【毕业学位论文】（Word原稿）利用酵母双杂交系统筛选与大麦黄矮病毒编码蛋白互作的短肽植物病理学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用酵母双杂交系统筛选与 大麦黄矮病毒编码蛋白互作的短肽 F 摘 要 禾 谷类作物的黄矮病是由大麦黄矮病毒 (称 侵染所引起的，在世界各国均有发生，由蚜虫进行 循环性的永久传播。大麦黄矮病株系的命名，是根据各株系特异或主要的介体蚜虫来进行的。我国特有的株系 麦二叉蚜和禾缢管蚜传播 ， 麦长管蚜和麦二叉蚜传播。病毒介体专化性强，仅局限于植物的韧皮部生长且细胞内病毒含量很低，目前还没有理想的方法来防治该病毒。 酵母双杂交系统（ 研究蛋白质间相互作用的一种有效方法。该系统能迅速、 灵敏 地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作，并可快速获得目的蛋白的编码基因， 近几年来 已在植物病毒学的很多领域得到应用。本研究利用 双杂交 系统筛选与大麦黄矮病毒系 的移动蛋白和外壳蛋白以及 系 的移动蛋白 互作的短肽，并对获得的短肽进行初步研究，为研究该病毒的致病机制，培育抗病毒小麦奠定基础。 本文 根据已知的大麦黄矮病毒 系 和 系的移动蛋白 (P)基因序列 以及 系的外壳蛋白 (基因序列分别 合成上下游引物，通过 增获得目的片段后 构建了酵母表达载体 于在酵母双杂交分析中 表达诱饵融合蛋白。 用 选 司的随机肽库，获得了两种和该蛋白互作的短肽， 分别为： 对这两种短肽进行了生物信息学分析，初步了解了其基本性质。然后利用获得的短肽和 转化酵母细胞， 没有检测到相互作用的发生， 同样的方法检测 没有相互作用的发生， 说明 这种互作是特异性发生在 筛选到的短肽之间的。有希望利用获得的短肽培育出短肽介导的抗病毒小麦。 关键词： 酵母双杂交，大 麦黄矮病毒，随机肽库，寄主与病原互作 is to be of In is a of at in be on of by is by to be to of be to of a to in of is to a or a be in is CR on of a NA to of to s on we we do So of be 目 录 第一章 引 言 . 1 第一节 文献综述 . 1 1. 酵母双杂交 .母双杂交系统的基本原理 .母双杂交的 特点与优点 .母双杂交系统局限性和改进 .母双 杂交系统的发展 . 酵母双杂交系统在病毒学 中 的应用 .母双杂交系统在病毒粒体分子结构和装配研究中的应用 .母双杂交系统在病毒核酸复制及基因表达调控研究中的应用 .母双杂交系统在病毒介体传播的分子机制研究中的应用 .母双杂交系统在病毒运动模式中的应用 .母双杂交系统在病毒致病机制研究中的应用 .母双杂交系统在病毒编码蛋白联系图谱研究中的应用 .定病毒蛋白与宿主受体蛋白间的相互作用 .定蛋白质之间相互作用的特定区域 .母双杂交系统 在基因组研究中的应用 10 3. 小结 11 第二节 研究背景及意义 . 12 第二章 构建酵母表达载体 . 14 1. 材料 . 14 种 14 剂 14 2. 方法 . 14 增 . .制备外源基因 .制备载体 .连接、转化、重组质粒的鉴定 17 3. 结果与分析 . 19 体的构建 .因的 增结果 .因的克隆和重组质粒的鉴定结果 .因的克隆和重组质粒的鉴定结果 .序列测定及分析 . 小结与讨论 . 23 第三章 酵母双杂交筛选 与诱饵蛋白 互作 的短肽 . 24 1. 材料 . 24 菌种 .试剂 . 24 2. 方法 . 24 随机肽库 滴度测定 .扩增 7购买的随机肽库 .酵母菌株 表现型鉴定 .酵母感受态的制备 .酵母共转化 . .扩增并从酵母中提取质粒 .检测短肽和 间的相互作用 . 结果与分析 . 30 操作流程 .酵母表现型的确认 .随机肽库 滴度 .随机肽库和 7增结果 .酵母共转化及 .再次共转化及重新确认结果 .对获得的短肽测序、分析结果 .筛选到的短肽和 互作用的检测结果 . 小结与讨论 . 39 第 四 章 主要结论 .考文献 . 41 致 谢 . 47 作者简历 . 48 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 第一节 文献综述 1. 酵母双杂交系统 蛋白质是生命功能的物质基础，体内包括复制、转录、分泌、信号转导、代谢等多种生命活动都依赖于蛋白 白 生命活动过程中蛋白质作用的研究有助于揭示生命过程的许多本质问题。但由于蛋白质与其他生物大分子间作用依赖于细胞内环境 ，作用时间及作用力差异极大，因而传统生化方法受到较大限制。酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。 酵母双杂交系统的基本原理 酵母双杂交系统是在 1989 年由 提出并初步建立 ， 该系统是在酿酒酵母 (研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法 (1989)。该系统最初是在人们对酵母转录因子 认识基础上建立起来的。一个完整的酵母转录因子 分为结构上可以分开的、功能上相互独立的两个结构域：位于 N 端1氨基酸区段的 合域（ 位于 C 端 768氨基酸区段的转录激活域（ 够识别位于 应基因（ 上游激活序列 (并与之结合。是通过同转录机 (的其它成分之间的结合作用，以启动 (吴乃虎 等， 1998)。 