【毕业学位论文】（Word原稿）辣椒分子连锁图谱的构建及抗疫病QTL定位-蔬菜学硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 学位论文 辣椒分子连锁图谱的构建及抗疫病 位 ap ap I 摘 要 辣椒是世界上最重要的蔬菜作物之一， 辣椒疫病 (.) 是一种毁灭性的土传病害 , 在世界各地均有发生，且有逐年加重的趋势。世界许多辣椒生产国已将辣椒抗 疫病育种作为辣椒育种的主要目标之一 , 我国从 “八 五 ”开始将选育辣椒抗疫病品种列入了国家科技攻关项目。 本研究用抗辣椒疫病的材料 “与 综合 园艺性状优良 的高 感 材料 “83及其 群体（ 144 株）为试材，采用 术，利用亲本从 物组合中筛选多态性引物，在 椒分子遗传图谱的构建 及 研究。本研究得到如下结果： （ 1） 从 512 对 物组合中筛选出具有多态性 的引物组合 380 对 ，应用其中的 28 对引物组合在 群体中进行抗病性标记的分析。得到 146 个多态性标记，结合 子标记（胡勇胜，硕士论文），应用 件进行分析，取 等于 ，构建了一张有 12 个连锁群， 70 个分子标记的辣椒分子连锁图谱，其中 54 个为 子标记。 图谱覆盖长度为 每个连锁群长度在 间，标记间平均图距为 （ 2） 采取切茎法进行抗病性鉴定 ，病原菌为辣椒疫霉菌 ( )长沙分离株，在 养基上 恒温培养 3 天， 浓度为 103 个游动孢子 /种 10 天后调查发病情况。以病斑长度和病斑形态进行抗病性分级。 0 级 24 株、 1 级 29 株、 2 级 41 株、 3 级 20 株、 4 级 18株、 5 级 12 株。 （ 3） 运用 件的区间作图法进行 析。应用能，计算出显著 值区间是 在第四连锁群上检测到 2 个 点 ，一个 点的 为 在连锁群上的支持区域是 0 距离最近的标记 一个 点的 为 连锁群上的支持区域 是 距离最近的分子标记 7个 释表型差异的贡献率分别为 本试验的研究结果为分子标记辅助育种提供可 参考 的标记，为加快辣椒抗疫病优良品种的 培育提供可 能的途径。 关键词 ：辣椒 ， 抗疫病 ， 分子连锁图谱 ， 分子标记辅助育种 I is of in As a . in is a . in . in &D In a F2 44 83of 2 a of TL . as (1) 380 of 12 of 28 of to of 2 146 A of on 2 by 4 5 , 2 an (2) to . , 832 .,DA at 8 03 in 0th (to of (3) ,000on , of TL is 41TL is 41of of of 文缩略表 缩写符号 英文名称 中文名称 扩增片断长度多态性 过硫酸铵 碱基对 2 混合分离个体分析法 酶解扩增多态序列 厘摩尔根 十六烷基三甲基溴铵 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 标记辅助选择 聚丙烯酞胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 脉冲电场凝胶电泳 聚乙烯毗咯烷酮 随机扩增多态性 限制片段长度多态性 序列特异扩增区域 简单重复序列 硼酸电泳缓冲液 缓冲液 N,N,N,N四甲基乙二胺 录 第一章 文献综述 . 1 1 1 辣椒疫病的研究概况 . 1 1 1 1 辣椒疫病 . 1 1 1 2 辣椒疫病抗源的筛选 . 1 1 1 3 辣椒疫病接种鉴定方法 . 2 1 1 4 辣椒抗疫病遗传规律的研究 . 2 1 2 分子标记技术 . 3 1 2 1 分子标记的类型 . 3 1 2 2 分子标记在辣椒育种上的应用 . 4 1 2 3 术在蔬菜育种中的应用 . 4 1 3 分子遗传图谱 . 6 1 3 1 亲本选择 . 6 1 3 2 作图群体 . 6 1 3 3 作图群体的大小 . 7 1 3 4 辣椒分子遗传图谱的研究进展 . 7 1 4 数量性状基因定位方法及应用 . 