疾病治疗的新方法

疾病治疗的新方法,中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室邱 广 蓉,一、以分子生物学为基础的疾病治疗 1、药物遗传学有望提高药物疗效并减少副作用 个体对药物反应的差异： 与药物吸收、分布、代谢和清除的差异及靶受体的可变性有关。 依赖于多个基因常见多态性的组合 个体化治疗（芯片检测分析患者几百个常见多态位点的基因型，决定某病例中哪一种药物是安全有效。另外，也可能提供某药物可能引起危险的副作用。）,一、以分子生物学为基础的疾病治疗,2、基于细胞的治疗有望改变移植潜力 胚胎干细胞（ES细胞） 有能力控制和引导分化 有可能用于组织工程和组织修复,一、以分子生物学为基础的疾病治疗 3、基因工程生产重组蛋白和疫苗 胰岛素：动物中提取（如牛或猪）对人有较强的免疫源性 F因子：利用生化方法由人血中提取F 感染AIDS危险 生长激素：人垂体中提取的生长激素有“慢病毒”感染的危险 治疗性蛋白的基因工程生产-人胰岛素、F因子、生长激素 基因工程生产的疫苗-乙型肝炎疫苗（无感染风险）,基因治疗：将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿 因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗的 目的。,基因治疗的关键在于：基因转移 靶细胞 基因表达,二、基因治疗（Gene Therapy）,基 因 治 疗 策 略,基因修正（直接疗法） 定点导入外源正常基因，代替有缺陷的基因，而对 靶细胞基因组无任何改变。,基因添加（间接疗法） 非定点导入外源正常基因，而没有去除或修复有缺 陷的基因。,基 因 治 疗 策 略,靶向抑制基因表达 应用反义核酸技术，使基因表达抑制（如抑癌基因、自身免疫病的免疫应答等）,靶向杀伤特异细胞 导入细胞毒素基因、药物前体、细胞因子等，杀伤特异细胞，适用于肿瘤治疗,反义核酸技术介导的肿瘤基因治疗,是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断基因的转录或复制，控制细胞的中间阶段，使编码蛋白的基因不能转录为mRNA或阻断翻译相应蛋白.,反义核酸技术：,原理：在DNA、RNA、蛋白质水平实现靶向抑制,（1）在DNA水平 三联螺旋治疗人工合成特异寡核苷酸特异结合于DNA双螺旋，形成三螺旋阻止转录,原理：在DNA、RNA、蛋白质水平实现靶向抑制,（2）在RNA水平 与特异mRNA结合，抑制翻译 构建反义RNA表达载体（cDNA反向插入） 微注射或脂质体运输反义RNA 利用核酶特异降解靶RNA RNA干扰（RNAi）,原理：在DNA、RNA、蛋白质水平实现靶向抑制,（3）在蛋白质水平 细胞内抗体 应用基因工程手段，使细胞产生非分泌的、可与细胞内特异分子结合的细胞内抗体。,基 因 治 疗 的 基 本 步 骤,正常基因的克隆与分离,目 的 基 因 的 转 移,靶 细 胞 的 选 择,外源基因在靶细胞中有效表达,从基因组中获得,物 理 方 法,化 学 方 法,膜 融 合 法,受 体 介 导,病 毒 介 导,外周血T淋巴细胞,启 动 子,增 强 子,定 点 整 合,基 因 治 疗 途 径,根据基因转移的受体细胞的不同，分为：,（1）生殖细胞基因治疗 理想的治疗途径（2）体细胞基因治疗 常用的治疗途径,生 殖 细 胞 基 因 治 疗,将正常基因转移至患者的生殖细胞，使其发育成正常的个体。,是理想的治疗方法，从根本上杜绝遗传病在人群中的传播。,存在问题：（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展（2）基因转移效率不高，只能应用显微注射方法（3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，不适用于人类,体 细 胞 基 因 治 疗,将正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后回输体内。,可以定点整合，也可随机整合。,存在问题： （1）对特定基因座的基因转移，目前尚存在困难。 （2）随机的插入可能引起后代的基因突变,基 因 转 移 方 法,物理方法,电穿孔法 借助脉冲电流击穿靶细胞膜，使其通透性增加微粒子轰击法 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，将外源基因包裹形成微粒，应用可调电压产生的轰击波使其获得高速度（基因枪技术），瞬间进入靶细胞,基 因 转 移 方 法,物理方法,显微注射法（microinjection ）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中。,转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射 （体外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),基 因 转 移 方 法,化学方法磷酸钙沉淀法,目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。 方法简单，但转化效率低,基 因 转 移 方 法,化学方法磷酸钙沉淀法,Ca3(PO4)2 + DNA 混合微细颗粒 （Ca2+浓度：125 mmol，DNA浓度：530g/ml pH 7.0） 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,基 因 转 移 方 法,膜融合法脂质体法,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。,基 因 转 移 方 法,DNA 细胞融合 转化细胞,DNA,脂质体,仙苔病毒,PEG,基 因 转 移 方 法,受体介导基因转移,将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，可通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。