课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题多聚酶链式反应扩增DNA片段目标导读1.PCR技术与DNA复制的区别和联系，掌握PCR技术原理。2.分析PCR的过程，掌握PCR循环的原理。3.掌握PCR技术的实验操作过程及注意事项。4.掌握DNA含量测定的方法。1.酶的作用需要适宜的和，温度过高、过酸和过碱都会破坏。2.DNA分子双螺旋结构写出各个标号的名称：；。.DNA分子双螺旋结构的特点(1)DNA的两条链是的，为了明确表示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为端，将磷酸基团的末端称为端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。(2)DNA分子中的交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；排列在内侧。(3)两条链上的碱基通过连接成碱基对。碱基配对的规律是：A与T配对，G与C配对。碱基之间的这种一一对应的关系，叫做原则。.DNA分子复制是指以亲代DNA的每一条链为合成子代DNA的过程。这一过程是在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂前的间期，随着的复制而完成的。.细胞内DNA复制的过程(1)解旋：DNA分子首先利用细胞提供的能量，在的作用下，把两条螺旋的双链解开。(2)合成子链：分别以解开的为模板，以游离的四种为原料，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链。(3)形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成结构，从而形成两个与亲代DNA的DNA分子。探究点一PCR原理多聚酶链式反应简称，是技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。1.细胞内DNA复制条件分析条件组分作用模板提供复制的模板原料合成DNA子链的原料酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量为解螺旋和合成子链供能引物为DNA聚合酶提供合成的3端起点2.细胞内DNA复制过程的解析解旋作用下，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链端，通过碱基互补配对与DNA母链结合。DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来，子链和母链再形成双螺旋结构。3.PCR技术的原理(1)PCR技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)子链扩增：需要，合成方向总是从子链的端向端延伸。(3)解旋原理：DNA的热变性原理。在的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新。(4)条件：模板：。引物：。关于引物：(1)特点：引物是一小段DNA或RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对，用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。(2)需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此必须要引物才能完成DNA复制。原料：。酶：，一般用耐高温的TaqDNA聚合酶。其他条件：需要一定的溶液和能严格控制的温控设备。4.PCR技术的过程(1)变性当温度上升到以上时，双链DNA为单链。(2)复性温度下降到左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸温度上升到左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在酶的作用下，根据原则合成新的DNA链。PCR反应的结果,(1)72左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸。,(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。归纳提炼生物体内DNA复制和PCR的区别体内复制PCR反应解旋引物合成子链特点TaqDNA聚合酶循环次数相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸作原料、酶，子链延伸的方向都是从5端到3端，且都需要在一定的缓冲溶液中进行课堂训练1.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的_键完全打开，称为_；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入_种特定的引物。当温度降低至55时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的_端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的_和_，前者由_自动调控，后者则靠_来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是_。.用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸，是一小段()A.DNAB.RNAC.单链DNA或RNAD.双链DNA、符合PCR反应条件的一项是()稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制酶温控设备A.B.C.D.从第二次循环开始，复制的DNA片段呈_扩增()A.直线B.指数C.对数D.不变.PCR利用了DNA的哪种特性原理，来控制DNA的解聚与结合()A.特异性B.稳定性C.热变性D.多样性.如图是PCR技术示意图，请回答下列问题：(1)标准的PCR过程一般分为_、_、_三大步骤。(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上来说，引物是一小段_。(3)将双链DNA_，使之变性，从而导致_。(4)引物延伸需提供_作为原料。基础过关知识点一PCR原理1.下列有关PCR的叙述，不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.PCR反应中的目的片段一般以2n指数扩增D.扩增对象是氨基酸序列2.PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA核糖体A.B.C.D.3.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A.B.C.D.4.PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。下列防止污染的办法中不正确的是()A.将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行B.吸样枪吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，枪头小套、小离心管应一次性使用，以免交叉污染C.所有PCR试剂都应放置于大瓶分装，以减少重复加样次数，避免污染机会D.PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱5.