生药鉴定显微

第四节 显微鉴定,显微鉴定(microscopical idenifi-ction)是利用显微镜来观察生药的组织构造、细胞形状以及内含物，描述显微特征，制定显微鉴别依据，用以鉴定生药品种和质量的重要手段之一。,一、显微鉴定的常用方法,显微鉴定组织鉴定：观察药材的切片或磨片，鉴别其组织特征，适合于完整的药材或粉末特征相似的同属药材的鉴别；粉末鉴定：观察药材的粉末制片或解离片鉴别其细胞分子及内含物的特征，适合于破碎、粉末状药材或中成药的鉴别。,切片类型,横切片或纵切片切片方法徒手切片：1020m，最为简便、快速，较为常用。石蜡切片：便于教学用。滑走切片：有专用机器切制。冰冻切片：宜于科研，不利于教学，无法染色。,解离组织片：可用氢氧化钾法，使细胞间质溶解，细胞分离后观察目的物。表面片：叶、花、果实、种皮等多用，可观察各部位的表皮特征。,粉末片：水合氯醛透化片；水合氯醛不透化片；醋酸甘油片或稀甘油片或水装片。磨片：观察矿物药，相当于固定 片。,(十四)中成药显微鉴别要点,中药丸散锭丹等成方制剂，大多直接用各种粉末生药及生药浸膏配制而成。 显微鉴定是鉴定中成药丸散锭丹和制定品质标志的科学方法之一，对保证中成药的质量，有一定的科学意义和应用价值。,生药的粉末鉴定研究对于中成药的科学鉴定有重要作用。 1了解组方生药、剂型和制法 熟悉处方中组成药物的显微特征是中成药鉴别的基础。中成药的显微鉴别要比中药材粉末鉴别复杂得多，制备方法及辅料等会产生一定的影响和干扰。,2. 根据处方明确专属特征 中成药显微鉴定，一般根据处方，对各组成生药粉末特征作分析比较，选取各药具专属性的显微特征，作为鉴别依据。,六味地黄丸是由熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻六味药组成，每味药都有数个显微特征，大部分特征又有横向类别的交叉。选取六味药各具专属性的显微特征，这样六味药物均可鉴别。,三、扫描电镜等的应用,1偏振光显微镜（偏光显微镜 ）在偏光显微镜下，生药的鉴别要素在色彩上表现出一定的变化，可作为大多数植物、动物、矿物类生药的显微鉴别依据之一。,偏振光显微镜,例如：淀粉：在偏光显微镜下呈现黑十字现象，不同类型的淀粉其黑十字形象不同；草酸钙结晶：类型多样，在偏光显微镜下呈不同的多彩颜色；,石细胞：在植物体内广泛分布，其细胞壁在偏光显微镜下呈亮黄色或亮橙黄色；纤维、导管、矿物类物质：在偏光显微镜下则呈强弱不同的色彩；动物的骨碎片、肌纤维、结晶状物、毛茸等也呈现出不同的偏光特性。,麝香仁（显微）,麝香仁（偏光）,2扫描电子显微镜（扫描电镜）扫描电镜分辨率高，放大倍率5倍10万倍，能使物质的图像呈现显著的表面立体结构(三维空间)的特征，观察的样品制备操作又较简易，所以在生药鉴定，特别在同科属种间的表面结构的鉴别比较上，成为一种新的手段。,扫描电镜下的细菌,第五节 理化鉴定,理化鉴定(physical and chemical identification)：利用某些物理的、化学的或仪器分析方法，对生药及其制剂中所含有效成分或主要成分进行定性和定量分析，以鉴定其真伪和品质优劣程度的一种方法。,理化鉴定,中药理化鉴定发展很快，新的分析手段和方法不断出现。可确定中药的真伪优劣；开发利用新资源；指导中药材的栽培加工，扩大药用部分；制订中药质量标准。,常用的理化鉴定方法,物理常数 包括相对密度、旋光度、折光率、硬度、黏稠度、沸点、熔点等。一般理化鉴别呈色反应：利用生药的某些化学成分能与某些试剂产生特殊的颜色反应来鉴别。,多在试管中进行，或在生药切面或粉末上滴加各种试液，观察呈现的颜色以了解某成分所存在的部位。沉淀反应：利用生药某些化学成分能与某些试剂产生特殊的沉淀反应来鉴别。泡沫反应和溶血指数的测定,微量升华利用中药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其结晶形状、颜色及化学反应作为鉴别特征。,显微化学反应(microchemical reaction)将生药的干粉、切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试液，使产生沉淀或结晶，在显微镜下观察反应结果；或观察所产生的特殊颜色。,荧光分析利用生药中所含的某些化学成分，在紫外光或自然光下能产生一定颜色的荧光性质进行鉴别。例如黄连饮片显黄色荧光；浙贝母粉末显亮淡绿色荧光；大黄粉末显深棕色荧光。,色谱法常用以下三种色谱法： 薄层色谱法(TLC) 气相色谱法(GC) 高效液相色谱法(HPLC),分光光度法 紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光谱法原子吸收分光光度法,第六节 DNA分子标记鉴定,DNA分子遗传标记技术直接分析生物的基因型，具有下列特点：遗传稳定性遗传多样性 化学稳定性,生药鉴定常用的DNA分子标记方法,限制性片段长度多态（ restriction fragment length polymorphism ，简称 RFLP ）；随机扩增多态性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）；扩增片段长度多态性标记（ amplified fragment length polymorphic DNA marker ， AFLP ）；DNA 测序法和基于 DNA 序列测定的 PCR-RFLP 、特异引物 PCR 方法。