独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上较为接近时，则呈现完整的 录因子活性并可激活 游启动子，使启动子下游报告基因（ 以转录 (宫明 等， 2000)。将 已知的诱饵蛋白质 X 融合，构建出 粒载体；将 库，基因片段或基因突变体（以 Y 表示）融合，构建出 粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内进行表达。该酵母菌株含有特定报告基因（如 ），并且本身无报告基因的转录活性。蛋白质 X 和 Y 的相互作用导致了 空间上的接近，从而激活 游启动 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 子调节的报告基因的表达，使转化体由于 达而可在特定的缺陷培养基上生长。原理如图 1时因 达而在 在下显现蓝色。通过筛选阳性菌落即可检测已知蛋白间的相互作用、蛋白质二聚体的形成、确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点，以及从库中筛选与已知蛋白质 x 相互作用的未知蛋白质 Y 的编码序列等。 图 1酵母双杂交原理 he of 母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性，主要是由于：（ 1）采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。（ 2）信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。（ 3）杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子 合，此三元复合体使其中各组分的结合趋 于稳定。（ 4）通过 生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型， 白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交的 特点与优点 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点： (et (1) 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (2) 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 动 子 告基因 转录 Y D 动 子 告基因 Y 动 子 告基因 D 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 (3) 检测的结果可以是基因 表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 (4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建 库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 酵母双杂交系统局限性和改进 酵母双杂交系统是分析蛋白质 很多方面的应用，但仍存在一些局限性，人们也相应针对它的缺点进行了一些重大改进。 (1) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在 核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。为此人们初步建立了哺乳动物双杂交系统作为酵母双杂交系统的辅助手段 (， 1992)。另外还构建了 复系统 (， 1992) 和泛素专一性蛋白酶系统 (， 1992) 针对膜受体、细胞外分泌蛋白等方面进行研究。 (2) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是 假阳性 。由于某些蛋白本身具有激活转录功能（如 合酶 录激活因子）或在酵母中表达时发 挥转录激活作用，使 合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生 假阳性 的结果。为了解决这个问题， 人提出了建立在 合酶 录基础上的双杂交系统 (， 1997)。 人还构建了含三种不同的报告基因（ 酵母 株 (， 1996)，这三种报告基因分别受三种不同的启动子（ 控，而这三种不同的启动子都由 活，该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用，从而显著地消除假阳性。 (3) 某些诱饵蛋白质或待筛选蛋白质在酵母中大量表达时，可能对酵母产生一定的毒性作用，如使酵母体内的信号传导通路阻断，干扰酵母中正常基因的表达调控，抑制酵母细胞的分裂，甚至使酵母细胞在选择性培养基上不能生长等，由此使得某些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。针对这些异源蛋白质对酵母生长的毒性作用，近年来在双杂交系统中的主要改进是选用更加灵敏的报告基因从而降低这些异源蛋白在酵母中的表达量，减轻这些 异源蛋白质在酵母中的毒性，如采用 母双杂交系统 (， 1996)，该系统中 段被原核生物的白质编码区所取代，单纯疱疹病毒的 88 个 码区则取代了 段。 