【毕业学位论文】（Word原稿）在人类上皮癌细胞A431细胞中PHGPx对细胞移行的影响-生物科技研究所

中华医事科技大学生物科技研究所 士论文 在人类上皮癌细胞 胞 移行 的影响 of on in 431 究 生傅怡翔 ( u) 指导教授 : 陈清俊 博士 (D.) 中华民国 一百 年 一 月 011 谢 首先要先感谢我的指导教授陈清俊老师，我从没当过专题生，一开始进来什么技术都不会，都是老师慢慢教我的。也要感谢成功大学黄晖升老师以及华医科大的陈璟贤老师给予本论文最佳的建议以及修正，使论文能更加完善。 想当初进实验室学姊刚好要毕业，什么都不会的我，有时候都不 知道该怎办，实验经验真的很重要，我觉得实验并没有简单困难之分，只有经验跟没经验之分，没经验的我一开始做最基本实验，所花之时间也是别人两三倍，但是结果又并不如意，不会还是会给自己打气，再做一次就好，在此还要谢谢卢宇秋学弟在实验室大大小小的整理以及给一些我没有的经验。 感谢家人在这两年多全心的给我支持，也要感谢各位同学以及学弟妹的帮忙。以前跟同学吃饭打球所有话题永远离不开实验主轴，有时候还会聊到要不要一起休学了，当然是开玩笑的，有这些朋友让自己抒发心情，又觉得困难没什么大不了了。 要感谢的人实在太多了，而在书写 论文时候指导教授指正，实在很感谢老师。谢谢各位这两年的照顾。 文 摘要 磷脂氢谷胱甘肽氧化酶 (身具有极强的抗氧化作用，目前已知它不仅可保护细胞膜免遭受过氧化的损伤，而且还可能参与细胞讯息传递的调控。基质金属蛋白酵素 9（ : ）属于 家族成员之一， 它与肿瘤的转移特别有关。研究指出几乎所有的癌细胞皆会有细胞移行的作用。 之前实验室的研究发现，在多种癌细胞中， 现皆有较高的趋势。至于本篇论文，主要在探讨癌细胞中大量表现之否与癌细胞的转移有关，而其机制又是如何？本篇所使用的细胞株有三：分别为 定型细胞株 (5)， 定型细胞株 (8) ，以及 定型细胞株 ()。 经由伤口愈合的实验发 现：当细胞大量表现 后的愈合能力明显比 降低 之细胞要来得快。另外，由 ， 量表现 的细胞其 的 表现量相对比细胞要来的高，此意味着细胞中的 量表现 时，所促使细胞移行加速的机制是需要透过 的表现方能达成 。至于 ，由于 结果显示其变化量不大，所以可以排除其与 成细胞移行加速之关系 。 在探讨作用机制方面， 当细胞额外 添加 然会导致 大量表现 细胞，其 细胞移行的能力会下降 ，但相较之下，细胞则下降的更加明显，由此说明， 促进细胞移行的作用是与其具抗氧化能力有关。另外，经由 iv 实验发 现 ，以 抑制素反应所需之麸氨基硫后，可观察到 量表现的细胞，其 能力会比 胞来的好。而 细胞，则其 能力会比 胞更差，由此说明，细胞中的 丧失抗氧化活性之下，也是能促进细胞的 力 。由于细胞移行时 必须要有结构蛋白的参与方能达成，所以此结果是否暗示了 能也属于细胞内的结构蛋白，因此当其大量表现时即会对 细胞移行有正向的帮助。 综合以上的结果，我们的结论是细胞中的 有促进细胞移行之作用，此作用的达成除了与 的表现有直接相关外，身具抗氧化能力与可能是结构蛋白的细胞功能也是促成的因素之一。 v of to of is to As in be an in In it in a of in In we In we In be . , so we 2of a on vi to we of on As of it to a on we on . it it be of 录 口试委员审定书 致谢 文摘要 文摘要 录 目录 写对照表 一章 绪论 前言 胱甘肽过氧化酶 ( 质金属蛋白酵素（ 胞移行 生理功能 验目的与设计 二章 材料方法 药品材料 宫颈上皮癌细胞 (培养 备 方墨点法 (三章 实验结果 量 /降低表现之稳定细胞株 量对细胞伤口愈合的影响 量对细胞转移表现的影响 量对细胞中 现量的影响 身的抗氧化能力对细胞移行之影响 