8 1 4 1 位方法 . 8 1 4 2 辣椒抗疫病的 析 . 9 1 5 研究目的、意义及试验设计 . 10 1 5 1 研究目的及意义 . 10 1 5 2 试验设计 . 11 第二章 辣椒分子连锁图谱的构建 . 12 2 1 材料与方法 . 12 2 1 1 试验材料 . 12 2 1 2 模板 提取 . 12 2 1 3 析及反应体系的优化 . 12 2 1 4 标记数据记录 . 16 2 1 5 数据统计分析 . 16 2 2 结果与分析 . 16 2 2 1 提取 . 16 2 2 2 应体系的优化 . 17 2 2 3 利用亲本进行 物筛选 . 17 2 2 4 构图分子标记的筛选 . 19 2 3 辣椒分子连锁图谱的构建 . 22 2 4 小结 . 22 第三章 辣椒抗疫病 位 . 24 3 1 材料与方法 . 24 3 1 1 试验材料 . 24 3 1 2 辣椒疫病人工接种鉴定 . 24 3 1 3 数据统计分析 . 24 3 2 结果与分析 . 25 3 2 1 抗病性鉴定结果 . 25 2 2 析 . 29 3 3 小结 . 30 第四章 讨 论 . 32 4 1 试验亲本及作图群体的选择 . 32 4 2 辣椒疫病抗病性鉴定方法 . 32 4 3 辣椒分子遗传图谱的构建 . 32 4 4 辣椒抗疫病 析 . 33 第五章 全文结论 . 32 5 1 采用切茎法进行辣椒疫病的人工接种及抗病性鉴定 . 32 5 2 构建辣椒分子连锁图谱 . 32 5 3 初步检测到 2 个辣椒抗疫病性状的 . 32 参考文献 . 35 附录 . 38 致谢 . 41 作者简介 . 42 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 椒疫病的研究概况 辣椒 (.)是一种重要的蔬菜作物 ，为农民创造了很高的经济效益， 自 2002年以来我国的辣椒播种面积均在 130 万公顷以上， 在世界上排名第一 ，并且 种植 面积还在不断的增加。 该病于 1918 年首次在美国新墨西哥洲发现，现已在世界各辣椒产区普遍发生。近年来，国内很多地方都有大面积发生的报道，给辣椒生产 带来了很大的损失，使 农民的收入 受 到了严重的影响，我国从 “八五 ”开始将选育辣椒抗疫病品种列入了国家科技攻关项目。 椒疫病 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的一种毁灭性的土传病害。 辣椒疫霉菌（ .）是由 1922 年命名的，属于鞭毛菌亚门疫霉属。 辣椒疫霉菌的寄主范围很广，除可侵染辣椒外，还可侵染番茄、茄子等蔬菜。辣椒疫病是一种土传病害，病菌主要以卵孢子、厚垣孢子在病残体、土壤及种子上越冬，越冬后的病原菌在适合的条件下从植株根部入侵，病菌也会随着雨水或 灌溉进行传播。 温度对该菌潜育期影响较大，潜育期最适温度 25 35 。不同的季节土壤中病原菌的数量也明显不同（徐秉良 等 ， 1996）， 黄凤莲等 对辣椒疫霉病田土壤进行病菌分离、菌株配对培养、越冬存活形式等研究，发现病田土壤中的疫霉菌数量有明显的季节性变化，以 5 8 月最多，冬季和初春最少（黄凤莲 等， 1999）。 辣椒疫病是一种 易暴发、易流行、毁灭性很强的病害，该病一旦大暴发就 会导致 辣椒的大面积减产，甚至绝产 ， 所以在辣椒感病前或感病初期进行防治就特别重要。一般来讲，在感病初期采取的是化学防治或生物防治，化学防治 应 在植株地上部分发现病症前用药，如果在疫病大面积发生时再用药，就基本上没有效果；生物防治采用对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用的生防菌 在土壤和植物根际建立起有效的群体，控制或减少辣椒疫霉病菌孢子的产生，从而控制辣椒疫病的流行。 在 病害 发生后进行防治 通常 效果 都不理想，所以至今还没有一种有效的疫病防治方法，而培育抗病品种可以解决这一问题。 