酵母双杂交系统的发展 目前发展起来的各种双杂交系统大多是以 人建立的系统为基础的。 这些新系统主要对 报告基因 、 诱饵 表达载体以及 猎物 表达载体等做了一些改进 (敖光明 等， 2001)。 其中一个重要改进是引入额外的 报告基因 , 如广泛采用的 因。 经过改造带有 告基因的酵 母细胞 , 只有当 启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。 告基因 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 的转录表达是由 诱饵 和 猎物 的相互作用所启动的。 大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个 报告基因 。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点 , 因此可以被相同的转录激活因子 (如上述的 白 )激活。 通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象，如在 1993 年发展出了一种研究蛋白质和 互作用的实验体系酵母单杂交系统 (， 1993) ，另外为了研究阻断大分子间特定相互作用的 机理，在原有酵母双杂交系统上发展起反向酵母双杂交系统 (， 1996) 和用于分析蛋白和 相互作用的酵母三杂交系统 (， 1997) 等。下面介绍几种常用的体系： (1) 非单一的报告基因体系：在酵母 双杂交 系统建立的初期阶段，由于仅仅采用 这种报告基因的表达往往不能十分严谨地加以控制，因此容易产生一些假阳性。 人于 1996 年构建了 株（ ， 1996）内含三种不同的报告基因（ 分别受三 种不同的启动子（ 控，而这三种不同的启动子都由 活，该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用，从而显著地消除了假阳性。考虑到某些诱饵蛋白质 X 或待筛选蛋白质 Y 在酵母中大量表达时，可能对酵母产生一定的毒性作用，如使酵母体内的信号传导通路阻断，干扰酵母中正常基因的表达调控，抑制酵母细胞的分裂，甚至使酵母细胞在选择培养基因不能生长等，由此使得对某些种类的蛋白质不能在该系统中进行分析。针对这些异源蛋白质对酵母生长的毒性作用，近几年来在 双杂交 系统中主要的改进是选用更加灵敏的报告基因从而降 低这些异源蛋白在酵母中的表达量，减轻这些异源蛋白质在酵母中的毒性，如采用 母 双杂交 系统。在该系统中 段被原核生物的 纯疱疹病毒的 88 个 码区则取代了 段。 图 1单一报告体系原理示意图 of (2) 逆杂交体系：在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中 , 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。 针对实际工作中的 这种需要 , (1996)发展了所谓的逆双杂交系统。 这项技术的关键是 报告基因 引入。 因在这里起到了反选择的作用 , 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。 该酶能把 55化成对细胞有毒的物质。通过改造在 因的启动子内引入 结合位点 ， 这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当 诱饵 和 猎物 相互作用激活 因的表达才能生长。 在含有 5完全培养基上 诱饵 和 猎物 的相互作用则抑制细胞的生长。 然而如果目的蛋白 , 即 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 与 则细胞能在含有 5完全培养基上生长。 通过这种方法，筛选到了转录因子 突变物 , 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白 但是丧失了同另外一种称为 白的结合能力。 结果得到了体外结合实验的验证。 通过对这些突变蛋白基因的测序 , 他们发现了新的 合的位点。反向双杂交系统可更有效地识别蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构和功能的关系。此外此系统还可筛选能阻 止某些蛋白间相互作用的短肽或小分子物质用作临床治疗制剂。 人 (1996)利用这种方法鉴定出 答元件结合蛋白 (磷酸化位点的 变会阻断其与辅助激活因子 (合识别 蛋白 )的相互作用 。 图 1杂交系统示意图 of 3) 活体系：以上介绍的酵母双杂交系统都是建立在对 合 酶 激活的基础上的。 这意味着双杂交过程是在细胞核内完成的。 然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白 , 它们需定位到膜上之后才能表现正常的生物功能，与其他蛋白质起作用。 有些真核细胞蛋白还要经过翻译后的加工修饰如二硫键的形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。 这些加工修饰在正常的细胞核内不可能发生。 有些蛋白质本身具有激活转录的活性 , 它们可不经过双杂交相互作用即能激活 报告基因 的表达。 因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。 