【毕业学位论文】（Word原稿）金丝桃素新制剂抗口蹄疫病毒的试验研究及金丝桃素的化学合成预防兽医学硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 硕士学位论文 金丝桃素 新制剂 抗 口蹄疫病毒的 试验 研究 及金丝桃素的化学合成 on ew on ew I 摘 要 随着全球 “ 回归自然 ” 浪潮的日益高涨 ,天然药物以其毒副作用小、环保、安全、有效等特点越来越受到中国乃至世界的关注。金丝桃素作为贯叶连翘的主要活性成分物质之一已经在抗肿瘤、抗病毒、治疗抑郁症等方面已有大量报道 ,且效果显著。但应用于动物烈性传染病防治方面却鲜有人报道 。 本文以 A 类动物烈性传染病 之首的 口蹄疫病毒 (模型，进行金丝桃素 新制剂 抗 毒的 生物 试验研究。通过体外 试验、动物试验及 对小鼠脾 淋巴细胞增殖 试验，探索性的研究金 丝桃素 新制剂 在重大疫病防 治 方面 的作用 。另外，本文还进行了金丝桃素化学合成的部分研究。具体研究如下 : （一） 金丝桃素 新制剂 抗口蹄疫病毒的 生物试验 研究 本试验分别通过 对金丝桃素新制剂在 胞和 3 4 日龄乳鼠 中， 同利巴韦林和莪术油 进行 抗口蹄疫病毒的疗效比较 ，确定金丝桃素新制剂的抗病毒效果。 结果表明：金丝桃素 新制剂 具有很好的抗病毒效果。在 胞中，金丝桃素 新制剂 可以使 降到 在乳鼠中，金丝桃素 新制剂 在 浓度下，可分别使 型 的 4 个滴度，同对照药物相比表现出良好的抗病毒作用，差异显著（ P 。 本试验将四头经过检测无感染、无免疫的 健康 牛随机分成两组，用药组 3 头 ,对照组 1 头。分别舌面攻毒 10000毒同时 ， 按照 小牛灌服金丝桃素 粗品 ,每天一次持续七天。临床症状结果显示：用药组只有一头轻微发病 ,对照组发病严重。液相阻断 测抗体滴度显示：用药组抗体滴度产生晚于对照组 ,且抗体水平相对较低。说明金丝桃素可能对病毒吸附宿主细胞、病毒自身复制或机体免疫等一种或几种途径有影响。 验 本试验研究了 金丝桃素 新制剂 对小鼠脾 脏 淋巴细胞 增殖的影响。 结果发现 金丝桃素 新制剂从 50g 始至 800g 个浓度均 可 使小鼠 脾 脏 淋巴细胞 显著 增加 （ P ，且具有明显的剂量依赖关系， 可以间接推测金丝桃素 新制剂 具有一定提高免疫力的功能。 （ 二 ） 金丝桃素 (的化学 合成 本研究综合国内外的文献资料，对其化学 对照品 合成路线进行了探索，将一些合成工艺进行了必要的改进 ,利用 1,6,8396 与催化剂氢醌、氢氧化钾等共同作用，通过 踪、调节 、萃取、制备等一系列的过程 ，在光照 条件 下反应两周 ,制取 目标化合物金丝桃素。 目标产物金丝桃素的结构经过薄层色谱法（ 红外光谱（ 核磁共振氢谱（ 1 的确证。并运用高效液相色谱法（ 金丝桃素的含量进行了测定，达到 85%。 关键词 ： 金丝桃素 新制剂 ； 口蹄疫病毒 ； 生物 试验 ； 淋巴细胞 增殖 ；化学 合成 s to by as to so of ., is to in in of of MD is of IE as to ew of of to ew in of In as (1) of ew 1. ew il 4 ew ew on In ew In of ew 4 on P 。 2. n of at 3 0000ew a in in of in in in on of by or s 3. ew on of ew 0g 00g to in a P ， be ew s to (2) on in 6 ,1,6,8is LC pH is of is 1135%, is ew 录 第一章 引 言 (综述 ) . 