培育抗病品种的主要方法 仍然是常规育种 ，但常规育种在进行抗性选择时操作程序较为繁琐，而且选育时间较长，也易受环境条件的影响。随着生物技术的 逐渐成熟 ，通过生物技术选育抗病品种已逐渐成为重要 的防治手段之一，即 子标记辅助育种。 椒疫病抗源的筛选 培育抗病品种的 关键 是寻找合适的抗源，有了合适的抗源材料，就为 抗 病品种的培育打下了良好的基础。 尖辣椒一般对疫病的抗性较强，甜椒大多不抗病。寻找优良的辣椒疫病的抗源 一般是在现有的辣椒主栽品种或 野生种 中 寻找及人工诱变。 目前 我国利用苗期灌根法鉴定了 2061份辣、甜椒种质资源对疫病的抗性，发现达到中抗以上的材料有 93份，其中可做抗源的有 9份（李振歧等，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 2005） （表 1） 。 表 1 我国筛 选的辣椒抗疫病材料 to of 全国辣椒科研育种工作者的共同努力下，采用合适的辣椒抗疫病的材料， 现 已育成了一批优良的抗（耐）疫病的辣、甜椒品种，其中包括苏椒 5 号、甜杂 6 号、中椒 5 号、碧玉、 85 1、西杂 1 号、西杂 2 号、 9185、湘研 2 号、湘研 3 号、湘研 5 号、哈杂椒 1 号等（李树德， 1995）。 椒疫病接种鉴定方法 准确可靠的抗病性鉴定结果是开发抗病分子标记的基础。 “八五 ”国家 攻关项目课题组（ 1992）制定了辣椒苗期对 简述如下 ： 选择本地区致病力中等偏上 、 来源于青椒上的辣椒疫霉用于接种鉴定。接种体的制备 ， 推荐使用 养基或 V 8 汁液体培养基 ， 25 28 条件下 , 前者光照培养 7 10 d， 后者先暗培养 3 4 d 后 ， 再培养 3 4 d。 近年来，一些学者对影响抗病性鉴定结果的因素做了进一步的 研究， 林柏青等 （ 1994） 提出单株根际灌根接种 3000个游动孢子 , 与 “八五 ”攻关要求的 3一致，但认为接种苗龄应使用 60日龄幼苗； 毛爱军 （ 1998） 提出接种量应为 5，接种苗龄为 8究发现，接种方法、接种体浓度、辣椒生育期、接种时的环境温度等对品种的抗病性有较大的影响 （林柏青等， 1994）。易图永等比较了离体叶片接种、切茎接种、游动孢子液灌根接种 3种方法对 8 个辣椒品种 (品系 )的影响。其中离体叶片接种法是从田间采集叶片进行室内鉴定，能够在短时间内检测多个品种，并且对植株的生长无明显影响，最适合对种质资源稀少株的生长无明显影响，最适合对种质资源稀少的品种进行抗疫病鉴定； 切茎接种法操作简单，可以测量病斑的长度，反映病斑的扩展 速度，适宜对抗病性进行量化；游动孢子液灌根接种法基本上模拟田间病害的发生过程， 最能反映品种的真实抗病性，但工作量大，操作较复杂 （易图永等， 2003） 。 所以 这 3种方法均能用于鉴定辣椒对辣椒疫霉菌的抗病性 在实验中可根据自己的实际情况选择合适的接种鉴定方法。 椒抗疫病遗传规律的研究 辣椒疫病的抗病机制比较复杂，最早开始对辣椒抗疫病遗传规律进行研究的是 et 1967） ,他从 1967 年开始研究 ,认为辣椒抗疫病是由两个显性基因控制的。在随后的几十年中，有许 多 学者也致力于辣椒抗 疫病遗传规律的研究，认为辣椒抗疫病呈遗传多样化的特点，不同的材料名称 选单位 of 料名称 选单位 of 119 北京农业大学蔬菜科学系 牛角椒 黑龙江省哈尔滨市农科所 苏省农科院蔬菜研究所 79 号 辽宁省农科院园艺研究所 941001 天津市农科院蔬菜研 究所 5904 湖南省农科院蔬菜研究所 93国农业科学院蔬菜花卉研究所 京市蔬菜研究所 关中线椒 西北农业大学园艺系 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 抗病品种，甚至不同的株系，其抗病性的遗传方式也会有差异。一般认为辣椒疫病的抗病性是由：单基因遗传、寡基因遗传或多基因遗传。 多年来，许多学者应用不同的抗病材料进行了辣椒抗疫病遗传规律的研究，作为研究对象的抗病材料基本上都属于 。 