亚硝化菌的种类,生长特,亚硝化过程与机理.doc

亚硝化菌的种类，生长特性，亚硝化过程与机理摘要：从亚硝化细菌的生长特性出发，主要介绍了亚硝化细菌的种类，包括亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属，并探讨了亚硝化过程中的氧化和生化机理。关键词：亚硝化菌，亚硝化作用，机理1 亚硝化细菌生长特性亚硝化细菌又叫氨氧化细菌，有自养型与异氧型之分，一般认为自养型氨氧化细菌是硝化作用的主要菌群。所有自养型氨氧化细菌，都是革兰氏阴性细菌，自养生长时，以氨为唯一能源，以CO2为唯一碳源；混合营养生长时，可同化有机物质。亚硝酸细菌的生长极为缓慢。在适宜的条件下需 24h 才能完成一次分裂周期。在进行固体培养的过程中一般需数月才能见到菌落生长1。亚硝酸细菌喜欢微偏碱性的环境，适合大多数氨氧化细菌生长的条件为：温度25-30，pH 7.5-8.0，氨浓度2-10mmol/L。倍增时间8小时至数天。在纯培养中，培养基中若加入有机物质如酵母提取物等将会抑制亚硝酸细菌的生长，因此在进行亚硝酸细菌的分离培养时所培养分离的细菌的纯度可利用在培养基中加入(酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等)有机物的方法进行检测2。但是自然环境中有机物质对亚硝酸细菌的影响不如在纯培养中的大大亚硝酸细菌对污水组成、pH和温度等的改变都敏感3。2亚硝酸细菌的分类亚硝酸细菌的分类主要根据细菌形态的表型特征、细胞内细胞质膜的分布及它们16SRNA 序列的同源性。1984-1989 年的伯杰氏细菌系统分类学把硝化细菌分为九个属：硝化杆菌属、硝化刺菌属、硝化球菌属、硝化螺菌属、亚硝化单胞菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化球菌属、亚硝化叶菌属和亚硝化弧菌属等。而目前则倾向于把亚硝酸细菌分为两个单一细胞起源的群体，它们分别属于变形菌纲的亚纲和亚纲。在对这两个亚纲的亚硝酸细菌作进一步的分类时，不同的学者还有些细微的差别。Votek 等认为除了海洋亚硝酸球菌属于变形菌亚纲外，其它的亚硝酸细菌即亚硝酸单孢菌和亚硝酸螺旋菌两个种群属于变形菌亚纲。其中亚硝酸单孢菌包括欧洲亚硝酸单孢菌和亚硝酸运动球菌，亚硝酸螺旋菌包括亚硝酸螺旋菌属、亚硝酸颤菌属和亚硝酸叶菌属2。这种分类方法可用图1表示。图1 Votek 亚硝酸细菌分类法Philips等认为海洋亚硝化球菌和 N. halophilus属于变形菌亚纲，其它的亚硝酸细菌属于变形菌亚纲，包括亚硝化单孢菌属和亚硝化螺旋菌属4。Juretschko 同样认为海洋亚硝化球菌和 N.halophilus 属于变形菌亚纲，但是他认为于变形菌亚纲亚硝酸细菌应包括四个属，即亚硝化单胞菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化叶菌属和亚硝化弧菌属，而且后三个属彼此关系密切5。除了亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)外，其它能把氨氧化成亚硝酸的细菌属包括亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化球菌属 （Nitrosococcus）、亚硝化 弧 菌 属 （Nitrosovibrio）、亚硝化叶菌属（Nitrosolobus）、亚硝化胶团菌属（Nitrosogloea）、亚硝化囊菌属（Nitrosocystis）。土壤生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化叶菌属、亚硝化螺菌属。海洋生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属。盐湖生境中则有亚硝化单胞菌属6。2.1亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas) 7在亚硝化单胞菌属中，N.europaea是最早被分离并描述的种。除此以外，已确定的种还有8个，随着研究的深入，新种还会继续增加。