1 1 研究的目的和意义 . 1 2 金丝桃素的研究进展 . 2 3 口蹄疫病毒研究现状 . 6 4 天然药物的研究进展 . 8 5 论文实验设计 . 9 第 二 章 金丝桃素 新制剂 抗 外试验研究 . 10 试验一 金丝桃素新制剂 在 胞 中 抗 验 研究 . 10 料 . 10 验方法 . 11 果 . 13 论 . 15 试验二 金丝桃素新制剂 在 乳鼠 中 抗 验 研究 . 19 料 . 19 验方法 . 19 果 . 23 论 . 27 第 三 章 金丝桃素 新制剂 抗 物 试验研究 . 29 料 . 29 法 . 30 果 . 31 析与讨论 . 33 第 四 章 金丝桃素 新制剂 对小鼠脾淋巴细胞转化的影响 . 34 料 . 34 验方法 . 35 果 . 36 论 . 36 第 五 章 金丝桃素的化学合成 . 38 料 . 38 验方法 . 39 果 . 42 论 . 43 题和展望 . 45 第六章 结论 . 47 参考文献 . 49 V 附 图 . 55 致 谢 . 63 附 录 . 58 作者简历 . 64 英文缩略表 缩略词 英文名 中文名 仓鼠肾细胞 甲基纤维素 胞病变 分钟脉冲数 碳酸二乙酯 甲 基亚砜 联免疫吸附试验 os 牛血清 口蹄疫 蹄疫病毒 3 型肝炎病毒 型肝炎病毒 类免疫缺陷病毒 纯疱疹病毒 丝桃素 扰素 0% 0%感染剂量 白细胞介素 R 外光谱 0% 数 致死量 谱 -（ 4， 5- 2， 5唑氮蓝 磁共振 酸缓冲盐液 (氮 )唑核苷 ,利巴韦林 0% 数细胞感染剂量 层色 谱 瘤坏死因子 外光 术油 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 (综述 ) 1 研究的目的和意义 我国因病毒感染导致动物死亡的比率在所有病因中居第 2 位，仅次于细菌感染的致死率占36 8 ，且发病率呈上升趋势。很多病毒感染动物，形成多种急慢性传染病、危害畜牧业健康发展。由于病毒结构简单，仅由一种核酸 蛋白质组成缺乏完整的酶系统、有严格的寄生性、需借助宿主细胞的功能繁殖，只能在敏感的细胞内培养或感染易感机体等特点使药物防治成为抗病毒感染的主要手段之一，且近年来进展迅速。抗病毒药物必须通过细胞膜，进入细胞， 应能选择地抑制病毒而不损害宿主。不少抗病毒物质对细胞或机体有毒而不能应用、大大限制了抗病毒药物的发展， 以致许多病毒性疾病至今仍缺少效果确切的防治药品。 由于病毒只能在活细胞生长的特殊性以及病毒抗原易变异性， 使得病毒性疾病的防治工作很难达到预期的效果。 在数千年的临床实践中，人们运用天然药物及其配方制剂防治病毒性疾病取得了丰富的经验。于是，人们将目光投向了天然药物 中草药 。 近已发现一些对病毒病有疗效的药物 （ 杨占秋等， 1987） 。 金丝桃素是 贯 叶连翘的主要活性成分之一 ， 具有抗抑郁、抗菌消炎、抗 毒等多 方面的活性， 已作为原料制成药品在临床上广泛使用，用于治疗抑郁症，艾滋病及甲乙型肝炎等疾病。 特别是其在 广 谱抗病毒、抗肿瘤方面的显著作用 。具有 效果确切，毒副作用相对较小等特点。使国外学者对其研究成为热点。 基 于金丝桃素 以上 的多种药理作用，对其的需求量与日俱增。 并且国外有报道金丝桃素作疫苗增强剂致免疫性 (注：金丝桃素、原金丝桃素与病原体、微生物与之接触而灭活，更为可贵的是逆转录病毒与之接触而得以保护、增强其致免疫作用，在生产疫苗中有益 )（ et 1992） 。 