促进细胞移行的能力是否与它本身即是结构蛋白有关 四章 讨论与结论 量 /降低表现之稳定型细胞株 量表现与降低表现对细胞的影响 胞中 表现量对细胞运动性 的 影响 抗氧化能力与协助细胞运动 之关系 现量与 以及 的关系 身是否也属于结构蛋白之探讨 考文献 表 录 果图目录 1 in 2 in 3 in 4 in 5 of 6 in 7 in 8 of in 9 of in 10 of in in 11 of in in 12 of 13 of in in 14 in 15 EM in 16 in in 17 on in x 缩写对照表 缩写 全文 2 2 5,52 R e - 12 - 第一章绪论 第一节 前言 知与细胞抗氧化作用息息相关 ( 1993; et 1996; et 1999; 1999 )。但除了抗氧化作用之外，文献上就很少有人发现 其他的功能角色。曾有一篇文献提及，多种癌细胞的 现量似乎都比正常细胞高出许多 (et 1999)，这 意味着 了在正常细胞中能扮演抗氧化的正向角色外，在癌细胞里可能也有其它未知的重要功用。 对于癌症而言 ，细胞是否已发生转移通常被用来做为分期的标准，而细胞发生移行作用又是转移的最初机制 (6 括癌症和心血管疾病 (T et 2010) 。细胞 移行在很多疾病是特有的特征，包含癌症和慢性炎症 (T et 2010) 。基于以上的关系，本篇研究主要在探讨，癌细胞中大量表现的 否会促使细胞移行加速，进而使癌细胞发生转移的机率大增。 本研究将 使用实验室所建立的三种稳定型细胞株来加以探讨，此三种细胞株分别是： 及细胞株。研究的方向除了会直接看表现量是否会影响细胞移行之外，我们还将分析造成此作用的原因是否是因 身的抗氧化能力造成，还是因它本身也属于结构蛋白质之一。另外，如何增进细胞移行的胞内机制探讨也将包含在本研究之中。 - 13 - 第二节文献回顾 A . 麸胱甘肽过氧化酶 (麸胱甘肽过氧化酶通常存在于动物的组织中，它能够减低细胞膜脂质过氧化 (1993) 的发生，亦能调节脂氧酵素 (活性 (1999)。人体中已知有五种它们的结构不相似，但共通点是含有微量元素硒 (1973 年的 明硒为组成 重要成分之一。典型的 )具有四个蛋白质次单位，而每个次单位中的活化端都含有一个硒原子 (et 1973)。 人体中的反应徒径极为复杂，但最重要的功用是在细胞中扮演防御的角色 (et 2004)。 除了 外， 族还包括血浆中的 粒线体与细胞质中的 以及主要位于细胞膜上的 一种强力抗氧化剂，而 度在人类治疗癌症病人有很大关系 ( et , 1999; M et 1998)， 经由 便把细胞内外许多部位所产生的 脂质过氧化物，还原成不具毒性的 是水 (1983; 1993)。至于 可再经由麸胱甘肽还原酵素 (原为 此在细胞膜表面， 藉由这些反应来对抗外来的过氧化氢，以达到保护细胞的功能(et 1993)。 - 14 - B. 硒 1957 年 实硒是生物必需微量元素，而且是一种多功能的人体必需的微量元素。硒具有抗脂质过氧化，保护生物膜的作用。硒是一种化学 元素 ，它的 化学符号 是 原子序 34，属 于 非金属 类，硒缺乏会造成硒蛋白质酵素的活性下降。例如：当血浆硒的含量过低时， 活性就会相对减少 (1988)。在人体中大多是以 或是 形式存在。硒最主要的功能是作为各种 且能直接影响其酵素活性及功能。 1973年 证实硒是 个必需组成成分。 1982 年 现一种位于膜上，具有 性，且可以用磷脂氢过氧化物作为基质的酵素 硒的另一种生物活性形式， 功能主要为抗氧化。 C. 基质金属蛋白酵素（ (一 ) 早被描 述与纯化的 在 1962 年 初， 从蝌蚪尾巴所发现的间质性胶原酶 (始 ( ., 1962)， 而后才被更名为 。文献上显示， 肿瘤发生有极大的关系，肿瘤要发生转移之前必须先降解细胞外的基质而 在原位增殖性肿瘤变成侵袭转 移 癌 的 演 进 过 程 中 ， 扮 演 着 极 重 要 的 角 色 ( 2009) 。 