MTT细胞实验中药物浓度筛选详解

精品文档 1欢迎下载 一 实验前应明确的问题 一 实验前应明确的问题 1 选择适当的细胞接种浓度 一般情况下 96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞 但由于不同细胞贴壁后面积差异很大 因此 在进行 MTT 试验前 要进行预实验 检测其贴壁率 倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线 确定试验中每孔的接种 细胞数和培养时间 以保证培养终止致细胞过满 这样 才能保证 MTT 结晶形成酌量与细 胞数呈的线性关系 否则细胞数太多敏感性降低 太少观察不到差异 2 药物浓度的设定 一定要多看文献 参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛 根据 自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛 切记 否则 可能你用的时间和浓度根本不 是药物的有效浓度和时间 3 时间点的设定 在不同时间点的测定 OD 值 输入 excel 表 最后得到不同时间点的抑 制率变化情况 画出变化的曲线 曲线什么时候变得平坦了 到了平台期 那个时间点应 该就是最好的时间点 因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显 4 培养时间 200ul 的培养液对于 10 的 4 5 次方的增殖期细胞来说 很难维持 68h 如 果营养不够的话 细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止 影响结果 我们是在 48h 换 液的 5 MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力 不能测定细胞绝对数 做 MTT 时 尽量无菌操 作 因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高 6 理论未必都是对的 要根据自己的实际情况调整 7 实验时应设置调零孔 对照孔 加药孔 调零孔加培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 和加药孔都要加细胞 培养液 MTT 二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 而 加药组加入不同浓度的药物 8 避免血清干扰 用含 15 胎牛血清培养液培养细胞时 高的血清物质会影响试验孔的 光吸收值 由于试验本底增加 会试验敏感性 因此 一般选小于 10 胎牛血清的培养液 进行 在呈色后 尽量吸净培养孔内残余培养液 二 实验步骤 二 实验步骤 精品文档 2欢迎下载 贴壁细胞 1 收集对数期细胞 调整细胞悬液浓度 每孔加入 100ul 铺板使待测细胞调密度至 1000 10000 孔 边缘孔用无菌 PBS 填充 2 5 CO2 37 孵育 至细胞单层铺满孔底 96 孔平底板 加入浓度梯度的药物 原则上 细胞贴壁后即可加药 或两小时 或半天时间 但我们常在前一天下午铺板 次日上午加 药 一般 5 7 个梯度 每孔 100ul 设 3 5 个复孔 建议设 5 个 否则难以反应真实情况 3 5 CO2 37 孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 4 每孔加入 20ulMTT 溶液 5mg ml 即 0 5 MTT 继续培养 4h 若药物与 MTT 能够反应 可先离心后弃去培养液 小心用 PBS 冲 2 3 遍后 再加入含 MTT 的培养液 5 终止培养 小心吸去孔内培养液 6 每孔加入 150ul 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10min 使结晶物充分溶解 在酶联免 疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值 7 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解介 质 培养液 MTT 二甲基亚砜 悬浮细胞 1 收集对数期细胞 调节细胞悬液浓度 1 106 ml 按次序将 补足的 1640 无血清 培 养基 40ul 加 Actinomycin D 有毒性 10ul 用培养液稀释 l g ml 需预试寻找最佳 稀释度 1 10 1 20 需检测物 10ul 细胞悬液 50ul 即 5 104cell 孔 共 100ul 加入到 96 孔板 边缘孔用无菌水填充 每板设对照 加 100 储存液 100 1640 2 置 37 5 CO2 孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 3 每孔加入 10 ul MTT 溶液 5 mg ml 即 0 5 MTT 继续培养 4 h 悬浮细胞推荐使用 WST 1 培养 4 h 后可跳过步骤 4 直接酶联免疫检测仪 OD570nm 630nm 校准 测量各孔 的吸光值 4 离心 1000 转 x10min 小心吸掉上清 每孔加入 100 ul 二甲基亚砜 置摇床上低速 精品文档 3欢迎下载 振荡 10 min 使结晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪 OD570nm 630nm 校准 测量各孔的 吸光值 5 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解介 质 培养液 MTT 二甲基亚砜 每组设定 3 复孔 三 三 MTTMTT 的配制的配制 MTT 一般最好现用现配 过滤后 4 避光保存两周内有效 或配制成 5mg ml 保存在 20 度长期保存 避免反复冻融 最好小剂量分装 用避光袋或是黑纸 锡箔纸包住避光以免 分解 我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里 用的时候现配 直接往培养板中加 没必要一下 子配那么多 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了 MTT 有致癌性 用的时候小心 