亚硝化单胞菌属菌株呈杆状或椭球状。菌体单生，很少成链。菌体游离或包埋在黏液内。细胞有内膜，呈扁平泡囊，分布于四周。革兰氏染色阴性，好氧生长。生长温度范围5-30 ，最适生长温度30左右。生长pH值范围5.8-8.5,最适生长Ph值范围7.5-8.0。能量(主要指ATP)和还原力主要指NAD(P)H2来源于氨的氧化。许多菌株产生脲酶，能够利用尿素。以CO2为碳源，进行自养生长；细胞拥有羧酶体(carboxysome)，内含Calvin循环中固定CO2的关键酶二磷酸核酮糖羧化酶。也能以CO2或有机物作为碳源，进行混养（混合营养）生长，但不能以有机物作为碳源，进行异氧生长。细胞产生丰富的细胞色素，使细胞悬液呈黄色或红色。强光照和高氧分压可抑制生长。2.2亚硝化球菌属(Nitrosococcus)Nitrosococcus包含N.oceanus、N.mobilis和N.halophilus三个种。菌体呈球状至椭球状，可以是单球菌、双球菌和四联球菌，常包埋于黏液内而形成菌胶团。细胞有内膜，呈扁平泡囊，分布于四周或堆积于中央。革兰氏染色阴性。依靠丛生鞭毛或单生鞭毛运动。好氧生长。生长温度范围5-30，最适生长温度30左右。生长pH 范围6.0-8.0，最适生长Ph 范围7.5-8.0。能量和还原力来源于氨的氧化。一些菌株产生脲酶，能够利用尿素，能自养生长，也能混养生长，但不能异样生长。细胞内含有丰富的细胞色素，使细胞悬液呈黄色或红色。2.3亚硝化螺菌属(Nitrosospira)Nitrosospira只有N.briensis一个种。菌体呈螺旋状，有3-20圈。细胞没有内膜，也没有羧酶体。革兰氏染色阴性。好氧生长。生长温度范围20-35。生长pH范围7.0-8.0。能量和还原力来源于氨的氧化。严格自养生长。细胞内含细胞色素，但不含其他色素。2.4亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)Nitrosolobus只有N.multiformis一个种。菌体形态多样，裂片形细胞被内陷的细胞膜分隔，每个细胞有1-4个中心小室，其外面有5-20个膜结合的小室环绕。以缢缩的方式分裂。革兰氏染色阴性。好氧生长。能量和还原力来源于氨的氧化。主要自养生长，也能混养生长，但不能异样生长。最适生长温度25-30。最适生长pH 7.5。2.5亚硝化弧菌属(Nitrosmdbrio)Nitrosmdbrio只有N.tenuis一个种。菌体细长弧状，细胞没有内膜，羧酶体不明显。革兰氏染色阴性。严格好氧生长。最适生长Ph 范围7.5-7.8。能量和还原力来源于氨的氧化。主要自养生长，也能混养生长，但不能异样生长。表1 各种氨氧化细菌的特征特 征亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)亚硝化球菌属(Nitrosococcus)亚硝化螺菌属(Nitrosospira)亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)亚硝化弧菌属(Nitrosmdbrio)形 态杆状至椭球状球状至椭球状紧密螺旋状多形状细长弧状鞭 毛极生至偏极生丛生或单生周生周生极生至偏极生细胞内膜排列方式呈扁平泡囊，分布于四周呈泡囊分布于四周或堆积于中央无内膜使细胞分隔无内膜菌体大小(0.7-1.5)*(1.0-2.4)(1.5-1.8)*(1.7-2.5)(0.3-0.8)*(1.0-8.0)(1.0-1.5)*(1.0-2.5)(0.3-0.4)*(1.1-3.0)G+C/%47.4-51.050.5-5154.153.9-59.154时代时间/h8-1224Ch.A化能无机营养化能无机营养化能无机营养化能无机营养化能无机营养储存物多聚磷酸肝糖，多聚磷酸肝糖，多聚磷酸细胞色素,色素淡黄至淡红淡黄至淡红淡黄至淡红淡黄至淡红pH值范围5.8-8.58.0-9.08.5-9.58.2-9.07.5-7.8温度范围/5-30(25-30)12-3015-30(20-35)115-3025-30 -521:为最适温度范围；2:为最低温度范围。