一种可分解细胞外基质(蛋白酵 素， 不管在正常或病态的细胞 中， - 15 - 它们都扮演着重要角色。文献指出，蛋白质水解酶出现在辅助基底细胞 (量比在恶性侵略的细胞为 多， 暗示 了 肿瘤细胞可能会引发基质细胞附近 的 蛋白质水解 酶被 制造 ， 更直接的说法就是肿瘤发生后会刺激正常细胞产生额外的胶原酶、基质溶素、以及明胶酶 A (., 2003)。至于侵略性的癌细胞则会增加它们蛋白水解的能力，而非仅增加蛋白质水解酶的制 造量 (1992)。 此外， 它们还可集中蛋白质水解酶作用于细胞外 围， 诱发它制造出更多种的蛋白质水解 酶， 以至基质能完全分解 (1992)。文献也显 示，在 癌症的发展过程中， 作用力会大于其被抑制 的效力，因此可导致 肿瘤细胞通过血管细胞 壁发生转移， 并可促使恶性肿瘤生长所需的血管得以增生 ( 2006)。 (二 ) , 9; , 9 , 9 之分子量分别为 72 92 于两种不同的明胶酶 (金属蛋白酶 ( 它们 可分解第与型基底层 ( 非纤维状胶原 质， 也可分解第型的胶原质、纤维结合蛋白 ( 型的短链胶原质、弹性蛋白以及金属蛋白酶 ( 2000)。 三种 比较表： 明胶酵素 A I; 72 - 16 - 明胶酵素 B , IV 92 2 金属弹性蛋白酵素 V; 2 献上提及 , 9 与癌症的关系非常多，以下列举几个例子： 研究指出当乳癌病患血中的 浓度增加时 ， 则 该患者预后会较差 (2010)。 研究指出 和 活性高低与头部和颈部癌正有关（ . et 2010） 。 研究指出在 在乳癌中会上升。 (. et 2010) 。 研究指出 加会促进睪丸生殖细胞肿瘤发生。(et 2010) 。 和 是启动多种癌症风险的关键角色之一，例如颈部癌与乳癌。 (. et 2010) 。 正常子宫颈组织的 表现多为阴性或弱阳性。可是 在子宫颈癌的表现率高达 (孙 , 2008)。 、 、 等蛋白质参与了黑色素瘤的 - 17 - 血管生成，其中 的作用尤其重要 (张 , 2005)。 食道鳞状癌组织中， 和 ， 明显高于癌组织旁正常粘膜组织的 ( P 二者在食管鳞状癌中的表现呈现正相 关， 且与癌组织的分化 程度、侵袭深度、以及淋巴结的转移密切相关 ( P (郑 , 2005)。 D. 细胞移行 斑马鱼 是目前在该领域最常被用于做研究的生物，由于其胚胎透明，所以可在高解析度快进摄影技术的帮助下，让人观察到细胞迁移的过程，并且可以利用 绿色萤光蛋白 (察细胞在斑马鱼体内的分布情况 (et 2006)。 细胞骨架的定义分为狭义和广义两种 ： 前者是 微丝 、 微管 和 中间纤维 的总称 ， 它们存在于细胞质内 ， 又被称为胞质骨架 ； 后者则再包括 细胞 外基质 ( 核骨架 (核纤层 (细胞骨架是细胞运动、胞器固定、细胞外型维持、细胞内讯息传导以及细胞分裂的基本物质之一 (et 2006)。 器官发生 损伤时会对基体造成部分细胞和组织的流失，所以基体必须要对损伤进行 修复 (修复的形式分为两种： 再生 和 纤维性修复 。这两个过程都涉及到细胞的迁移，例如：上皮组织中的鳞状上皮如果出现缺损时，其边缘与底部的细胞就会产生分裂及增生，并向缺损中心迁移。虽然很多细胞都具有分裂与再生的能力，但是它们 - 18 - 最终能否成功修复受损组织却要依赖 细胞外的基质 。举例来说，有一种细胞外的基质称为 透明质酸 (它存在于迁移细胞的周围时便能抑制细胞间的粘附，可促使细胞发生迁移作用 ( et 2007)。 细胞移行的五个步骤： 1. 2. 3. 4. 5. - 19 - 图 12007) 有关 细胞移行间的关系，已有文献明确地指出，呼吸道上皮细胞的修复机制中， 的表现与 细胞的延伸和移行作用有直接的关连性 (et 1999)。 