如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是()A.向右的过程为加热(80100)变性的过程B.向左的过程是DNA双链迅速致冷复性C.变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D.图中DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3端6.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A.92、50、72B.72、50、92C.50、92、72D.80、50、727.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物()A.第一次循环B.第二次循环C.第三次循环D.第四次循环8.PCR操作过程中，对于温度的控制，应当控制在()A.37B.室温C.80D.先为95，然后降至55，最后调至72能力提升9.下列有关PCR技术的叙述，不正确的是()A.多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸10.下列有关PCR反应的叙述，正确的是()A.PCR反应所需要的引物只是RNAB.PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸C.PCR反应所需要的酶在60会变性D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行11.PCR利用了DNA的热变性原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。下列对PCR过程中“温度的控制”的说法，错误的是()A.PCR反应需要高温，是为了确保模板是单链B.延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度C.要用耐高温的DNA聚合酶D.需要耐高温的解旋酶12.在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是()A.TaqDNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制B.系统设计欠妥C.循环次数不够D.引物不能与亲链结合13.下列有关PCR技术的说法，不正确的是()A.PCR技术是在细胞内完成的B.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术C.PCR技术的原理与DNA复制的原理相同D.PCR技术的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列14.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答下列问题。(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理的叙述，正确的是()A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键C.该过程不需要解旋酶的作用D.该过程与人体细胞的过程完全相同(2)C过程要用到的酶是_。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以_加入，_(需要/不需要)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有_。(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“955572”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_。(4)如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸_个。(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于_。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占_。DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占3/4。15.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，因而被广泛应用，此过程需要一种TaqDNA聚合酶。(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用_。(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？_。TaqDNA聚合酶的功能是_。为了使TaqDNA聚合酶能够多次反复利用，可采用_技术，常用的方法为_。(3)从土壤中分离分解尿素的细菌时，应采取的措施是_，原因是_。(4)相对于细菌分离，DNA分子的分离和提取操作要复杂的多。在DNA提取中两次用到蒸馏水，其目的分别是：_、_。实验中能否以哺乳动物成熟的红细胞为实验材料？为什么？_。(5)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在_中才能进行，并且要严格控制_条件。(6)PCR中加入的引物有_种，加入引物的作用是_。答案(1)高温使DNA分子热变性(2)热泉7080的高温条件淘汰了绝大多数微生物催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键固定化酶化学结合法、物理吸附法(3)将细菌在培养基中培养，其中唯一的氮源是尿素只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长和繁殖(4)使血细胞破裂，释放出DNA分子稀释NaCl溶液，使DNA分子析出不能，哺乳动物成熟的红细胞中无DNA分子(5)一定的缓冲溶液温度(6)2作为DNA复制的起点个性拓展16.PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，操作步骤简介如下：第步：准备“汤”和模板DNAA.配制多聚酶链式反应“汤”配方：蒸馏水100SPU缓冲液15SPU氯化镁溶液8SPU引物3SPU引物3SPUDNA聚合酶1SPU矿物油1SPUdNTP每一种各加4SPU注：SPU是一种溶液的计量单位；矿物油可防止聚合酶在冻结时受伤害，以保证酶的活性；dNTP有四种：dATP、dGTP、dCTP、dTTP。B.准备要拷贝的DNA如要拷贝自己的DNA，可以用一牙签轻刮口腔内壁，将牙签放入蒸馏水中摇动。加热使蒸馏水沸腾，使细胞破碎释放出DNA。用离心机离心后，去除蒸馏水中较大的细胞碎片。这时上清液中就有了较纯的DNA。第步：多聚酶链式反应将DNA(B)放入汤(A)中。水浴加热。首先，95，使DNA双螺旋打开，历时1min；然后，55，使引物结合到DNA上，历时30s；最后，72，与DNA聚合酶结合使DNA复制，历时1min。重复步骤。每重复一次，即完成一次拷贝。根据上述操作过程回答下列问题：(1)以上材料可以说明()A.DNA的复制必须在活细胞中才能完成B.DNA能指导蛋白质的合成C.在合适的条件下，非细胞环境也能进行DNA的复制D.PCR技术是一种无性生殖技术(2)若用人体细胞内的遗传物质做PCR扩增，则扩增后的几百亿个DNA分子起码可分为46种。要将其分开，可用电泳、染色等技术，常用的试剂有溴化乙锭等。有些试剂毒性较强，因此应戴上化学实验专用手套作