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不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响 研究论文中国动物传染病学报不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响徐晓伟1,2，魏建超2，刘珂2，邵东华2，李蓓蓓2，曹瑞兵3，陈溥言3，马志永2，胡敬东1,邱亚峰2（1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海xx41；3.南京农业大学动物医学院，南京210095）摘要为了研究不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染的影响，并明确NO的产生在此过程中的作用，利用细胞因子将小鼠巨噬细胞系RAW264.7诱导成不同激活状态的巨噬细细胞，通过TCID 50、免疫荧光技术和实时荧光定量PCR方法比较JEV强毒株NJxx在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况，并利用实时荧光定量PCR方法分析了调控NO产生的关键分子（iNOS和Agr1）的变化。 结果显示，相对于PBS处理组，M1型巨噬细胞显著地抑制JEV的感染并伴随明显增加的iNOS/Arg1比值；而M2型巨噬细胞虽伴随有显著降低的iNOS/Arg1比值，但JEV在M2型巨噬细胞上的感染与PBS组差异无显著统计学意义。 结果表明NO的上调表达在M1型巨噬细胞抑制JEV感染中起着主导作用。 本研究为进一步揭示巨噬细胞在JEV感染中作用奠定基础。 关键词流行性乙型脑炎病毒；巨噬细胞；M1型巨噬细胞；M2型巨噬细胞S852.659.6文献标志码A1674-6422 （2019）02-0001-05PARATIVE ANALYSISOF JAPANESEENCEPHALITIS VIRUSINFECTION INMACROPHAGES WITHDIFFERENT POLARIZEDPHENOTYPESXU Xiao-wei1,2,WEI Jian-chao2,LIU Ke2,SHAO Dong-hua2,LI Bei-bei2,CAO Rui-bing3CHEN Pu-yan3,MA Zhi-yong2,HU Jing-dong1,QIU Ya-feng2(1.College ofAnimal Scienceand Technology,Shandong AgriculturalUniversity,Taian271018,China;2.Shanghai VeterinaryResearch Institute,CAAS,Shanghaixx41,China;3.College ofVeterinary Medicine,Nanjing AgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)2018-06-08基金项目上海市自然基金（15ZR1449800）；国家重点研发计划课题（xxYFD0500404）；中国农业科学院青年英才项目（CAASQNYC-KYYJ-26）作者简介徐晓伟，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者胡敬东，E-mailhjd1968163.；邱亚峰，E-mailyafengqshvri.ac.2019,27 (2):1-5Abstract:The effectof macrophages with different activated phenotypeson Japanese encephalitis virus(JEV)infection wasstudied withtitration(TCID50),immunof luorescence assayand real-time qPCR.Mouse macrophageswere polarizedby differentcytokines includingIFN-or IL-4and the role ofNO productionduring JEV infection wasanalyzed interms ofexpression of iNOS and Arg1by usingreal-time qPCR.The resultsshowed thatM1macrophages withincreased ratioof iNOS/Arg1clearly inhibitedJEV infectionas paredwith PBS-treated macrophages.In contrast,M2macrophages withdecreased ratioof iNOS/Arg1showed noeffect onJEV infection in22019年4月中国动物传染病学报parison ofPBS-treated controls.These