有条件最好带那种透明的簿膜手套 配成的 MTT 需要无菌 MTT 对菌很敏感 往 96 孔板加 时不避光也没有关系 毕竟时间较短 或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 配制 MTT 时用用 PBS 溶解 也有人用生理盐水配 60 水浴助溶 PBS 配方 Nacl 8g Kcl 0 2g Na2HPO4 1 44g KH2PO4 0 24g 调 ph 7 4 定容 1L 四 关于细胞的接种 四 关于细胞的接种 铺板铺板 细胞过了 30 代以后就不要用了 因为状态不好了 培养板要用好的 最好进口板 不 好的板或重复利用的板只可做预实验 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 因为细 胞密度在 10000 ml 左右时 所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率 或者增值率 的所呈现 的线性关系最好 结果最可信 如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显 太密细胞可能都会 凋亡 因为细胞长的太快营养会不够 最后导致死亡 且而细胞过密或者过少 增殖都会 过快或者过慢 其增值率线性关系不佳 故而 MTT 细胞密度多采用 10000 ml 100ul 孔 细胞密度要根据不同细胞的特点来定 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点 的细胞浓度 如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度 这样与对照的 区别更明显 数据更好 悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105 贴壁细胞可为 103 104 五 加入 五 加入 MTTMTT 精品文档 4欢迎下载 个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例 具 体细胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定 我认为 MTT 多加一些比少加 好一些 MTT 的量各家报道不同 一般是过量的 所以 10ul 即够了 如果不使用 96 孔板 培养基超过 100ul MTT 按照 10 的比例加入 加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀 不过这个应该关系不大 如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色 则污染的可能性極大 另外 MTT 稀釋後加入 細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜 且在加 MTT 前可以先在镜下观察 看看是否有孔染 菌 染菌的孔常常是临近的 因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应 所以可以 单独将药物和 MTT 加在一起 看会不会起反应 如果不起反应 就不用去除含药物的培液 直接加 MTT 即可 首先说说我的一点经验 1 吹打时悬液总量不能太多 达到吸管吸液量的 3 到 4 倍 可能比较容易混匀 10ml 的 离心管里面最好装 3 4ml 的悬液 悬液太少容易吹起很多气泡 悬液太多又不容易吹成单 细胞悬液 2 吸管的吸液量最好在 1ml 左右 吸液量过多的话 一下吸起很多液体 管中所剩就很少 这样吹打容易起泡 吸液量过少 吹打的力度就不够 吹打就会不均匀 如果是吸液量 1ml 多的吸管 总液量在 5ml 左右为益 3 吸的时候要在悬液底部 然后提起来一点 但是吹下去的时候不要离开液面 否则容易 吹打出气泡 4 吹打次数 100 左右 就可以吹打均匀了 有人认为加细胞前吹打 30 50 次基本就差不 多均匀了 加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次 每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟 然后再以一定的速度吸取悬液 5 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快 否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲 力在孔底聚集一堆 一般都在孔的底部中央 而周边很少 这种不均匀的分散会产生接触 抑制 影响细胞的生长 所以速度不能太快也不能太慢 我习惯每块板加完后平握手中 向左 3 下 向右 3 下 在往返回复 3 下移动 目的是使得细胞能分散的均匀些 铺板技术 是 MTT 实验的关键 也是基础 一定要练好 曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞 最后细 精品文档 5欢迎下载 胞全死了 建议不要采用这种方法混匀细胞 其它的声音 1 首先细胞的接种密度一定不能过大 一般每孔 1000 个左右就够了 我认为宁少勿多 尤其是对于肿瘤细胞 10000 孔是太高了 这样即使药物有作用 MTT 方法也是表现不出 的 最佳点板浓度在 4000 5000 孔 太少的话 SD 值会很大 2 MTT 本身就是比较粗的实验 增殖率 10 左右的波动都不算奇怪 特别是新手 20 的 波动也是常见的 所以很可能是技术原因引起的 特别是种板技术一定要过关 3 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验 这种细胞长的很快一开始我是用 100000 ML 的浓度来接 种的 结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系 后来调整浓度 用过 40000 80000 ML 的浓度都做过 MTT 实验 结果发现做的结果比较好点的是 60000 70000 ML 的浓度组的 用 40000 M 的浓度的组 由于细胞少 药物作用的梯度还是有 只是没有很好的 线性关系 还有根据细胞生长速度以及药物的特性 有时间依赖性和浓度依赖性的药物 来确 定培养时间是 48 小时还是