生物医学光子学1.doc

生物医学光子学biomedical photonics定义： 运用光子学原理和技术，为医学、生物学和生物技术领域中的问题提供解决方案即构成生物医学光子学的研究内容。生物医学光子学涉及对生物材料的成像、探测和操纵。在生物学领域，主要研究分子水平的机理，监测分子结构与功能，在医学领域，主要研究生物组织结构与功能，能对生物体以非侵入的方式，实现宏观与微观尺度分子水平的疾病探测、诊断和治疗。 研究内容： 生物医学是光子学的一个重要应用领域, 两者的交叉形成了新兴学科“ 生物医学光子学”. 主要研究内容包含: 一是生命系统中产生的光子及其反映的生命过程, 以及这种光子在物学研究、医学诊断与治疗方面的重要应用; 二 是医学光学与光子学基础和技术 , 包括组织光学、光与组织相互作用和组织工程、新颖的光诊断和光医疗技术及其作用机理的研究等. 生物医学光子学目前仅具雏形, 但其发展之快引人注目.新进展：近年来, 在国家自然科学基金、省部级基金以及其他基金项目的资助下, 我国在生物医学光子学的研究中取得了很大的进展, 尤其是2000年第152 次主题为 “ 生物医学光子学与医学成像若干前沿问题” 、第217 次主题为“ 生物分子光子学” 的香山会议后, 有许多学校和科研单位开展了生物医学光子学的研究工作, 并初步建成了几个具有代表性的、具有自己研究特色和明确科研方向的研究机构或实验室, 并在生物医学光学成像( 如optical coherence tomography, 简称OCT, 光声光谱成像, 双光子激发荧光成像, 二次谐波成像, 光学层析成像等) 、组织光学理论及光子医学诊断、分子光子学( 包括成像与分析) 、生物医学光谱、X 射线相衬成像、光学功能成像、认知光学成像、PDT 光剂量学、高时空谱探测技术及仪器研究等方面取得了显著的研究成果. 发表了许多研究论文, 申请了许多发明专利, 有些已经获得产业化. 国家自然科学基金委员会生命科学部与信息科学部联合发起并承办的全国光子生物学与光子医学学术研讨会已经举办了六届, 对我国生物医学光子学学科的发展起到了积极的推动作用. 我国近年所召开的亚太地区光子学会议中, 有关生物医学光子学的内容已大幅增加, 成为主要的研讨专题. 我国的生物医学光子学研究方兴未艾, 呈现与国际同步的态势。（参看激光医学导论论文一）吸收系数吸收系数（）指光子通过单位距离时被吸收的概率。组织的不同组分有着不同的值；同时，还是波长的函数。光学中关于吸收系数的表述：光在介质中传播时，光的强度随传播距离(穿透深度)而衰减的现象称为光的吸收。光的吸收遵循吸收定律，关于吸收定律有两种形式的表述方式：布朗朗伯定律光经过一定介质后的出射光强为：a-=I0表示入射光强，d表示光束垂直通过介质层的厚度，a为一正常数，称为介质对该单色光的吸收系数。介质的吸收系数a的量纲是长度的倒数，单位是cm-1.吸收系数a的倒数(1/a)的物理意义是因介质的吸收使得光强衰减到原来1/e36.8时，光所通过的介质厚度。将布朗朗伯定律两边积分得到：散射系数：当光束通过光学性质不均匀的物质时，从侧向可以看到光，这种现象叫做光的散射，散射会使光在原来的传播方向上的光强减弱，遵从：，为散射系数，为吸收系数。为衰减系数有效衰减系数：组织吸收与散射所导致的光衰减可以用有效衰减系数 ()表示：称为传播散射系数：这里表示组织的各向异性，一个典型的取值是0.9。共聚焦显微镜原理：激光器产生的激发光经双色镜反射进入显微镜物镜，并聚焦于样品上，产生的荧光经同一物镜收集后穿过双色镜和发射滤光片，再用透镜聚焦，穿过置于焦点处的针孔进入单光子计数器(雪崩二极管APD或高性能光电倍增管PMT）检测。从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个 光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 共聚焦激光扫描显微（Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一项高分辨率三维光学成像技术。主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行表面作图，而对于透明样品，则可以进行内部结构成像。内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因为来自样品不同深度的信息未被重叠。传统显微镜能“看”到所有能被光投身到地方，而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对焦点深度的控制和高度限制来实现的。激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%-40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning confocal microscope ）使用共聚焦针孔阻挡掉非焦平面的背景信息，可以在较厚的标本上采集薄的（微米以下）、去模糊的光学切片图像，因此这项技术允许对厚标本进行三维切割。