认为辣椒疫病抗病性是由单基因控制的，但是由一个显性基因还是一个隐形基因控制没有得到统一； 人认为是由寡基因，即两个显性基因或两个隐形基 因控制；进入 90 年代后，大多数学者的研究发现都倾向于多基因控制。之所以多位学者研究得到的结论不同，可能是由于在某些辣椒材料 中 水平抗性和垂直抗性并存，而且辣椒疫霉菌不同的生理小种的致病力也由差异。此外，不同的抗病性鉴定方法以及接种鉴定时的环境条件的差异，都会导致得到不同的结果。 子标记技术 分子标记是在 继形态学标记 、 细胞学标记及生化标记之后出现的 ， 经过二十多年的发展，分子标记已广泛地应用于种质资源遗传多样性研究、品种品系鉴定、遗传图谱构建、目的基因的定位和克隆以及标记辅助选择育种等各个方面。 子标记的类型 近年来用于蔬菜遗传育种上的分子标记越来越多 ， 分子育种与常规育种结合的方式已经成为育种工作主要的发展趋势 。 常用的分子标记包括 术 (扩增片段长度多态性 )、 术 (随机扩增多态性 微卫星技术 (简单重复序列 )等等， 每种分子标记技术都有其优缺点，可根据研究内容采用适合的分子 标记技术。 基本原理是基因组 用限制性内切酶切割 ， 然后将双链接头连接到 段的末端 ， 通过选择在 3端分别添加 1 3 个选择性碱基的不同引物 ， 选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合 ， 从而实现特异扩增 。 然后用聚丙烯酰铵凝胶电泳将扩增的 段分离。术近年来被广泛应用在图谱的构建、品种的鉴定等很多方面。 优点主要是所需少；多态性检测能力高， 能检测酶切位点不同造成的多态性，又能检测随机选择碱基造成的多态性；简单高效， 次选择扩增就能比较几十甚至 上百个位点；分辨率高，增片段短，片段多态性检出率高。 有自身的缺点 ： 技术流程长、难度较大，对操作人员的技术水平要求高；模板反应迟钝，谱带可能发生错配与缺失；成本较高。 以一个人工合成的随机寡核苷酸序列为引物 ， 通过凝胶电泳分析扩增产物 增片段多态性反应了基因组相应区域的 板 15 25纯度要求不高； 事先无需知道 没有种属的特异性 ， 一套引物可适用于不同基因组分析 ； 快速 ， 无需克隆制备、同位素标记、 10年来， 点是扩增产物易受反应条件的影响，实验结果的重复性差，这些缺点限制了其应用。 6个微卫星长度一般小于 同品种中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 或个体核心序列的重复次数不同，但重复序列两侧的 用与核心序列互补的引物，通过 复性好、共显性、在基因组中随机分布、操作简单。但是由于 而需要大量的人力、物力和时间，另外其种属特异性强，开发所需的费用高昂，因此一些实验室进行了合作，共同开发微卫星引物。 子标记在辣椒育种上的应用 分子标记技术在国内的广泛应用使得辣椒育种得到了很快的发展， 现 已将 子纯度的鉴定、遗传图谱的构建和基因定位等方面的工作。李丽等 （ 2004） 应用 记的方法对甜 (辣 )椒进行了多态性分析。黄三文等 （ 2001） 对辣椒 应的各个环节进行了筛选和优化 ， 确定了一个简单、高效、相对稳定的 统 ， 并筛选出 12 个较稳定的 记 ， 可以用于 “中椒 ”系列辣椒的 9 个杂交种的纯度鉴定。在基因定位方面，已有多个辣椒抗病及其他性状基因被定位，大多数的基因定位都是采用 子标记方法，也有少数基因定位应用的是 其它分子标记技术 （表 2） 。 术在蔬菜育种中的应用 辨率高等 优点，在蔬菜育种上得到了广泛地应用，主要应用在品种纯度鉴定、亲缘关系分析、图谱构建及基因定位等方面上。 种纯度鉴定 在亲缘关系较近，遗传背景较窄的蔬菜品种纯度鉴定方面， 比常规的根据田间表型性状的鉴定方法相比，利用分子技术鉴定有着简单、方便、用时短等优点。 常被用来进行品种纯度的鉴定。 有研究者 利用 个甘蓝杂交组合及其 到了清晰的 雷等， 2001）。 缘关系分析 利用分子标记技术进行亲缘关系的分析是在 受外界环境的干扰，准确性高。