酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

实验  酵母 RNA 的提取及组份鉴定与核酸的定量测定 【课前预习】1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？2如何从酵母中提取到较纯的 RNA?3干扰 RNA 的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。4干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？【目的要求】1. 了解并掌握稀碱法提取 RNA 的原理和方法。2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。【基本原理】由于 RNA 的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA 即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA 和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA 即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去 DNA 和蛋白质。上述方法提取的 RNA 具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取 RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用 10%左右氯化钠溶液，90提取 3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀 RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调 pH2.5 利用等电点沉淀。酵母含 RNA 达 2.67-10.0%，而 DNA 含量仅为 0.03-0.516%，为此，提取 RNA 多以酵母为原料。RNA 含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使 RNA 水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收 UV 的性质，其吸收高峰在 260nm 波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用 来表示。 为每升溶液中含有 1 克原子核酸磷的光吸收值（即 A 值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的 A260nm 值，即可以计算出其中 RNA 或 DNA 的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。核酸摩尔消光系数及相应光吸收值(P) A260nmpH7，260nm含磷量/(%)1g/mLRNA 7700-7800 9.5 0.022-0.024DNA-Na 盐 6600 9.2 0.02（小牛胸腺）蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处，在 260nm 出的吸收值仅为核酸的 1/10 或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值在 2.0 以上；DNA 的 260nm 与 280nmx 吸收的比值则在 1.9 左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。【实验用品】1. 试剂1) 0.04M NaOH 溶液；2) 95%乙醇；1.5M 硫酸；3) 浓氨水；4) 0.1M 硝酸银；5) 酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加 0.3mL HCl；6) 三氯化铁浓盐溶液：将 2mL 10三氯化铁（FeCl3 6H2O）溶液加入 400mL 浓 HCl；7) 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取 6g 苔黑酚溶于 95乙醇 100mL。8) 定磷试剂：（1） 17硫酸：将 17mL 浓硫酸（比重 1084）缓缓倾入 83mL 水中；（2）2.5鉬酸铵：2.5g 鉬酸铵溶于 100mL 水中；（3）10抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于 100mL 水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合： 17硫酸：2.5鉬酸铵：10抗坏血酸：水1：1：1：2（V/V）。9) 钼酸铵过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和 0.25g 钼酸铵溶于 96.4mL 蒸馏水中，即成 0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。10) 5-6%氨水：用 25-30%氨水稀释 5 倍。11) 钼酸铵过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和 0.25g 钼酸铵溶于 96.4mL 蒸馏水中，即成 0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。12) 5-6%氨水：用 25-30%氨水稀释 5 倍。2. 测试样品干酵母粉。3. 器材移液管 0.2mL（1） ，0.5mL（2），1mL（4） ，2mL（4）；滴管；容量瓶 50mL（3）；量筒 10 mL（1） ；离心机；分光光度计；冰浴；水浴锅。【方法步骤】1. 酵母 RNA 提取称 5g 干酵母粉悬浮于 30mL 0.04M NaOH 溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热 30min，冷却，转入离心管。3000 转/分，离心 15 分钟后，将上清慢慢倾入10mL 酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待 RNA 沉淀完全后，3000r/min 离心 3min。弃去上清液。用 95乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得 RNA 粗品的重量，计算。2.  RNA 组份鉴定取 2g 提取的核酸，加入 1.5M 硫酸 10mL, 沸水浴加热 10 分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1) 嘌呤碱：取水解液 1mL 加入过量浓氨水。然后加入 1mL 0.1M 硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。2) 核糖：取水解液 1mL，三氯化铁浓盐酸溶液 2mL 和苔黑酚乙醇溶液 0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。3) 磷酸：取水解液 1mL，加定磷试剂 1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。3. 紫外吸收法测定核酸的含量1) 准确称取待测核酸样品 0.5g，加少量 0.01mol/L NaOH 调成糊状，再加适量水，用 5-6%氨水调至 pH7.0，定容至 50mL。2) 取两支离心管，甲管加入 2mL 样品溶液和 2mL 蒸馏水，乙管加入 2mL 样品溶液和 2mL 沉淀剂。混匀，在冰浴上放置 30min。3) 在 3000r/min 下离心 10min。从甲、乙两管中分别吸取 0.5mL 上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为 1cm 的石英比色杯，在 260nm 波长处测定 A 值。【实验结果】1. 干酵母粉 RNA 粗品的含量：2. 记录 RNA 组份鉴定各管的现象；3. 计算干 RNA 粉中核酸的含量：式中， 为甲管稀释液在 260nm 波长处 A 值减去乙管稀释液在 260nm 波长处 A 值；L比色杯的厚度，1cm； N