resultsdemonstrated thatmacrophageswithdifferent polarizedphenotypes playeddifferent roles in JEVinfection.Furthermore,the up-regulation ofNO inM1macrophages mainlycontributed toinhibition of JEVinfection.Thus,this studyprovided thebasis ofbetter understandingtheroleof macrophagesin JEVinfection.Key words:Japanese encephalitis virus;macrophage;M1macrophage;M2macrophage流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种神经嗜性的黄病毒1。 该病毒通过蚊子传播，可感染水鸟、猪、犬等多种宿主，表现为病毒性脑炎，又称日本乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）。 人和马是JEV的终末宿主。 JE的分布具有一定的区域性，主要分布在南亚和东南亚地区。 根据世界卫生组织的统计数据，JEV感染每年可导致1000015000人死亡2-3。 JEV感染具有重要的公共卫生意义，但是，目前对JE的免疫致病机制的理解还不十分清楚。 巨噬细胞是机体的主要免疫细胞，在宿主的先天性免疫和获得性免疫反应中都起着重要的作用。 在蚊子叮咬过程中，巨噬细胞如朗汉斯细胞是最先识别JEV感染的免疫细胞。 研究显示，相对于非免疫细胞如Vero细胞4、MEF细胞等5，巨噬细胞具有明显的抑制JEV感染作用，这与巨噬细胞诱导快速及高水平的I型干扰素相关。 另外，激活的巨噬细胞如IFN-诱导的巨噬细胞，可通过促进NO的产生抑制JEV的复制6。 因此，巨噬细胞的激活状态影响JEV的感染。 根据激活状态，巨噬细胞主要分为M1型巨噬细胞（主要由Th1细胞因子如IFN-等诱导产生）、M2型巨噬细胞（主要由Th2细胞因子如IL-4等诱导产生）7-8。 虽然已有的研究显示M1型巨噬细胞可通过促进NO的产生抑制JEV的复制，但是，目前对M2型巨噬细胞是影响JEV感染的具体机制还不清楚。 为了解析不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响，本研究利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为模型，分别通过IFN-和IL-4将巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，分析JEV强毒株NJxx9在巨噬细胞中的感染情况。 1材料和方法1.1细胞和病毒C6/36细胞由本实验室保存，培养于含有10%胎牛血清的SF9培养基中，置于28的细胞培养箱中培养。 BHK-21细胞和RAW264.7细胞购置于中科院细胞库，于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO 2、37细胞培养箱中培养。 上述培养基、胎牛血清购自Thermo Fisher公司。 利用C6/36细胞对JEV强毒株NJxx进行增殖，随后对增殖好的病毒利用BHK-21细胞进行病毒滴度测定。 1.2试剂与抗体小鼠重组细胞因子IFN-和IL-4购自R&D公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR GreenqPCR Mix购自TaKaRa公司；抗JEV NS3多克隆抗体10由本实验室保存；荧光标记的二抗购自Invitrogen公司。 1.3M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的制备及病毒感染将RAW264.7细胞传至24孔培养板，等长到70%满时，加入细胞因子IFN-（终浓度100ng/mL）或IL-4（终浓度200ng/mL），同时设有PBS对照组。 加入IFN-或IL-4后24h，细胞接种10MOI JEV毒株NJxx，孵育2h后，PBS洗2次，换为含有5%胎牛血清的培养基培养至特定感染时间时，进行样品的制备。 1.4间接免疫荧光分析首先，将灭菌玻片放入24孔板中，按照上述的方法分别制备不同激活状态的巨噬细胞并接种10MOI JEV毒株NJxx。 接毒后24h，用4%的多聚甲醛进行固定，进行免疫荧光分析。 利用1%NP-40打孔后，加入封闭液，室温孵育30min；加入一抗，室温孵育30min，洗涤3次；加入已稀释好的二抗，继续孵育30min后，洗涤3次；加入DAPI进行细胞核染色，最后洗涤3次后，进行封片；利用荧光显微镜进行分析和拍照记录。 1.5实时荧光定量PCR病毒感染24h后，利用TRIzol试剂裂解不同激活状态的巨噬细胞，根据说明书进行总RNA的提取，然后利用反转录试剂盒制备cDNA。 用于实时荧光定量PCR的引物由Invitrogen公司合成。 