因此，将 金丝桃素的 新制剂 应用 在 动物 病毒性疾病的防治 方面具有独特的优势和广阔的发展前景 ， 亦能带来良好的经济效益、社会效益和生态效益。 金丝桃素的研究已获得“十五”国家科技攻关计划新型抗菌、抗病毒中兽药的研制及应用资助。该药已通过国家参考实验室对禽流感病毒 型病毒在体外直接接触杀灭效果的体外实验。采用 果表明：金丝桃素每毫升含 0 分钟，对病毒的杀灭率可达 100%，有较好的杀病毒作用；每毫升含 药的浓度范围内与流感病毒 作用 10 分钟，对病毒的杀灭可达到 上，有良好的杀病毒作用。为了进一步考察对其它病毒的活性，进行了金丝桃素抗口蹄疫 病毒 的研究，探讨其抗口蹄疫病毒的作用机理，从而研制新型抗病毒药物提供理论和试验依据。 我国虽然盛产贯叶连翘，但是由于金丝桃素在贯叶连翘全草中的含量仅有万分之几，即使通过改善提取工艺，提取分离出来的金丝桃素产量仍然较低，不能满足市场对金丝桃素的需求。实现金丝桃素产业化的目标有一定的困难，这样极大地限制了金丝桃素产品的临床应用。为了实现贯叶连翘资源的可持续发展，扩大金丝桃素的药物来源，利于 实现金丝桃素的产业化，通过化学合成的方法实现这一目的。将对实现金丝桃素产业化有一定的现实意义，它不仅对我国医药行业的发展，而且对畜牧业生产的发展有巨大的推动作用 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 2 金丝桃素的研究进展 金丝桃素（ 属藤黄科金丝桃属多年草本植物， 是贯叶连翘（ .）中最具生物活性的物质 ， 除贯叶连翘外其广泛分布于金丝桃属（ 其 它植物和 植物中 (类法 ) （ M， et 1987； ， et 1963）。全世界约 4000 余种，西方称之为圣约翰汤 (s 因其可通过血脑屏障，在 19 世纪 50 年代曾用作抗抑郁症之治疗 （ 郁青等， 1997； et 2000） 。有实验表明在治疗轻度和中度抑郁症时，贯叶连翘明显优于安慰剂，与标准抗抑郁药 (三环类 )相比，疗效相同而副作用小（ N.， et ， 1997）。 其光动活性 能辅助治疗脑瘤，口服还可作为治疗恶性 肿瘤的附加剂（ , et 1996 ）。在德国，从贯叶连翘中提取出来的金丝桃素已与蛋白结合用于临床治疗 甲型 /乙型肝炎（潘映红等， 1993）具有重要的药用价值。 临床证明：金丝桃素制剂对抑郁症的治疗优于麦普替林，阿米替林等抗抑郁药。贯叶金丝桃素口服还可作为治疗恶性肿瘤的附加剂（潘映红等， 1993），贯叶金丝桃素提取物是继银杏叶提取物之后受国外厂商所青睐的产品之一。 因其明显抗病毒效果 好 ，细胞毒性小 ,又因金丝桃素 新制剂 为纯中药制剂，副作用小，加之国外作为抗抑郁药临床应用已多年，患者有 很好的耐受性，并无明显的副作用等特点 （ , et 1996） 。 使 金丝桃素 新制剂 称为很具有 开发潜力的抗病毒药物。 病毒和抗肿瘤作用 肿瘤活性 金丝桃素抗肿瘤作主要通过光动作用，过程接受光敏色素光活化提供的能量，产生细胞毒性很高的单线态氧。 金丝桃素吸收光子，然后激发单线态氧， 金丝桃素分子由三线激发态跃迁到基态，释放能量，引发单线态和 进而破坏细胞膜（ Y, et 1992）， 1998）报道 金丝桃 素 在光激活下，通过抑制线粒体中己糖激酶活性，级联调节神经胶质瘤的能量代谢， 改变细胞 内 代谢，使肿瘤细胞内发生一系列 生化 变化，导致肿瘤不可逆的损伤、坏死（ et 1998; 1999; ., et 1998）。因此，光照 可直接引起癌细胞程序性死亡（ et 2001； et 1998），并伴随细胞色素 et 1998） 。 