌株的不同生长速度、形态和菌落特点，并在显微镜下观察。 革兰氏染色：用接种针挑取少许处于年轻菌龄的 菌苔，涂布于干净的载玻片上的一滴无菌水中，风干固定，用结晶紫的混合液染色 1 蒸馏水洗至无色，然后用碘液作用 1 洗、吸干，用 95的乙醇溶液脱色，至洗脱液无色（最好不要超过 30 最后用番红溶液染色 2 3 洗、风干，在油镜下观察染色结果。 按照 该系统指定培养基平板对待鉴定菌种进行预培养，在严格无菌条件下，取待测菌种的年轻菌苔，利用该系统配套溶液按指定浊度制备接种物悬浮液，将其接种于已经室温预热 10 96 孔微板中，在程序温度下培养微板 ,在 4 6h 和 16 24h 时，运行该系统软件中 序，在预热 30 阅读器上进行读板，利用系统菌库鉴定菌株种属。 6S 1）取培养过夜的菌液 1.5 8,000 上清 2）沉淀重悬于 500 3）加入 3 L（ 20 mg/蛋白酶 K， 30 L 10的 37保温 30 ）加入 100 L 5 的 分混匀 5） 13,000 0 取上清，并加入 异丙醇， 70放置 10 ） 13,000 0 70酒精洗涤沉淀，真空干燥。 7）沉淀溶于 20 入 3 L 20 mg/于 65保温 20 ）加入等体积的酚、氯仿各抽提一次， 13,000 ）上清加入 1/10 V的 淀 30 13,000 0）沉淀用 70酒精洗涤，真空干燥 ，溶于纯水经 脂糖电泳检测 6S 增 根据 16s 保 守 区 ， 设 计 引 物 ： F （ 5）， R（ 5。将提取好的 释 10板，按照如下反应体系及扩增程序进行 增。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力的检测 13 模板 L（ 200 5引物 1 L（ 100 ） 3引物 1 L（ 100 ） L（ 10 ） 10 20 5 L （ 2U/ L） 50 L 94 预变性 2 4 变性 1 52 退火 45 s 72 延伸 1 0 s 35 个循环 72 补充延伸 5 保存 将 琼脂糖检测、回收。 按下表所示体积进行连接反应 2 L （ 50 L（ 25 3 U/ L） 0 L 4过夜连接 受态细胞制备 1）从活化的 板上挑取单菌落接种到含 体培养基的试管中， 37摇床培养 4h 后以 1的比例重新接种于 37含 养基振荡培养 3 h，冰上冷却培养物至 0 2）将培养物倒入无菌的 1.5 心管中 3） 8,000 g ， 4离心 2 ）弃上清，收集菌体 5）用预冷的 700 L 0.1 浴 30 ,000 上清 6）加入 200 .1 悬浮菌体，即得感受态细胞，置于 4保存备用 注：以上操作均为无菌操作 中国农业科学院硕士学位论文 第二章拟除虫菊酯降解菌株的筛选、鉴定及降解能力的检测 14 接产物转化 1）将连接产物转入感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴 30 ）将 心管置于 42水浴中热激 90 s 3）迅速置于冰上，冰浴放置 5 ）加 800 L 液体 养基， 37， 20 5 ）向培养液中加入 200 L 涂在含有 B 平板上， 37培养 1216h 检查转化菌落 6）挑选白色菌落 组质粒的鉴定 （ 1）重组质粒的提取 1）