【毕业学位论文】（Word原稿）五指山猪近交系矮小性分子遗传基础研究动物遗传育种与繁殖博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 五指山猪近交系矮小性分子遗传基础研究 of he of 要 五指山猪（ 我国著名珍稀猪种，是原产于海南岛中南部山区的一个濒临灭绝的地方猪种，成年体重仅 30为正常猪种体重的 15而且具有抗逆性强、性成熟早、肉质好、遗传稳定等特性，经近 20 年来的异地保种、实验化近交繁育，目前已培育成近交系群体并已获得 体（近交系 数高达 由于其在解剖学、生理学特性、营养代谢等方面与人类极为相似，已在生物医学领域中得到广泛应用，已成为研究人类疾病理想的动物模型，并列为我国异种器官移植、组织工程和“国家实验用小型猪种质资源保存和开发中心”首选种猪。 本研究以 纯种近交 16 代 实验材料，对其内分泌生长轴相关基因进行了一系列分子遗传学基础研究，旨在探讨 交系矮小的分子机理，并为其成为理想的实验动物模型提供科学的理论依据。 1） 采用 法检测了三月龄的大白猪和 交系的血清 量，比较发现 ：交系血清 度略低于大白猪，但二者之间差异不显著（ P而 交系血清 度显著低于大白猪（ 2. H DS H 16 of H by H T at 6, al G A at 5, ln in be of 3. 917bp HR DS HR 38 of DS by HR HR of DS in 65 N3 HRs 4. A in DS s t of DS 30 5. s GH HR IV s GH 0 of As a of no s 6. s GH s 000. to in as in 度（ ng/ 而 交系血清 度明显低于大白猪，达到显著水平（ 猪 度（ ng/ 本实验测定的血清 量比姚惠娟和鲍世民的研究结果要低（姚惠娟等， 2002；鲍世民等， 2002），这可能是由于 冲式释放的原因所造成。 由脑垂体前叶分泌的单链多肽，它直接作用于全身的组织细胞，可增加细胞的体积和数量，并与其他垂体激素协作以保证个体正常的生长。 平生理性平衡主要保证个体正常生长发育，如果平病理性失衡，可导致巨人症或侏儒症等临床症状。 的作用是通过 要由肝细胞合 成和分泌，对机体生长发育起着重要调节作用（ 1998; 1999） 。 进体脂的合成、乳腺和卵巢的发育；以及促进某些性腺分泌性激素。 般的，生长速度快的猪高于生长速度慢的猪（ et 1995）。 品种内公母之间差异不显著（ P而 交系血清 度明显低于大白猪，达到显著水平（ P其中 交系母猪血清 平显著低于大白猪母猪（ P 尽管 交系 号位置发生氨基酸替换，缬氨酸替换丙氨酸（ A V）， 22 号位置 交系发生氨基酸替换，谷氨酰胺替换精氨酸（ R Q）。但这两处氨基酸替换均位于信号肽编码区，对 成熟肽没有影响； 能会影响到 比对大白猪的 因编码区推导蛋白氨基酸序列与 交系 外结构域和胞内结构域均存在两处氨基酸替换，其中 165 号位置的氨基酸替换位于 守结构域中，推测该氨基酸替换可能对 结构和功能产生重要的影响。其结构与功能性变化类似侏儒人和侏儒鼠。 交系 因编码区 393编码区仅发现一个同义突变，未引起所编码氨基酸的变化。 构建了 交系 因原核表达载体，并进行诱导表达， 交系 到正确表达，在目的分子量处出现特异性条带，经软件扫描，其含量约占菌液总蛋白的20； 交系 因并没有发现特异性条带，推测可能是由于大肠杆菌的密码子偏爱造成了该基因在原核生物中表达困难。 构建了 交系 因、大白猪和 交系 因真核表达载体，并转染猪肾细胞 行表达，采用相对定量 法检测 因表达，结果发现： 转染大白猪 因的细胞 因表达水平显著高于转染其它三种质粒的细胞（ P转染交系 因的细胞 因的表达水平最低，推测 交系 因所发现的氨基酸替换可能会影响其下游 因的表达，从而会影响 促生长作用。 中国农业科学院博士 学位论文 第六章 结论 54 研究存在的不足 由于个人能力的有限，试验条件的限制等方面的因素影响，试验结果中还有不够完善之处： 1）没能通过原核表达获得 交系 因的表达产物，因此不能作进一步的分析； 2）由于经验不足，导致在构建 因真核表达载体以及真核表达时占用了大量时间。 一步工作的设想 1) 对于 交系 因的原核表达产物，还需作进一步的实验研究， 如通过 对表达产物进行纯化并制备抗体，然后进行酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法的检测。 2) 进行 选浓度的优化筛选稳定转染 交系 因的真核表达细胞，并对细胞水平的 蛋白质合成、脂生成和 磷酸化进行检测，进一步证实该基因的作用。 