在没有光的情况下，金丝桃素同样能释放质子，这是由于金丝桃素的 于强酸，很容易失去一个质子。研究表明，细胞内的酸化与细胞凋亡关系密切。 研究表明（ et 1999） ： 金丝桃素的细胞毒作用能在奥美拉唑的作用下加强，奥美拉唑是一种H+K+的抑制剂，能证明金丝桃素的作用机制和细胞内酸化 有关。进一步研究表明，金丝桃素使细胞酸化后抑制己糖激酶与线粒体结合（ .,et 1998） ,降低 葡萄糖的磷酸化作用，是 量和线粒体跨膜电位下降，引发细胞内发生一些列生化变化，最终改变细胞的能量代谢，引起细胞凋亡。 据 报道， 活化的金丝桃素可导致细胞总 平核线粒体呼吸功能显著而不可逆的下降 （梁巧丽，等， 1999） ，提出线粒体可能是金丝桃素细胞光损伤的主要攻击目标（ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 S A S， et 1998）。 在 514532激光光源照射时对金丝桃素抗肿瘤的诱导最好（ et 1997; ., et 1999）。 金丝桃素的抗肿瘤作用对不同的肿瘤细胞，其作用机制可能不同，而且其抗病毒作用受其浓度、光照时间、光照强度和细胞聚集程度的影响。此外不同的肿瘤细胞对金丝桃素的敏感性不同，因此，不同的肿瘤应采取不同的治疗剂量。 抗病毒 活性 离体和活体实验表明 （ ., et 1999） ，金丝桃素 (有抗艾滋病人免疫缺陷病毒（ 及其它一些反转录病毒的作用（ 2000； et 1999）。它在细胞培养中可抑制逆转录病毒的复制。有的报道认为金丝桃素在细胞内的 制作用是由于其与感染细胞中残留的毒粒成分相结合，是一种有杀病毒作用的药物。鉴于在感染者中已发现有脑部和中枢神经系统的感染，这一点对 染病人也有一定意义 ，在德国金丝桃素已用于艾滋病治疗（潘映红，等， 1993）。 金丝桃素体外实验对单纯疱疹病毒 1 型、 2 型 (副流感病毒，牛痘病毒、疱疹口炎病毒有抑制作用。对人巨噬细胞病毒体外实验也有抑制作用并发 现对鼠巨噬细胞中的白细胞介素 明显的抑制作用（ et 2001）。金丝桃素对小鼠体内感染 50g 抑制病毒复制的作用（中国药科大学等主编， 1996）。 最近研究发现，金丝桃素具有显著的抗 毒作用。 金丝桃素的抗病毒机制与细胞凋亡机制类似，可能通过两种方式作用于病毒（ ., et 1996），一种是直接攻击病毒粒子，可能直接攻击有脂质被膜的病毒的膜成分，二是作用于病毒感染细胞。在光照条件下，金丝 桃素吸收光子，然后激发单线态氧释放能量。产生的单线态氧进而破坏细胞膜，干扰蛋白质和核酸。这一反应机制的必要条件是光照、氧、光敏色素。金丝桃素抗病毒具有氧依赖性，但在低氧的条件下仍有活性。并且，金丝桃素抗病毒作用和其进入细胞内释放质子降低细胞内的 有关。 另外，由于 金丝桃素是一种油前途的内源性光敏剂， 而且 主要集中在膜上，长期培养后，金丝桃素可到达细胞质和细胞核，核内有明显吸收（ ， et 1995），其抗病毒活性在光诱导下更强， et 1996 ）等研究了该反应的氧依赖性，发现氧浓度下降条件下时金丝桃素抗病毒活性急剧下降，但仍有较低活性。近年来的研究表明，金丝桃素具有抗病毒活性时还干扰蛋白质和核酸。纽约大学中心 的研究指出 :金丝桃素是通过阻断病毒的脱壳、出芽，或装配从而干扰复制。但对病毒转录，翻译和病毒蛋白运送至细胞膜无明显作用，对 聚酶亦无直接作用。 .， et 1995）也具有类似的观点，指出金丝桃素破坏病毒复制循环有 10 个攻击目标，包括吸附、融合、脱壳、反转录、整合、 制、转录、翻译、转配和释放（ f, et 1989）。不影响病毒的转录和翻译而是干扰病毒的装配与释放 (f, et 1989）。