【毕业学位论文】（Word原稿）大豆、小麦抗逆相关GmTaAREB转录因子基因、启动子克隆及功能鉴定生物化学与分子生物学博士论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆、小麦 抗逆相关 动子克隆及功能鉴定 m/ m/ I 摘 要 干旱、高盐、低温等非生物逆境胁迫严重影响着农作物的产量和品质。植物 能够感知、传递胁迫信号，诱导相关功能的基因表达，对逆境作出适应性响应。研究表明：转录因子在传递逆境信号、调控胁迫相关功能基因的表达，提高植物的抗逆性中起着重要的作用（刘强等， 2000）。 碱性亮氨酸拉链 (蛋白可以划分为 10 个亚族： A、 B、 C、 D、 E、F、 G、 H、 I、 S（ et 2002）。其中， A 亚族主要参与 旱、高盐、氧化胁迫应答反应等，转 因的拟南芥能够显著增强逆境胁迫耐性 (et 2000)。 本研究以耐盐性较强的大豆（ .）品种铁丰 8 号和耐旱小麦（ .）品种小白麦为实验材料，开展了对抗逆相关 录因子基因及启动子的克隆、功能研究，具体实验结果如下： 1、基因克隆及序列比对分析： 通过 术从大豆和小麦 分别克隆到一个新的、抗逆相关 录因子基因，即： 拟南芥 水稻的 有较高 同源性 ； 这两个 基因与 拟南芥的 因均存在较近的亲缘关系。 2、目的基因的表达特性和拷贝数分析 ： 因的表达均受到 旱、高盐及低温的强烈诱导，其中 因在大豆基因组中存在一个拷贝； 因在小麦基因组中存在三个拷贝。组织表达特异性表明： 因在大 豆和小麦的根、茎、叶中均有表达，表达量的大小为：根茎 叶。 3、 亚细胞 定位分析： 采用含有绿色荧光蛋白（ 163体与 因构建成融合表达 载体 并转化洋葱表皮细胞 进行亚细胞定位 。证明 白位于细胞核内。 4、凝胶阻滞及转录激活分析： 白在体外与正常的 件能够特异性结合，表明这两个蛋白均具有体外结合特异性； 因在酵母体内不具有转录激活活性； 然而它们 均 能够激活拟南芥中一些与胁迫相关 下游 靶基因 的表达，在拟南芥中具有转录激活功能。 5、启动子克隆及瞬时表达分析： 克隆、获得了 因 的 启动子序列 并 发现一些与 将 因启动子瞬时表达分析显示：经 各种 胁迫处理后，愈伤均能够被染成蓝色，说明这些启动子片段中含有一些逆境胁迫响应元件。 光定量分析发现在 696 段存在一个干旱响应元件，在 944 段存在一个低温响应元件、 应元件和盐响应元件。 6、转基因拟南芥抗逆性功能分析： 干旱胁迫 处理后野生型存活率仅为 5%（ 3/60）； 29A/35S:基因植株分别为 35/60）和 50%（ 30/60）； 29A/35S:基因植株为 55%（ 33/60）和 31/60）。 盐胁迫处理后， 29A/35S:基因植株存活率为 32/60）和 26/60）； 29A/35S:基因植株为 31/60） 45%（ 27/60）。 低温胁迫处理后 ， 29A/35S:基因植株存活率为 45%（ 27/60）和 25/60）； 29A/35S:基因植株为 40%（ 24/60）和 22/60）。 氧化胁迫处理后 ， 29A/35S:基因植株叶片叶绿素含量分别为 10.2 mg/g 7.3 mg/g 29A/35S:基因植株为 7.5 mg/g 12.6 mg/g 述结果表明： 基因拟南芥均增强了对干旱、盐、低温及氧化胁迫耐性。 7、转基因烟草的抗逆性功能鉴定： 通过 对 转基因烟草进行逆境胁迫功能分析，证实了 基因烟草增强了对干旱、盐、 迫耐性；保卫细胞气孔观察、气孔开度及蒸腾速率统计分析表明： 基因植株的保卫细胞气孔关闭速度均明显快于对照而减少了水分的蒸发，提高了对非生物胁迫的抗性。 关键词： 录因子，拟南芥，烟草，胁迫耐性 as of of to to It in of in et 2000). A, B, C, D, E, F, G, H, I (et 2002). At on in in et 2000). as to of 1. By a 2. of in in to in of in to 3. of in by 6363by 4. to in of in of in IV 5. of US by of by by at in a 400a a a 696 6. of 0 % (3/60) 9A/35S: (35/60) 0% (30/60), 9A/35S:5% (33/60) (31/60), 0 of 9A/35S:(32/60) (26/60), 9A/35S:(31/60) 5% (27/60) , by of of 9A/35S:5% (27/60) (25/60), 9A/35S:0% (24/60) (22/60), of 9A/35S:0.2 mg/gFW .3 mg/g9A/35S:.5 mg/gFW 2.6 mg/gof 7. of to BA on %200 00 M by on as in V 目 录 第一章 引 言 . 