例如 , 人设计了一个白介导的双杂交系统 ( ,1997) 也被称为 活系统 (利用 活体系已成功检测非结构蛋白之间的相互作用 (等， 2002) (4) 三杂交系统： 酵母三杂交系统是 (1996)在酵母双杂交基础上提出来的 ,其基本原理和试验操作与 非常相似 。 (1996) 利用 地塞米松杂合分子，将与合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵，用于筛选与 合的 库，分离了与 合的蛋白 蛋白质的相互作用是某些生命活动的基础，如转录、 剪切及 毒与宿主之间的作用等。 (1996) 提出了分析 蛋白相互作用的方法。在这个系统中，与 合的蛋白是一个具有 合域的蛋白 (如细菌能够与 子的臂 具有臂 有诱饵序列 (这样子与 结合于报告基因的上游；第 3 个分子 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 是 果该蛋白识别诱饵序列 结合，则报告基因转录。该系统用于确定 识别目的蛋白质的 合域，也可以研究被已知蛋白质识别的 列。利用这个系统成功地发现了许多 蛋白质之间的相互作用。包括铁离子调节蛋白与铁反应元件的结合 、 激活因子 应元件 列的结合等 (F 等 ,1996)。 (2000)应用酵母三杂交系统进行研究，发现 5前导序列与其 异性地结合后，可以明显激活报告基因的转录。突变分析表明：前导序列中的富含嘌呤碱基的区域和 的锌指结构域是特异性互作的区域； (1999)在酵母三杂交系统试验中发现 ,烟草坏死病毒卫星 (端非编码区的 100 个核苷酸序列可特异性地结合 明这个区域在启动转录中起主要作用 。 图 1杂交系统示意图 5) 泛素专一性蛋白酶体系：针对同一个问题， (在酵母 双杂交 系统中， 酵母细胞核内发生相互作用，表达的融合蛋白需定向到核内来激活报告基因的转录，这就可能限制了大量非核内蛋白质如膜受体蛋白 质、细胞外分泌蛋白质等在此系统中的应用 ) 与建了泛素专一性蛋白酶系统（ 该系统的基本思想是，泛素与蛋白质新形成的复合蛋白会被一种泛素专一性蛋白酶（ 断，此专 一性切割只在泛素正确折叠的前提下发生。他们发现，泛素 时仍能正确地折叠，而当 两个片段将不能正确折叠。但是真正令人感兴趣的是，连于 结合时，这一错义突变带来的折叠困难将意外地得到克服。利用这些特性，二人将 X 蛋白与泛素 C 端， Y 蛋白（未知）与泛素 N 端（含错义突变）分别融合相连，这里作为报告蛋白的是连在泛素 C 端的带有血凝素标记的二氢叶酸还原酶。当 X 与 Y 特异结合时，导致泛素两片段能够正确折叠形成 正常 的泛素，使 下报告蛋白，再经免疫印迹分析呈阳性，则可以确知 X 与 Y 发生的作用（ ， 1994）。这一系统可以用于解决很多问题，而且可以用于检测蛋白相互作用中的动力学性质。但是由于 对于表型识 别显得繁冗。 有人对它作了改进 ,以一种融合的转录激活因子 为报告蛋白。 旦被从遍在蛋白 C 端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因 ,如 : 。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率 ( ,1998) 目前 双杂交 系统主要还是建立在酵母这一体系之中，更准确地说，以酵母细胞核作为相互作 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 用的反应场所，外源基因的转录，翻译，蛋白产物的修饰，折叠及细胞内定位等过程是在酵母细胞中完成的。但酵母毕竟还是一种 低等的真核生物，它的各种生物学功能，尤其是蛋白质的翻译后修饰如 N 端糖基化，二硫键形成等的水平还很难与高等真核生物相比拟。因此要进一步研究蛋白质产物的生物学功能，还必须建立高等生物体系中的 双杂交 系统。在这一方面，近几年来，已初步建立了哺乳动物细胞 双杂交 系统激活。在哺乳动物 双杂交 系统中，采用单纯疱疹病毒的 段 （ ， 1997），同时又引入另一个含有氯霉素乙酰转移酶（ 告基因的表达载体，采用磷酸 钙共沉淀法，转化入胞中进行培养 (， 1996)。该系统成功地验证了小鼠 白与 T 抗原间的蛋白质相互作用 （ ， 1994）。此后不久， 1997） 等人利用 检测了 种蛋白质之间的相互作用。此外，在酶母 双杂交 系统的基础上，结合荧光共振能量转换效应 (， 1997) 和表面 胞质团共振分析技术 ( (， 1993)，也可对酵母 双杂交 系统的结果加以验证，从而更加准确地探明大分子间相互作用的机理。 2. 酵母双杂交系统在病毒学 中 的应用 酵母双杂交系统在病毒粒体分子结构和装配研究中的应用 病毒的结构蛋白种类很少，应用酵母双杂交系统对病毒粒体装配中结构蛋白的互作问题进行研究，可为电子显微镜重建等研究提供重要补充。 (1997,1999)应用酵母双杂交系统对水稻矮缩病毒（ 粒体装配进行研究。结果 表明， 在内衣壳表面形成二聚体，对核心结构的保持起到重要作用； 粒体表面形成三聚体且可诱导五邻体和六邻体的排列。 (2000)发现水稻东格鲁杆状病毒（ 外壳蛋白域有很强的互作关系，表明 与了 壳的组装。 (1996)发现花椰菜花叶病毒（ 内含体蛋白（ 特异性地与病毒外壳前体蛋白（ 接，由于 成熟病毒粒体中不存在，故推测 粒体装配中只起附属作用。 酵母双杂交 系统在病毒核酸复制及基因表达调控研究中的应用 病毒核酸复制是病毒生 命 周期