发酵技术生物工程

发酵技术在生物工程中的应用,补加前体DL-蛋氨酸对S-腺苷-L-蛋氨酸发酵的影响,制作人：,制作班级:,从广义上讲，发酵工程由三部分组成： 1：上游工程 2：中游工程 3：下游工程,上游工程包括： 优良种株的选育 最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定 营养物的准备,中游工程包括：发酵开始前用高温高压对发酵原料和发酵罐及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；种子培养和生产培养的不同的工艺技术。发酵工艺上批量发酵，流加批量发酵，连续发酵的选择。,下游工程包括： 固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺） 细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶） 蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等） 产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干燥等）,补加前体DL-蛋氨酸对S-腺苷-L-蛋氨酸发酵的影响,S-腺苷-L-蛋氨酸(简称SAM)是一种广泛存在于活体细胞内的生物小分子,可由ATP:蛋氨酸腺苷转移酶( MAT) 催化等分子的L-蛋氨酸和ATP合成得到。SAM是甲硫键型高能化合物,是生物体内一种重要的生理活性物质和中间代谢物质,具有转甲基、转氨丙基和转硫等多种生理生化功能。细胞内SAM 浓度的微小改变,便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。,SAM 的用途： 在生物学上具有多种生理作用,主要用于抗抑郁、肝病治疗、关节炎和偏头痛治疗,此外还具有食品营养强化剂等功能。SAM功能的多元性和无副作用,决定了其应用的广泛性和长期使用性。1999 年美国FDA正式批准上市后,SAM迅速成为畅销的营养保健品之一,年销售额超过十亿美元。它在国际市场和国内市场的需求不断增长。近年来,国外的SAM临床应用已转向对肝脏疾患的治疗。据报道,SAM不仅利于各种急、慢性肝病的治疗,而且对实验性动物早期肝癌也具有预防作用,有望成为肝病治疗的理想药物。我国是肝病大国,肝病患者众多,目前国内销售的SAM 粉针剂(思美泰)是主要的护肝产品之一,长期依赖进口,价格昂贵,临床使用受到很大的限制。因此,对SAM的生产工艺研究是国内当前急需解决的问题。,通过补加前体提高酿酒酵母SAM-J5E-4 发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸的水平。采用10 L 罐发酵, 考察在相同的培养条件下, 补加不同类型的蛋氨酸前体对S-腺苷-L-蛋氨酸合成的影响。,不补加前体蛋氨酸的发酵结果补加前体L-蛋氨酸的发酵结果补加前体D-蛋氨酸的发酵结果补加前体DL-蛋氨酸的发酵结果,不补加前体蛋氨酸的发酵结果图1, 2 为不补加前体蛋氨酸时SAM 的发酵过程曲线,图1 未补加前体蛋氨酸的细胞生长和SAM 发酵结果,图2 未补加前体蛋氨酸的发酵过程中葡萄糖和乙醇质量浓度变化曲线,分析：由于SAM 的合成是一个高能耗的过程, 每生成一分子的SAM 需要消耗36 分子ATP, 仅靠葡萄糖消耗产生的ATP 能量无法实现高密度积累SAM. 结果表明, 在未补加前体蛋氨酸的条件下, SAM 的积累量增长很慢, 最高为0. 38 g/ L, 生物量最高为128 g/ L,在发酵结束前, 容易积累较高浓度的乙醇。,补加前体L-蛋氨酸的发酵结果在生物量达到80 g/ L 时, 开始流加L-蛋氨酸前体, 流加速率为2 g/ ( L . h) , 共流加5 h, 所得发酵结果见图3, 4。,分析：由于合成一分子的SAM, 需要消耗一分子的蛋氨酸和一分子的ATP, 加入前体蛋氨酸, 可减少合成蛋氨酸所需的能量, 利于SAM 的高密度积累. 在补加前体L-蛋氨酸后, SAM 快速积累, 在开始流加16 h 后, SAM 积累量达到最高值, 为4. 66 g/ L, 蛋氨酸转化率为17. 45% . 在生物量达到80 g/ L 后流加L-蛋氨酸, 可使生物量继续增加, 最高达到147 g/ L,说明采用流加方式补加L-蛋氨酸, 并没有对酵母细胞的生长产生明显的抑制作用。,补加前体D-蛋氨酸的发酵结果图5, 6 为在生物量达到80 g/ L 时, 流加D-蛋氨酸前体的发酵结果, 流加速率为2 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,图5 补加前体D-蛋氨酸对细胞生长和SAM合成的影响,分析：酿酒酵母的SAM 合成酶不能直接利用D-蛋氨酸. D-蛋氨酸被酵母细胞吸收后, 在胞内消旋酶的作用下, 部分D-蛋氨酸可被转化成L-蛋氨酸, 为SAM 合成提供前体. 发酵结果表明, 流加前体D-蛋氨酸, SAM 的积累量最高为1. 53 g/ L, 仅为流加L-蛋氨酸前体时SAM 积累量的1/ 3, 蛋氨酸转化率为5. 73%. 而生物量最高达到124 g/ L, 表明通过流加方式补加D-蛋氨酸对酵母细胞生长的抑制作用并不明显。,补加前体DL-蛋氨酸的发酵结果图7, 8 为在生物量达到80 g/ L 时流加DL-蛋氨酸前体的发酵结果, 补加速率为4 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,分析：在补加2 倍量的DL-蛋氨酸前体条件下,酿酒酵母先利用L-蛋氨酸前体合成SAM, 同时D-蛋氨酸在酵母细胞内消旋酶的作用下转化为L-蛋氨酸, 有效补充了合成SAM 的前体, 从而更利SAM 的积累, SAM 的积累量最高为5. 28 g / L, 蛋氨酸的转化率为9. 88% . 在该前体流加策略下, 生物量最高达131 g/ L, 表明流加2 倍量的DL-蛋氨酸对酵母细胞的生长无影响.,结论：本实验分别以L-蛋氨酸、D-蛋氨酸和DL-蛋氨酸作为发酵前体, 考察了补加不同类型的蛋氨酸前体对细胞生长和SAM 积累的影响. 当发酵过程中以2 g / ( L . h) 的速率流加D-蛋氨酸前体时, SAM 的积累量为1. 53 g/ L, 生物量达124 g/ L; 以相同速率流加前体L-蛋氨酸时,SAM 的积累量达4.68 g/ L,生物量为146 g / L。相比较而言,采用4 g/ ( L .h) 的速率流加DL-蛋氨酸前体时, SAM 的积累量最高,可达5. 28 g/ L