1 第一部分 植物抗逆信号调控机制及基因工程研究进展 . 1 1 植物抵抗逆境胁迫的分子机制 . 1 2 非生物逆境胁迫应答的信号传递途径 . 2 3 脱落酸与信号传导 . 4 4 参与 逆境信号调控的转录因子 . 11 5 植物抗逆的基因工程研究进展 . 15 第二部分 高等植物启动子研究进展 . 17 1 启动子的一般特征 . 17 2 启动子的类型 . 18 3 启动子克隆的常用技术 . 22 4 启动子的研究方法 . 24 5 结 语 . 25 6 本论文的研究目的及意义 . 26 7 本研的技术路线 . 27 第二章 大豆抗逆相关 录因子基因克隆及功能分 . 29 第一节 大豆抗逆相关 录因子基因克隆 及序列分析 . 29 1 材料与方法 . 29 2 结果与分析 . 37 3 讨论 . 47 第二节 因表达特性及定位分析 . 49 1 材料与方法 . 49 2 结果与分析 . 55 3 讨论 . 59 第三节 因启动子克隆及瞬时表达分析 . 61 1 材料与方法 . 61 2 结果与分析 . 67 3 讨论 . 80 四节 因转录激活及体外结合特性分析 . 82 1 材料与方法 . 82 2 结果与分析 . 88 3 讨论 . 94 第五节 因抗逆性功能分析 . 96 1 材料和方法 . 96 2 结果与分析 . 101 3 讨论 . 116 第三章 小麦抗逆相关 录因子基因克隆、功能研究 . 119 1 材料与方法 . 119 2 结果与分析 . 119 3 讨论 . 151 第四章 全文结论 . 154 参考文献 . 157 致谢 . 171 作者简介 . 173 略 词 缩写 英文全称 中文名称 4 4 44 4 4 答元件 抗冻蛋白 应元件结合蛋白 甜菜碱醛脱氢酶 碱基对 碱性区亮氨酸拉链 花椰菜花叶病毒 RE 合蛋白 钙依赖蛋白激酶 十六烷基三甲基溴化铵 干旱响应元件 干旱应答元件结合蛋白 凝胶阻滞分析 电泳迁移率分析 to 早期响应干旱 乙烯响应元件 乙烯应答元件结合蛋白 乙烯应答结合元件 谷胱甘肽 S 转移酶 热激蛋白 BF 达诱导子 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 胚胎发生后期丰富蛋白 低温应答元件 促细胞分裂 原活化蛋白激酶 促细胞分裂原活化蛋白激酶激酶 促细胞分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 美国国家生物技术信息中心 核定位信号 聚乙二醇 致病相关 of 随机扩增 端 to 干旱响应 活性氧 受体蛋白激酶 水杨酸 超氧化物歧化酶 过度盐敏感 盐超敏的 热不对称 三羟基氨基 甲烷 5 54 氯 哚 中国 农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 干旱、盐碱等非生物逆境胁迫是影响植物生长发育和作物产量的主要限制因子( ., 1993; A., 1997)。据统计，世界干旱、半干旱区占地球陆地面积的 33%，其危害相当于其它自然灾害之和，盐碱地占地球陆地面积的 我国干旱、半干旱地区耕地面 积为 亩，约占全国陆地面积的 38%。 小麦是 我国 第二大口粮作物 ，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，干旱、高盐等 非生物胁迫 严重影响着小麦的产量和品质，其中 由于干旱缺水 对小麦造成的粮食减产达 700公斤。此外，还有 亩的盐碱地有待开垦利用。因此，改良和选育适应 干旱、盐碱 地区生长的抗逆小麦新品种具有重要意义。 植物的耐旱、耐盐性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗逆性受到周期长、优异种质资源缺乏的制约。