3）运用定点突变的方法获得一系列 交系 突变体基因，并构建成表达质粒。转染细胞并获得表达后，研究 其突变体的生物活性。 中国农业科学院博士学位论文 附图 55 附 图 附图 1： 交系 因的 列和推测的蛋白质序列 中国农业科学院博士学位论文 附图 56 附图 2： 交系 因的 列和推测的蛋白质序列 中国农业科学院博士学位论文 附图 57 附图 3： 交系 因的 列和推测的蛋白质序列 中国农业科学院博士学位论文 参考文献 58 参考文献 1. 白俊杰，马进，简清，等鱼生长激素基因在大肠杆菌中表达水平的研究 J中国水产科学，2000， 7（ 1）： 3134 2. 白俊杰，叶星，李新辉，等猪生长激素 隆及在大肠杆菌中的表达 J华中农业大学学报， 2001， 20（ 2）： 99 102 3. 鲍世民 ，马胜成，张德福猪生长激素测定 J上海实验动物科学， 2002，（ 3）： 81 4. 陈清轩，曹颉，宋德秀，等猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究 J生物化学杂志， 1997， 13（ 5）： 540 545 5. 邓利， 张为民 ， 林浩然 生长激素受体的研究进展 J 动物学研究， 2001， 22（ 3）： 226230 6. 方美英，刘红林，姜志华，等 6 个猪种胰岛素样生长因子 因座位遗传多态性检测 J 畜牧与兽医， 1999， 31（ 1）： 12 13 7. 冯书堂，褚武军，王雅春，等中国五指山猪 北京：中国农业科技出版社， 1999， 30 50 8. 姜志华， 猪生长激素基因第二外显子区域遗传变异的序列基础 J南京农业大学学报， 1997， 20（ 2）： 67 71 9. 李凤，孟亚鹏，刘燕飞等猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备 J中国兽医科技， 2005，35（ 1）： 52 55 10. 廖志勇胰岛素、生长激素受体的结构与功能研究中国科学院博士学位论文 中国科学院上海生命科学研究院， 2003. 11. 刘德武，杨关福，张细权 猪神经内分泌生长轴各因子及相关基因的研究进展 J农业生 物技术学报， 2004， 12（ 1）： 109 115 12. 刘燕飞，尉 研，付若彬，等猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达 J中国兽医科技， 2005， 35（ 2）： 134 138 13. 莫德林猪 因的结构与功能研究暨 1,3因敲除载体的构建 华中农业大学博士学位论文 华中农业大学， 2006. 14. 欧阳菁，龙綮新，杨林，等猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达 J畜牧兽医学报，2002， 33（ 5）： 482 485 15. 欧阳菁，魏平华，杨林，等猪生长激素在杆状病毒载体系统中的表达 J中国病毒学， 2000，15（ 3）： 285 290 16. 秦巧梅 ， 许尚忠 ， 高雪 牛生长激素受体基因多态性与体尺、体重指标的相关性分析 J 遗传， 2007， 29（ 2）： 190 194 17. 宋成义，经荣斌，张金存，等 5 个品种猪生长激素基因座位多样性比较 J中国畜牧杂志， 2002， 38（ 1）： 22 23 18. 苏悌之 ， L， R， 等 猪生长激素 组及在大肠杆菌中表达 J 生物化学与生物物理学报 ， 1990， 22（ 3）： 111 119 19. 唐梅 ， 张钲 ， 伏静媛 ， 等 号通路介导大鼠血管平滑肌细胞的增殖与凋亡 J 基中国农业科学院博士学位论文 参考文献 59 础医学与临床 ， 2006， 26（ 12）： 1354 1359 20. 陶勇，经荣斌，宋成义，等猪生长激素基因座位 切片段多态特征的研究 J华中农业大学学报， 2001， 20（ 5）： 460 462 21. 王文君，任军，陈克飞，等 胰岛素样生长因子 因多态性与猪部分生产性能的关系 J 畜牧兽医学报， 2002， 33（ 4）： 336 339 22. 魏泓我国小型猪研究的现状 J中国实验动物学杂志， 1997， 7（ 4）： 252 255 23. 徐金先，夏东，赵茹茜，等猪下丘脑和垂体中生长激素受体、胰岛素样生长因子 I 型受体的发育性变化 J遗传学报， 2004， 31（ 5）： 495 501 24. 姚惠娟，鲍世民中国小型猪生长激素测定 J中国兽医科技， 2002， 32（ 5）： 44 45 25. 余旭平 ， 齐顺章 在大肠杆菌中温度诱导高效表达猪生长激素 J 生物工程学报 ， 1991， 7（ 4）： 307 311 26. 