扩增Arg 1、iNOS及GAPDH引物序列见文献11；扩增JEV E基因的引物序3第27卷第2期徐晓伟等不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响列分别为JEV E-forward5-CCTCCGTCACCA TGCCAGTCTTAG-3，JEV E-reverse5-TTCGCC ATGGTCTTTTTCCTCTC-3。 然后，根据SYBR GreenqPCR Mix的说明书，进行PCR反应试剂的配置，具体的反应条件95预变性30s；95变性5s；60退火30s,40个循环。 通过与内标GAPDH进行比对获得相对表达量。 2结果2.1JEV强毒株NJxx在巨噬细胞及非巨噬细胞上的生长特性分析研究表明，相对于非免疫细胞，巨噬细胞显示出明显的抗JEV的作用。 JEV毒株NJxx在巨噬细胞上的感染特性，还不清楚。 因此，我们对毒株NJxx在BHK-21细胞和RAW264.7细胞生长特性进行了分析。 根据前期结果，在病毒感染前12h，毒株NJxx感染维持一个较低的病毒滴度（结果未显示）。 为此，本研究在病毒感染后 12、 24、48h取细胞上清，通过TCID50的测定比较JEV毒株NJxx在BHK-21细胞和RAW264.7细胞上的感染情况。 结果显示，尽管毒株NJxx可以在巨噬细胞和非巨噬细胞上造成持续感染，但是，相对于在BHK-21细胞上感染增殖情况，毒株NJxx在巨噬细胞上的复制明显受到了抑制，具体结果见图1。 Hours-post infectionsL o g10T CI D50/m L12h24h48hBHK-21细胞RAW264.7细胞图1JEV毒株NJxx在BHK-21细胞和RAW264.7细胞上的生长特性分析（*P0.05）Fig.1Growth characteristicsanalysis ofJEV strain NJxxon BHK-21cells andRAW264.7cells(*P0.05)2.2不同激活状态的巨噬细胞对JEV强毒株NJxx感染的影响已有的研究显示M1型巨噬细胞即IFN-诱导的巨噬细胞对JEV具有明显的抑制作用，而M2型巨噬细胞对JEV感染影响还不清楚。 本研究比较了毒株NJxx在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况。 鉴于在JEV感染后24h，病毒滴度已达到高峰，本研究选择病毒感染后24h进行样品的制备。 结果显示，相对于PBS组，M1型巨噬细胞显著地抑制JEV的复制，培养上清中检测不到病毒；相对于PBS组，JEV对M2型巨噬细胞的感染没有发生显著的变化，结果详见图2。 利用间接免疫荧光方法检测不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响。 在感染JEV毒株NJxx后24h，IFN-处理组未发现阳性感染细胞，但是，PBS处理组和IL-4处理组发现了很多感染细胞，结果见图3。 Log10T CI D50/m LGroups图2感染JEV毒株NJxx的不同激活状态巨噬细胞上清中病毒滴度分析Fig.2Virus titeranalysis insupernatants ofdifferentactivatedmacrophages infectedwith JEV strainNJxxNS:差异不明显;ND:没有检测到病毒NS:Not statisticallysignif icant;ND:No detection2.3不同激活状态的巨噬细胞影响JEV感染的可能机制巨噬细胞抑制JEV感染的机制可能有多种，有研究显示M1型巨噬细胞即IFN-处理的巨噬细胞主要通过诱导NO的产生介导抗JEV的作用。 进一步，在巨噬细胞中，NO产生取决于诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）的表达情42019年4月中国动物传染病学报况，同时，iNOS和Arg1分别为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的指示标志。 最后，我们利用相对定量PCR对调控NO产生的iNOS和Arg1的表达情况以及JEV的感染情况进行了检测。 结果显示，相对于PBS处理组，IL-4处理组显著地上调Arg1的表达并抑制iNOS的表达（图4），从而降低iNOS/Arg1的比值（ratio=0.0005）；而IFN-处理组也可上调Arg1的表达，但更显著上调iNOS的表达（图4），从而显著上调iNOS/Arg1的比值（ratio=13.266）。 此外，荧光定量PCR结果显示，相对于PBS组，IFN-处理组中的E基因的水平显著降低，而IL-4处理组中E基因的水平没有差异（图5），与上述TICD50和间接免疫荧光的结果相符。 图3间接免疫荧光法分析NJxx在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况Fig.3Analysis ofJEVstrainNJxxinfectionin differential activationof macrophagesby IFA3讨论巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，在宿主免疫防御中起着重要的作用。 