另有报导表明金丝桃素可能也影响病毒的整合酶。 在离体的条件下，光活化的金丝桃素可抑制线粒体琥珀酸氧化酶（ , et 1996）。 利用光的作用，金丝桃素产生单线态氧，发生高能态原子迁移，抑制 胞甚至杀死人体内的白细胞（余爱农等， 2003）。纽约大学医学中心和以色列 学研究所的研究结果也表明 金丝桃素在体内外都有很强的抗病毒活性，且与叠氮胸苷（ 协同作用（ ， et 1988），可直接引起癌细胞从程序性死亡，并伴随有细胞色素 C 由线粒体向细胞质释放（ ， et 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 1999）。其离体细胞毒性实验（ , et 1996； A L, et 1997； et 1998）和活体抗肿瘤研究（ L, et 1996）均 有报道。 金丝桃素还可作为蛋白激酶 C（ ， 的特异性抑制剂（ ， et 1988） ,可直接抑制表皮生长因子 （ 受体和酪氨酸蛋百激酶 （ （李宏等， 2002） 。这些酶都与细胞内遗传物质的复制及细胞的增殖密切相关。金丝桃素可强烈抑制 因启动子的活性，对 产生在转录水平起负调节作用，此结果可解释金丝桃素治疗风湿病的一些生物活 性（李宏等， 2002）。 国外还有实验结果报道显示金丝桃素抗病毒、抗炎及抗肿瘤作用的机制在于抑制 而导致对宿主免疫系统的抑制作用（刘强等， 1997）。 抑郁作用 贯叶连翘提取物在欧洲尤其是德国长期被用作抗抑郁药物，一般认为其中的主要有效成分是金丝桃素。 2000 年，美国研究者 人用金丝桃素浸膏制剂与斯托宁作对照实验，以两种药物治疗 30 位轻、中度抑郁症患者，进行随机研究。所用制剂中金丝桃素日剂量为 床用药一周后，结果表明金丝桃素制剂疗效与斯托宁相当，甚 至优于斯托宁。德国与美国的研究者报道了以金丝桃素治疗 1757 个轻、中度至严重的抑郁症患者的 23 次随机、双盲、对照实验分析 照组为安慰剂或标准抗抑郁药。结果表明金丝桃素制剂明显优于安慰剂，与标准抗抑郁药物（马普替林、丙咪嗪、阿米替林）相比，疗效相同而副作用较少（余爱农，等 ,2003） 。 目前关于其机制及有效成分的研究仍在探索中。一般认为，贯叶连翘与普通抗抑郁药物一样，抑制去甲肾上腺素和 5理论认为，贯叶连翘在多方面同时起作用：抑制去甲肾上腺素、 5再吸收；作用于下丘脑，抑制皮质醇分泌 ,低水平的 胺氧化酶抑制剂） ，有研究表明 金丝桃素对单胺的摄取具有抑制作用。 但也有相反观点认为：金丝桃素对单胺氧化酶的活性只有很弱的抑制作用 ( 1998， . et 1995),甚至根本没有抑制作用（ ., et 1994, ., et 1995, ., et 1989, 1997）。因此 ，没有在临床上作为单胺氧化酶的抑制剂应用于临床（ .,et et 1994）。 有 人 认为贯叶连翘粗提物对一些脑神经传质有关的化合物受体有良好的亲和力，如 ： 镇 与抗抑郁有关 的 定中枢神经的主要物质之一 ； 对 受体有很强的亲和力（ et 1998） , 受体和抗抑郁作用密切相关。它的配体在动物模型中有抗抑郁作用，且它存在于大脑中和情绪调节有关的区域。 另外， 贯叶连翘可用于治疗更年期抑郁症是 由于所含的一种温和的植物激素 普遍的观点是：贯叶连翘抗抑郁的有效成分是金丝桃素， 发现金丝桃素在小鼠强迫游泳试验（ 显示出反 U 型剂量曲线，证明金丝桃素是贯叶连翘中抗抑郁的有效成分，此种作用被多巴胺抑制剂 拮抗，而且其抗抑郁机制主要通过 制 及多巴胺系统 起作用 （ .,et 1998）。 在早年的研究中发现治疗浓度（ 金丝桃素