此外， 也有许多文献点出，最重要或第一次的上皮细胞再生的发生，通常是先起于细胞的移行而非细胞直接增生 (1953; 1974)。另外，在快速重建的细胞结构中，细胞移行也扮演了重大的角色 (et 1996)。 身也 参与细胞的发炎反应、肿瘤侵袭以及转移。(F M, 1997; F 1998). - 20 - E. 生理功能： 于 族成员 之一，它的特点是 对于细胞膜上脂质过氧化的亲和力很高 (et 1995)，故被认为是细胞膜上抵抗氧化伤害的第一道防御系统 (et 1999)。在缺乏老鼠胚胎纤维母细胞中，其胞内脂质过氧化物的累积量会上升，而将细胞又暴露于高度氧化的压力下，则更会引发细胞的死亡(et 2003; et 2003)。 除此之外， 精子形成和运动方面也有关键性的角色， 以非酵素活性的形式，组成成熟 精子粒线体微囊的结构蛋白，而粒线体维囊是包装精子运动所需能量 特有结构。所以， 了可保护精子抵抗氧化的环境外，也成就了精子的运动能力 (et 1999; et 2005)。 有文献提到，过度表现 有效减少细胞内 脂质过度氧化，并抑制环氧酵素和脂氧酵素的活性，因此有利于减缓发炎的反应( 1993; et 1996; et 1999; 1999 )。 还原过氧化氢的活性较差，但是对于磷 脂氢过氧化物则具有较高的活性。此外，它也能够保护细胞免受氧化型低密度脂蛋白 (伤害，故对动脉粥样硬化具有预防的效果 ( 1994)。 - 21 - 第三节 实验目的与设计 一、 研究目的 由文献的汇整得知，大多数的癌细胞皆含有大量的 S et 1999)。而癌细胞之恶化程度与细胞是否会进行移行，并导致癌细胞发生转移有着密切的关系 (., 2010) 。 根据这两项事实的串联，于是我们假设细胞内的 量多寡可能与癌细胞会发生移行有些相关。如果假设确定，则将进一步去探讨 身除了之前所述与抗氧化有关之外，它是否还有其他未知的功能角色。 - 22 - 二、 研究设计 图 1验架构 三、 实验设计说明 研究将采 用本实验室先前所建立之受诱导而能大量或减低现的稳定型 胞株。首先会执行 确认细胞中的 量高低是否会对细胞愈合有所影响。接下来是2O2 EM SH - 23 - 以西方墨点法来观察细胞中的 及 之相关性，以深入探讨 细胞移行的影响机制如何。 假设胞内 量的高低的确会影响细胞的愈合，则第二阶段的 们将使用 及使用 间接抑制 抗氧化活性。藉 由处理，我们将可厘清 响细胞愈合的能力到底是透过其抗氧化的功能，还是由于它本身即是一种结构蛋白质所致。当然我们也会以西方墨点法来观察在 处理之下，细胞内 含量与 及 之表现量的相关性，以证实 如何去影响细胞的移行。 第三阶段我们将更进一步使用 去看细胞的运动能力是否真的和细胞内的 量有关，并 以前述同样的处理方式，来证明 响细胞运 动的机制为何。 - 24 - 第二章 材料与方法 第一节 药品材料 A 50% s s ,5 M s - 25 - X () () N,N,N,N - 26 - m) 22他： 脱脂奶粉 6, 24 , 10 cm 5, 50 ml - 27 - 第二节 实验方法 一、 子宫颈上皮癌细胞 (培养 胞培养在含有 10 % 养皿中，培养环境为 5 % 5 %空气，温度为 37 。当细胞长满时以 理细胞以执行继代培养。 二、 备 经过 g/ 理过之 使用 别加入 5 l/ 1置 15 分钟，将细胞刮下并使用 吸数次。接着以 12000 下离心 5 分钟。取上清液为细胞溶解液，冷冻于 用。 【药品试剂】 A. X : 20 g 0.1 g g g 加 去离子水 至体积 500 - 28 - 蛋白质浓度测定 测定原理是依据 et 1951)所发表之方法，先 配置 5种浓度的 浓度分别为 : 0、 体积 0.4 取 l 样品液加上 l 去离子水使总体积为 0.4 管先加入 2 液均匀混合，于室温下静置 20 分钟，再于每管加入0.2 N 之 s 荡混