孙德岭等（ 2001）利用分子标记技术对白菜类蔬菜间的亲缘关系进行了研究，使用 10对选择性引物组合，扩增出 4173条扩增带，并对其进行聚类分析，结果表明：芜菁与结球白菜和不结球白菜亲缘关系远；而结球白菜与鸡冠菜和毛白菜亲缘关系较近，与其它不结球白菜亲缘关系较远。顾兴芳等（ 2000）利用 果认为： 用该技术对黄瓜进行遗传多样 性和物种亲缘关系分析是完全可行的。 谱构建 分子遗传图谱的构建是蔬菜遗传研究的重要内容之一，建立有效的、准确的遗传图谱是基因定位、基因克隆的基础。 复性好，且在一次相互实验中可观察到大量的 以目前 卢刚等利用白菜和芜菁杂交建立的 建了含 131个 盖 1810 9（卢 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 表 2 辣椒主要抗病基因及其它性状的 位 in 状 关基因 图群体 ( 数目 ) 图标记 （ 数目） 在染色体or 献 节花数 22(46) 218) 2， P， 1993 抗 69) 117) , 1995 果实形态 H(169) 117) , 1995 控制辣味 c 69) 117) , 1995 控制果实颜色 2(151) , 1998 抗疫病 18H(94) 9 同工酶 1 表型 5 003 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 ，1996 抗 ，1996 抗 H(94) 38 ， 1997 抗 2(151) ， 1999 抗细菌性斑点病 H， 1999 抗 2(153) 10 ， 2000 抗 3(29) 0 C， 2000 抗 2(200) 0 ， 2000 育性恢复 2 X， 2000 抗白粉病 5H(101) 4 5,6,9,10,12 ， 2003 果实相关性状 53(183) B， 2001 产量相关性状 848) 2 U， 2003 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 刚等， 2002）。 2群体为作图群体，将 177个标记（ 建了一张辣椒分子遗传图谱（ B et 2001）。 因定位 基因定位是以后基因分离及克隆的基础，质量性状的基因定位一般是利用近等基因系或分离群体分组分析法（ （ 1995）利用 术结合 检测与番茄抗叶霉病基因 密连锁的标记，在 78 对引物所产生的 42000 个 段中，发现了 3 个标记与 因表现共显性，通过转座子标记法分离 因，分析含此基因的质粒克隆，将其中 2 个 因 位点两侧约 区域内。蔬菜很多的农艺性状和抗病性状都是数量遗传，数量性状的基因定位，即 位也被研究得越来越多。郜刚等（ 2005）运用 记技术对马铃薯青枯病抗性基因进行了定位。郑晓鹰等（ 2002）将大白菜耐热品种 177 和热敏感品种 276进行杂交，从杂交后代中获得遗传性稳定的重组近交系群体，采用 术并结合 同工酶方法鉴定了与大白菜耐热数量性状相关的遗传标记，单因子方差分析和多元线性回归分析检测到了 9 个与耐热性 密连锁的分子标记。 1 3 分子遗传图谱 在蔬菜作物中， 目前已构建了番茄、马铃薯、辣椒、莴苣、甘蓝、胡萝卜、芥菜、豌豆、黄瓜、白菜 、 芹菜等约 20种蔬菜遗传图谱 ， 其中有些图谱包含了上千个分子标记（陆朝福等， 1995）。其中番茄和马铃薯的遗传图谱相对其他蔬菜作物更为饱和。 本选择 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一要选择 态性好的作为亲本，这样图谱上连锁的标记就会越多，图谱的经济价值也就越大；二要选择纯度较高的材料作为亲本； 三要考虑亲本杂交后代的可育性。在已构建成的辣椒分子遗传图谱中， 种间亲本的多态性 较 好（ et 1993； et 1999） ，但 如果从育种的实际意义来考虑，种 内 图谱则更有优越性，较为常用的抗源材料有 些材料都属于 et 995； et 002； 张宝玺， 2003） 。 图群体 到目前