3亚硝化反应过程与机理亚硝化作用则是硝化作用从 NH4+ 或NH3到 NO2- 的反应过程，是氮素循环的重要环节，由氨氧化细菌（NH3-oxidizers，又被称为初级硝化细菌primary nitrifiers）、亚硝化细菌 （ammonia-oxidizingbacteria）来完成。生化氧化8： NH4+ + 1.5O2 + 2HCO3- 亚硝酸菌 NO2- + 2H2CO3 + （240-350kJ/mol） （1）生化合成： 13NH4+ + 23HCO3- 亚硝酸菌 10NO2- + 8H2CO3 + 3C5H7NO2 + 19H20 （2）则第一阶段的总反应式（包括氧化和合成）为：55NH4+ + 76O2 +109HCO3- 亚硝酸菌 C5H7NO2 + 54NO2- +104H2CO3 + +57H20 （3）氨氧化细菌是一类化能自养型细菌，氨是其进行自养生长的唯一能源。从热力学观点来看，亚硝化细菌利用的基质为低级能源。相对于呼吸链上的电子载体而言，氨氧化的氧化还原电位值E0(NO2- / NH4+)= 340 mV，氧化磷酸化效率很低，所能产生的ATP非常有限。亚硝化细菌中不存在基质水平磷酸化，它们依靠氧化磷酸化来贮存能量。在 25 ，pH 7 的条件下，NH3 氧化为NO2- 的吉布斯自由能为 -274.7 kJ(mol N)-1，即使全部转化为 ATP，最多仅产生8.4 mol ATP(mol NH4+)-1。NH3氧化所释放的电子只能传递给呼吸链上较低端的物质，因此NH3的氧化反应不可能直接耦联到呼吸链上第一个成分烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotine amide dinucleotide,NAD )的还原反应，能量不得不用于使电子跃迁到这一较高能级，即用于所谓的逆电子流过程中。这些因素使得亚硝化细菌生长很缓慢，世代期为836 h，经过710 d的培养菌落很微小，大多直径在100m 左右。利用相同数量的能量，亚硝化单胞菌所产生的细胞物质仅为异养菌的 1 %4 %，这是因为需要消耗ATP和还原力来还原CO26。但从生化水平上看，硝化作用远非如此简单，它涉及多种酶催化的代谢途径，并伴随着复杂的物质和能量转化。在亚硝化细菌的作用下, 氨转变为亚硝酸的氧化过程中, 氮原子价从-3变至+3, 电子的移动达6个, 故必然会有中间产物, 但中间产物究竟有几个, 现仍不大清楚现已证明, 其中一种中间体是羟胺（NH2OH），认为由羟胺进一步氧化成亚硝酸必需经过两个阶段, 即羟胺脱氢形成像硝酰(NOH)那样的氧化态中间体, 然后在酶的作用下由硝酰转变成亚硝酸。而亚硝酸在硝化细菌的作用下可直接氧化成NO3-9。亚硝化作用涉及多种酶催化的代谢途径，即为：NH3 氨单加氧酶 NH2OH 羟胺氧还酶 NO 羟胺氧还酶 NO2- 。氨氧化为羟胺的生化反应可表示为7 ：NH3 + 0.5O2 NH2OH G = +17 kJ/ mol （4）0.5O2 +2H+ +2e- H2O G = -137 kJ/ mol （5）NH3 + O2 + 2H 氨单加氧酶 NH2OH + H2O G = -120kJ/ mol （6）根据化学反应的自由能变化判断，在标准状态下，氨的羟化反应不易进行（4）式；需要氧的还原反应（5）式来拉动。只有当两个反应耦合时（6）式氨的氧化才能顺利进行。羟胺氧化成亚硝酸盐被认为是一个分两步进行的反应，中间产物可能是与酶结合的HNO，也可能是NO。羟胺氧化为亚硝酸盐的生化反应可表示为7 ：NH2OH + 5H2O HNO2 + 4H+ +4e- G =+23 kJ/ mol0.5O2 + 2H+ + 2e- H2O G =-137 kJ/ molNH2OH +0.5O2 羟胺氧还酶 HNO2 + 2H+ + 2e- G =-114 kJ/ mol首先在氨单加氧酶( AMO)的催化下将氨氧化成羟氨，再经羟氨氧化还原酶（HAO）的催化下将羟氨氧化成亚硝酸，进而由硝化细菌的亚硝酸盐氧化还原酶催化形成硝酸10。图2 亚硝化菌的氨氧化机制参考文献1 Nejidat A ,et al. 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