,目的基因与去唾液酸糖蛋白耦连，使肝细胞能特异性吸收，并在肝细胞中表达。,基 因 转 移 方 法,同源重组法,外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。 将外源基因定点整合到受体细胞的特定位点。 单交换 双交换,基 因 转 移 方 法,病毒介导的基因转移,是通过病毒为载体，将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后感染受体细胞。,是最有效的转移目的基因的方法。,感染细胞,逆转录病毒载体单链RNA病毒常用病毒载体 腺病毒载体双链DNA病毒,逆 转 录 病 毒 载 体,逆转录病毒的组成：单链RNA和蛋白质,RNA 双链DNA 原病毒 RNA,病毒蛋白,逆转录酶,整合到宿主细胞,转录,翻 译,病毒颗粒,逆 转 录 病 毒 载 体,逆 转 录 病 毒 载 体,LTR LTR gag pol envU3 R U5 U3 R U5 U3=增强子 R=启动子 U5=转录起始位点 =病毒包装信号 gag =核心抗原 pol=逆转录酶 env=外壳蛋白,小鼠白血病病毒（Mo-MLV）,改建的逆转录病毒载体保留LTR和包装信号,逆 转 录 病 毒 载 体,（1）高效感染宿主细胞，转染率可达100%；（2）病毒基因和所载的外源基因都可能表达（3）宿主范围广，可同时感染大量细胞并长 期存留,优点：,逆 转 录 病 毒 载 体,缺点：,（1）病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段（2）病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大 的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度 表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达； （3）逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。 （4）只能感染正在分裂的细胞,腺 病 毒 载 体,优点：,（1）插入外源DNA片段长（2）不需要正在分裂的靶细胞（3）可以原位感染（4）病毒滴度高（5）一般不整合到宿主的基因组中，减少插入突 变的潜在危险,腺 病 毒 载 体,缺点：,不整合入宿主细胞基因组，因此不能在细胞内长期存在，需要反复给药，可能会引起对输注的腺病毒产生免疫反应，阻止重复感染。,受体（靶）细胞的选择,（1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；（2）易于由人体分离又便于输回体内；（3）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，或整个生命周期；（4）易于受外源遗传物质转化。,原则：,受体（靶）细胞的选择,常用细胞：,外周血T淋巴细胞皮肤成纤维细胞造血干细胞 地中海贫血、严重联合免疫缺陷病肝细胞 家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病,比较常用,人类的基因治疗,（1）单基因遗传病 12%，多采用基因添加策略（2）肿瘤 63%，多采用靶向杀伤特异细胞、靶向抑制基因表达、基因添加等策略（3）感染性疾病（6%）（4）血管疾病（8%）,单基因遗传病的基因治疗,ADA（腺苷酸脱氨酶）缺乏症,属于AR遗传病由于腺苷酸脱氨酶缺乏，导致脱氨腺苷酸增多，改变了甲基化能力，产生毒性效应，使T淋巴细胞受损，引起反复感染等症状。传统的治疗方法：骨髓移植,ADA的基因治疗,ADA基因,逆转录病毒载体,重组分子,LTR,ADA,SV,neo,LTR,患者T淋巴细胞,抗CD3单克隆抗体,IL-2,刺激,细胞分裂,导入,基因表达,10天,回输患者体内,每隔12个月治疗1次,治疗10次,患者体内ADA水平达正常25%,遗传病的基因治疗,乙型血友病,属于XR遗传病形成原因：凝血因子缺乏临床表现： 易于出血、凝血时间长、在轻伤或小手术后常出血不止。基因定位：Xq26.327.2,乙型血友病的基因治疗,因子基因,逆转录病毒载体,重组分子,LTR,F,neo SV PBO,LTR,导入,仓鼠细胞,F表达,患者皮肤成纤维细胞,F表达,患者皮肤成纤维细胞（体外培养）,F表达,F表达水平达正常人5%,回输患者体内,肿瘤的基因治疗,肿瘤基因治疗策略： 1 细胞因子导入 2 自杀基因导入 3 反义核酸技术 4 抑癌基因导入,细胞因子介导的肿瘤基因治疗,IL-2（白细胞介素-2）,TNF（肿瘤坏死因子）,逆转录病毒载体,导入,肿瘤浸润淋巴细胞（体外培养的自体细胞）,从肿瘤组织中分离,特异性进入自体肿瘤部位,在自体肿瘤部位持续存在,无副作用,回输患者体内,进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤作用,自杀基因介导的肿瘤基因治疗,原理： 用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 （无毒）基因 酶 药物复合物 （有毒）,细胞死亡,常用自杀基因胸苷激酶（TK）基因,单纯疱疹病毒TK基因： 催化脱氧胸苷（TdR）磷酸化为脱氧胸苷酸 催化胸苷类似物GCV磷酸化,哺乳动物TK基因： 催化脱氧胸苷（TdR）磷酸化为脱氧胸苷酸,GCV对细胞毒性很低，但磷酸化后明显抑制细胞DNA合成,甲胎蛋白（AFP）调控序列,HSV-TK,重组载体（只在肿瘤细胞中表达）,导入,肿瘤细胞,GCV-p（有毒）,加入GCV（胸苷类似物）,抑制DNA合成肿瘤细胞死亡,邻近细胞死亡或凋亡（旁观者效应）,正常细胞,加入GCV,GCV无法磷酸化（无毒）,旁观者效应产生的机理,有毒产物通过细胞间隙扩散,免疫系统介导,GCV激活后释放可溶性因子,肿瘤出血坏死,血管内皮细胞表面粘附蛋白促进淋巴细胞粘附,肿瘤组织内细胞因子激活淋巴细胞,细胞凋亡,抑癌基因介导的肿瘤基因治疗,野生型抑癌基因失活与肿瘤发生密切相关,将正常野生型抑癌基因导入肿瘤细胞，代替和补偿有缺陷的抑癌基因，抑制肿瘤的生长或逆转表型基因添加,代表性抑癌基因：p53,抑癌基因介导的肿