全文预览已结束
下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
镍柱蛋白纯化一、原理镍柱里面含有琼脂糖微球体,在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与Ni2+发生螯合,螯合后的Ni2+能与HIS上的咪唑环发生特殊的相互作用,从而实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸(种类、数目和分布)、金属离子的种类和密度、层析条件(pH、盐的种类和浓度、添加剂等)二、缓冲液的配制(500ml PH=7.4)Binding buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 20mM咪唑 1.8g (550mM)Washing buffer: PB 50 mM Nacl 14.625g 5mM 0.45g 10 mM 0.9g 15 mM 1.35g 20 mM 1.8g 40Mm 3.6gElution buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 100 mM 9g 200mM 18g400mM咪唑 45g 600mM咪唑 63g三、操作步骤 此步骤过镍柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤,所有液体过镍柱的速度要严格控制2.5ml /min,中间镍柱不能进气泡1、5倍镍柱体积去离子水洗涤,去除空气和20%乙醇 (5ml /min)2、510倍镍柱体积Binding buffer平衡3、上蛋白样品4、5倍镍柱体积Wsahing buffer 洗脱杂蛋白(HIS标签含有6个组氨酸,结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白),此步骤设洗脱梯度5、5倍镍柱体积Elution buffer洗脱目的蛋白,此步骤设洗脱梯度6、5倍体积去离子水清洗掉缓冲液7、20%乙醇保存于 4注意:洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来四、镍柱重生(介质使用约3-20次,具体与原料来源、样品体积等有关)1. 镍柱用去离子水清洗2. 5倍镍柱体积EDTA 重生镍柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA,pH 7.4)3. 5倍体积 Binding buffer 平衡4. 5倍体积去离子水清洗5. 20倍体积 1M NaoH 洗涤6. 水洗至中性7. 5倍柱体积挂镍8. 用5倍体积以上的纯水清洗层析柱,去除游离的金属离子9. 20% 乙醇保存 4五、注意事项1、推荐在中性至弱碱性的条件下(PH 78)结合重组蛋白,磷酸盐Buffer是常用的缓冲液,Tric-cl在一般情况下可用,但要注意它会降低结合强度2、避免在Buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂3、若重组蛋白以包涵体形式表达,在所有Buffer中添加6M盐酸胍或8M尿素4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团,如:NH4,甘氨酸,精氨酸,Tris5、各种Buffer中不能含有高浓度的强还原剂,比如DTT,防止二价NI被还原6、不能含有离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失7、Buffer里可加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- GB/T 43921-2024无损检测超声检测全矩阵采集/全聚焦技术(FMC/TFM)
- 2022届江苏省南通市部分校中考数学仿真试卷含解析
- 2022年广东省佛山禅城区七校联考中考考前最后一卷数学试卷含解析
- 2021-2022学年黑龙江省安达市四平中学中考考前最后一卷数学试卷含解析
- 学生竞选班长演讲稿5篇
- 物业保安转正报告
- (高清版)GBZ 37-2024 职业性铅及其无机化合物中毒诊断
- 促销活动策划方案
- 寒期社会实践报告
- 教导处竞聘上岗演讲稿5篇
- 羽衣甘蓝栽培技术课件
- 道德与法治《我的环保小搭档》优秀课件1
- ZXR10-设备基本操作(ZXR10-路由交换机基本操作和配置)课件
- 室内新增钢楼梯施工方案
- DB4101-T 25.2-2021物业服务规范 第2部分:住宅-(高清现行)
- 留守儿童风险等级评估表
- 小学劳动技术云教三年级下册目录绵竹市天河小学刘雨婕-制作冰粉
- 石家庄理工职业学院国际化办学实施方案
- 财务会计核算软件、使用说明书
- 五年级上册美术课件-第6课 我设计的鞋 ▏人美版(北京)
- 新人教版五年级数学上册教学计划附进度表
评论
0/150
提交评论