虽然我们可以只采集标本焦平面的信息，但是激发光会穿透整个标本，会对标本尤其是活标本造成严重的光漂白和光毒性。此外共聚焦显微镜会由于激发能量被标本吸收和散射及发射光受标本散射等影响，而使观察深度受到严重限制。多光子显微（Multiphoton microscopy）技术结合多光子荧光技术，多光子共聚焦显微镜（Multiphoton ExcitationMPE）的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜（单光子共聚焦显微镜）所存在的问题，MPE的激光源是超快激光器（多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度），具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比。在传统激光共聚焦显微镜中，光通过出的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。在MPE中，焦点处发出的所有荧光，包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到。并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长，激发光的散射损失很小，轴向分辨率更高，样品的穿透能力更强。多光子显微镜荧光的激发只发生在显微镜焦平面衍射斑限定的范围内，进而可以在厚的生物标本内产生光学切片，而获得高的三维分辨率。通过在XY平面进行扫描可以获得单层光学切片，然后沿着Z 轴进行连续扫描后可以获得完整的三维图像。因为焦点的位置可以被精确的确定和控制，多光子荧光非常适用于激发标本表层以下的荧光探针。这种高精度的定点激发保证了对荧光染料的最小光漂白并减少了光破坏，进而增加了细胞的生活能力，可以维持更长时间的细胞性能研究实验。此外，多光子技术应用的是近红外长波激发，允许穿透的组织标本更深，并且减少了短波光在组织中的高度散射。上述这些优点保证了研究者可以在厚的活组织样本上进行实验操作，如脑片、胚胎等，而这些实验使用其他显微技术是没有办法实现的。 区别：图1 是在多光子荧光显微镜实验中典型的结构框架。该示意图使用的显微镜是OLYMSPU 前一代倒置IX70 显微镜（但多数多光子共聚焦并不采用倒置显微镜，而是使用正置的脑片观察用显微镜，用于观察厚的活脑片、组织片或活体）用于观察培养组织和厚生物标本中的活细胞。对于常规的无荧光观察，位于载物台上部的透射光灯室用于常规显微镜技术如明场、微分干涉称（DIC）、相差和浮雕相称（Hoffman ）等。显微镜的右侧是多光子显微镜首选的激光系统钛蓝宝石锁膜脉冲激光系统(Ti(titanium):Sapphire mode-locked pulsed laser system)，这种激光可以提供非常高的瞬间高强度激发峰，但其平均能量却较低。激光的控制是通过其上部的电子部件，激光通过光导或通过透镜（反光镜）组直接导入显微镜光口。 一个光电倍增管检测系统安装于显微镜的另外一个光口，该系统可以驱动光束在物镜视野范围内快速逐行扫描。通过计算机采集数字图像并进行光学切片的三维重建。 与传统共聚焦显微镜不同，图1 中展示的显微镜结构不需要在监测器前端放置共聚焦针孔来采集三维分辨率，因此增加了发射荧光的检测效率。以往，多光子激发用的昂贵的、操作复杂的脉冲激光系统限制了这项技术的应用，近期打包销售或相对成熟的商品化系统使多光子荧光技术被应用到更多的研究中。二次谐波 英文名称：（second harmonic generation,SHG） 定义：将非正弦周期信号按傅里叶级数展开，频率为原信号频率两倍的正弦分量。 SHG的一个必要条件是需要没要反演对称的介质其次是必须满足相位匹配，传播中的倍频光波和 不断昌盛的倍频极化波保持了相位的一致性。谐波产生的根本原因是由于非线性负载所致。当电流流经负载时，与所加的电压不呈线性关系，就形成非正弦电流，从而产生谐波。双光子荧光（two-photon excitation fluorescence,TPEF） 在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个荧光光子，这就是单光子荧光。对于以激光为光源的荧光激发过程，则可能产生双光子甚至多光子荧光现象，这时所用的激法光源强度高，光子密度满足荧光分子同时吸收两个光子的要求。以一般的激光为激发光源的过程中，光子密度仍然不足以产生双光子吸收现象，通常采用飞秒脉冲激光器，其瞬时功率可以达到兆瓦量级。因此，双光子荧光的波长比激发光的波长短，相当于半激发波长激发产生的效果。 双光子荧光显微镜的优点：双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双