张德福 ， 刘东 国内外小型猪实验动物化研究 J 生物学通报 ， 2004， 39（ 10）： 14 16 27. 赵高锋，陈宏，雷初朝，等秦川牛 因 其与生长性状关系的研究 J遗传，2007， 29（ 3）： 319 323 28. 周杰，赵茹茜，韦习会，等二花脸和大白猪的脂肪组织中 因表达的发育性变化 J遗传学报， 2003， 30（ 7）： 657 666 29. 朱江 ， 曹广力 ， 姜秀英 ， 等 J 科技通报 ， 2005， 21（ 1）： 63 68 30. ., of in J. 2003, 144: 3799 3810. 31. ., ., ., et of of an J. 2002, 285: 311 318. 32. ., ., et of (in J. 1992, (99): 343 349. 33. ., et of in J. J. 1995, 10: 1057 1067. 34. ., et of on in J. 1997, 138(12): 5161 5169. 35. ., ., et of an in 2001, 142(1): 332 338. 36. ., et as a J. 1993, 74: 237 244. 37. ., ., et A of 国农业科学院博士学位论文 参考文献 60 J. 1997, 16: 13 14. 38. ., of in J. 1995, 29(1): 45 48. 39. ., ., et H in J. 2002, 143: 551 557. 40. of of J. 1993, 13: 437 461. 41. ., ., et J. J. 1993, 52(5): 998 1005. 42. ., ., ., et of in in J. 1994, 206： 205 209. 43. . of by I. J. 1991, 12: 29 37. 44. ., of in J. 1992, 89: 91 96. 45. ., of of in J. 1991, 128(6): 3183 3192. 46. ., et of of in J. 1991, 128: 31833192. 47. ., . of in of J. 1999, 17: 245 55. 48. ., et of on H J. 1999, 69: 3 10. 49. ., ., et of by a J. J. 1989, 264: 1865418661 50. of J. 1992, 14(4): 321326. 51. ., ., ., et A of in a J. J. 2003, 16(8): 1183 1189. 52. ., ., et In of a 0105) to 6 in J. 1994, 5 (3): 160162. 中国农业科学院博士学位论文 参考文献 61 53. ., . of in by J. 2000, 14: 550 557. 54. et in J. 1999, 88(428): 174 178; 79. 55. et in J. J. 1995, 73: 1776 1783. 56. J. 2003, 15: 983 992. 57. ., ., ., et of of J. 1998, 91(3): 844 851. 58. . of in J. 1987, 84: 4636 4640. 59. et in J. 2003, 144: 4783 4789. 60. ., of of J. 1992, 255: 306 312. 61. ., . of in to J. 1999, 17: 231 243. 62. ., ., et of H J. 1991, 88: 10272 10276. ., ., ., et of J. N J. 1989, 321(15): 989 995. 63. ., ., et A in of H by J. 1994, 13: 1386 1395. 64. ., ., ., et of in of J. 1984, 20: 8 11. 65. of in of J. 1998, 78: 745 761. 66. et of of of to of on in J. J. 1991, 69(6): 2443 2451. 67. et of 国农业科学院博士学位论文 参考文献 62 by in H J. 1998, 139: 20 28. 68. et of of a in J. 1989, 86: 8083 8087. 69. ., ., et 61