随着现代分子生物学和基因工程的发展，从分子水平上深入研究植物与非生 物逆境之间的关系，初步揭示了植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，从而利用基因工程技术，克隆抗逆相关基因对改良、提高作物抗逆性具有重要的指导意义。 第一部分 植物抗逆 信号 调控机制及 基因工程研究进展 1 植物抵抗逆境胁迫的分子机制 为了适应环境，植物在长期演化过程中形成了一系列对不良环境胁迫的抵抗或忍耐能力，即植物的抗逆性。随着分子生物学的发展，从基因组成、表达调控及信号传导等方面着手，对植物非生物逆境胁迫的耐性机理进行了深入研究。 目前， 许多受非逆境胁迫诱导的基因 功能已经被证实：第 一类称为功能基因 ，其表达的蛋白包括：直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白（如 白 、 抗 低温 蛋白 、 离子通道蛋白和 合蛋白等）；渗透调节因子（如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等）的合成酶以及毒性降解酶 ， 如 超氧化物歧化酶 ( 、过氧化氢酶 (过氧化物酶（ 谷胱甘肽 S 转移酶、抗坏血酸过氧化物酶等 ，这一类基因产物的具体功能受到广泛重视，研究得比较透彻，能够去除细胞中的活性氧 (使细胞各种生理生化代谢活动能维持正常进行，保护细胞膜、叶绿体膜，减缓缺水对植物造成的伤害，以提高植物的抗逆性 （ et 1996; et 1998; 刘强等， 2000; et 2003） 。 第二类基因编码的产物参与逆境胁迫的信号转导或基因表达调控，主要包括： 传递信号和调控基因表达的转录因子 ， 如 ： 录因子、 录因子、 录因子及 录因子等 (et 2000)； 感应和转导胁迫信号的蛋白激酶 ， 如 ： 酶 ( 酶 (、受体蛋白激酶 (核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等 ； 以及在信中国 农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 转导中起重要作用的蛋白酶（如磷酸酯酶 脂酶 C 等） （ et 1997; et 2001; et 2002） （ 图 1。 植物细胞如何感应干旱、低温 等 逆境胁迫，将胁迫信号传递到细胞核的转录因子以及下游各种功能基因的 调控 表达的分子机理 目前还不是 很 明确 。因此，对第二类基因的表达特性及 下游基因 的 表达调控 研究 已经 成为近年来植物 抗逆 基因工程研究的热点 。 图 1生物逆境胁迫诱导表达的基因 的种类（ et 2007） he of et 2007) 2 非生物逆境胁迫应答的信号传递途径 植物感受外界 逆 境信号刺激后，通过各种途径将信号传递到细胞内的信号分子，引发一系列生理生化反应抵抗外界环境胁迫造成的危害 （ et 2007） 。干旱、高盐及低温是典型的环境刺激因子， 导致植物细胞 引起的水分胁迫 、 改变细胞膜的流动性 、 产生离子和渗透胁迫（ et 2002） 。目前 ， 研究 发现 ：在干旱、高盐和低温条件下植物体内主要 存在 3 条逆境信号传导途径：不依赖于 径 、 依赖于 号路径 及 号路径（ et 1997; et 2002） （图 1。 中国 农业科学院博士学位论文 第一章 引言 3 图 1物主要的逆境信号传导途径（ et 2002） 1in et 2002) 依赖 号 途 径 （ ） 白激酶 参与了 植物细胞的生长、分裂和胁迫响应等过程（ et 2002）。 应包括三种形式 ，即 酶。 当 胞外 产生逆境 信号 时，通过受体传 到 联系统， 多种磷酸化 首先 激活，去磷酸化一个 具有蛋白磷酸化活性的 次 磷酸化 而 激活 图 1 使细胞产生特定的生理反应（ et 2000; et 2002）。最终， 由转录因子来调控、激活下游许多功能基因的表达， 如脯氨酸、可溶性糖类、各种活性氧清除酶类等（ et 2002; et 2007）。在烟草中发现： 另外一个蛋白激酶 是由渗透胁迫激活，而且这种激活是不依赖 et 2003）。 赖于 的 号 传导途 径 （ ） 干旱、高盐及低温都会导致 度 瞬间升高，说明 为第二信使参与了植物逆境胁迫信号的传导（ et 2000）。 一类钙调素依赖型的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶，其 是一类主要的 合蛋白。大量研究表明：在干旱 等 逆境胁迫下， 植物 细胞内 度 和肌醇三磷酸（ 浓度增加，