,二、DNA遗传标记技术的方法及原理,1、限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP，restriction fragment length polymorphism) 其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，在特定的核苷酸顺序上切割，产生相当多的大小不等的DNA片段；,用放射性同位素标记的DNA探针检测与被标记DNA相关的片段，构建多态性图谱。该方法试验步骤繁琐(包括southern转移、探针标记、杂交、检测等)，又受到探针来源的限制，所需DNA样品量大。,2聚合酶链式反应(PCR，Polymorase chain reaction)PCR技术是20世纪80年代中期发明的一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术，又称无细胞分子克隆技术。,该方法操作简便、快速、特异、灵敏，不需提纯，不需使用同位素、省去了基因克隆步骤、对植物材料要求不严、用量少；但该技术所需的一对引物设计，需要知道物种的遗传信息，因而在生药研究中具有一定的局限性。,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是1985年美国Cetus公司 Kary Mullis等建立的最新生物技术。,一、PCR的定义：是在体外模拟体内条件下应用DNA聚合酶反应特异性扩增某一DNA片段的技术。,二、PCR的原理 1. PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两端已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸引物（一般长1530bp），这一单链引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。 2. PCR反应体系由基因组DNA、一对引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必需的离子浓度等组成。,3. 基本过程是： A. 变性：加热（9395 ），使基因组双链DNA变性为单链； B. 退火或称复性 ：通过降低温度（5070），使特异性引物与互补的DNA序列特异性结合； C. 延伸 ：发生了互补结合的引物在耐高温（7075）的TaqDNA聚合酶作用下，以基因组单链DNA为模板，从引物端开始按53方向合成DNA链。,这样经过一个周期的变性复性延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，反复n周期后，理论上就能扩增为2n倍，一般经过3040周期就能扩增100万倍以上。,A. 加热变性（93 95 ）,模板双链DNA,单链DNA,B. 降温复性（50 70 ）,引物与模板结合,C. 延伸 （65 72 ）,聚合酶作用下，互补的原则在引物的3端加单核苷酸。,第二个循环,2个DNA分子,4个DNA分子,第三个循环后形成了8个DNA分子,3、随机扩增多态性DNA(RAPD，random amplified polymorphic DNA)和任意引物PCR(APPCR)这两种技术是在90年代初几乎同时发明的。其主要优点是适于未知序列的基因组DNA的检测。,RAPD技术的基本原理是采用合成的较短的单个随机引物(10核苷酸)，利用生药总DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，进行非特异性的PCR扩增反应，可获得一组不连续的DNA片段，分析扩增产物电泳图谱在不同类群中的变异。,AP-PCR技术是用20-30个碱基的任意引物，以未知序列的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。,4DNA测序方法(DNASequencing)基于PCR的DNA直接测序技术以PCR扩增引物作为测序引物，使DNA分子鉴定技术取得了突破性进展。,三、DNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用,1在植物进化、分类、鉴定中的应用应用分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA变异情况，从而揭示物种的亲缘关系，为物种鉴定及系统学研究提供依据。,2在中药材鉴别中的应用通常PCR扩增的模板DNA都来自新鲜的动植物组织材料，因DNA分子遗传标记