本研究结果表明，相对于非免疫细胞，巨噬细胞显示出较强的抑制JEV感染的作用。 进一步的研究表明，不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的作用不同相对于非激活状态的巨噬细胞（PBS处理组）或M2型巨噬细胞，型巨噬细胞显示出明显的抑制JEV感染的作用；而M2型巨噬细胞，相对于PBS组并没有显示出明显的抑制或促进JEV感染的作用。 本研究较系统地比较了不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响，为将来揭示巨噬细胞在JEV感染中作用提供参考和依据。 JEV感染巨噬细胞维持一个相对较低的病毒滴度。 首先，这与JEV感染巨噬细胞诱导I型干扰图4荧光定量PCR分析iNOS(A)和Arg1(B)在不同激活状态的巨噬细胞上的表达情况（*P0.05）Fig.4Expression analysisofiNOS(A)andArg1(B)in different infected macrophagesby real-time qPCR(*P0.05)图5实时荧光定量PCR分析JEV E基因在不同激活状态的巨噬细胞上的表达水平（*P0.05）Fig.5Quantitative analysisofJEV E geneindifferentinfected macrophagesby real-time qPCR(*P0.05)R el ativ ee xp re ssi o no fJ EVE（%G AP DH）GroupABF ol di nd uc tion5第27卷第2期徐晓伟等不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响素的产生相关。 他人研究显示JEV感染巨噬细胞RAW264.7后12h已激活I型干扰素的产生，从而限制病毒的扩散，抑制已感染细胞中病毒的复制4。 相对于I型干扰素，IFN-主要通过诱导NO的产生抑制JEV的复制6。 在巨噬细胞中，Th1型细胞因子IFN-显著上调iNOS的表达，继而上调表达的iNOS可利用精氨酸促进NO的产生；相对而言，Th2型细胞因子IL-4显著上调Arg1的表达，然而Arg1仅消耗精氨酸不产生NO。 为此，在巨噬细胞中iNOS/Arg1的比值对巨噬细胞的激活状态以及NO的产生具有指导作用。 本研究显示IFN-诱导的M1型巨噬细胞表达较高水平的iNOS，并且明显地抑制JEV的感染，这一结果与上述结果相符。 因此，这些结果显示巨噬细胞具有较强的抗JEV感染的作用，不仅可通过快速产生I型干扰素抑制病毒的感染，而且可通过诱导NO的产生进一步发挥抗JEV感染的作用。 Th2免疫反应促进M2型巨噬细胞的产生。 有研究显示，Th2免疫反应对JEV感染具有保护作用，这主要是与Th2免疫反应抑制促炎性因子的表达，同时，也与增加JEV特异的抗体滴度相关12。 然而，对Th2免疫反应诱导的M2型巨噬细胞在JEV感染中的作用还不清楚。 我们研究结果显示，尽管Th2细胞因子抑制促炎性因子的产生（结果未显示），促进Arg1的产生，但有意思的是，与PBS组相比，M2型巨噬细胞并未抑制JEV的复制。 这一结果进一步说明了Th2免疫反应介导的抗JEV作用，主要与抑制促炎性因子的产生及增加病毒特异的体液免疫反应相关。 总之，本研究通过体外试验明确了M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞对JEV感染的影响，不仅丰富JEV与巨噬细胞相互作用的知识，而且为将来进一步揭示巨噬细胞作为一种抗原提呈细胞在JEV感染中的作用奠定基础。 参考文献1Ghosh D,Basu A.Japanese encephalitis-a pathologicaland clinicalperspectiveJ.PLoS NeglTrop Dis,xx,3 (9):e437.2Solomon T.Flavivirus encephalitisJ.N EnglJ Med,xx,351 (4):370-378.3Erlanger TE,Weiss S,Keiser J,et al.Past,present,and futureof Japanese encephalitisJ.Emerg InfectDis,xx,15 (1):1-7.4Adhya D,Dutta K,Kundu K,et al.Histone deacetylaseinhibition byJapanese encephalitisvirus inmonocyte/macrophages:a novelviral immuneevasion strategyJ.Immunobiology,xx,218 (10):1235-1247.5Wang 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