凝集素的研究历史及其生物功能.doc

Vol. 14,No. 8 精细与专用化学品第14卷第8期Fine and Specialty Chemicals 2006年4月21日技术进展凝集素的研究历史及其生物功能熊川男3李伟白雪芳杜昱光(中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁大连116023)摘要: 介绍凝集素的发现和发展历史,在近20年中,从植物、动物和微生物中提取了多种凝集素,并且结构已经被确定。同时,对凝集素的结构和生物功能进行了概述,如凝集素的保护和共生作用,凝集素在复杂生物系统中具有识别分子的作用,在细胞与分子间、细胞与细胞间的信号识别起重要作用。关键词: 凝集素; 葡聚糖; 甘露糖; 生物功能Research History of Lectin and Its Bio2functionsX IONG Chuan2nan, L IW ei, BA I Xue2fang, DU Yu2guang(Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)Abstract: The history on discovery and development of lectin are introduced. In recent twenty years, many lectinswere discovered extracting from the p lants, animals and microbes and the structure of them are determined. Meanwhile, thestructure and bio2functions of lectins are narrated, such as the p rotective action and symbiotic action of lectins, indentifyingmolecular actions in the comp lex organism, the important actions of recognition between cell and molecular and intracellularsignal indentification and so on.Key words: lectin; glucan; mannitose; bio2function凝集素作为一种非酶和非免疫起源的蛋白质或糖蛋白,广泛存在于动物、植物和微生物中。经过数十年,人们已经从动物、植物和微生物中分离筛选出多种新的具有生物活性的凝集素。下面针对凝集素的研究历史及其生物功能进行一下总结。1凝集素的糖与血型特异性1919年Sumner从豌豆Canavalia ensiform is中分离出结晶蛋白,命名为Con A,并用此方法第一次获得了纯的凝集素。1936年Sumner和However1报道了Con A可以凝集血细胞和酵母细胞,也可以在溶液中沉淀糖原。进一步研究显示, Con A的凝集作用被蔗糖抑制,这是第一次揭示了凝集素的糖特异性。Sumner和However大胆推测了Con A 的凝集作用是由于植物蛋白与血细胞表面的糖链发生了一系列反应所引起的。在此之前, Stillmark已经发现由蓖麻毒素引起的对不同动物的血细胞的凝集作用有选择性。这个发现被Karl Landsteiner证实,他在1900年发现了人类A、B、O血型。近10年后Landsteine报道了不同种子提取物的凝血活性因不同动物血细胞而不同2。根据这些特性, Landsteine总结了植物凝集素的作用“本质是类似抗体的反应”。20世纪40 年代, Boyd和Renkonen确定了不同凝集素对人类各种血细胞的独立特异性3。他们发现利马豆Phaseolus lim ensis和野豌豆V icia cracca的粗提物可以凝集A型血却不能凝集B型和O型血,但是芦笋豆Lotus tetragonolobus却能凝集O 型血。OlaviMkel在19541956年的3年时间里测试了豆类植物743个种165个属的种子粗提物,其中1 /3具有血凝活性,接近1 /10的凝集素显示了对血型的特异性4。这些豆类凝集素或者是凝集A123 收稿日期: 2005212225作者简介: 熊川男(19812) ,男,在读博士研究生, 主要研究方向为糖结合蛋白的分离、鉴定以及对其生物活性的研究。2006年4月21日熊川男,等: 凝集素的研究历史及其生物功能型血细胞,或者是凝集O型血细胞,或者是同时凝集A、B型血细胞;从Dolichos bif lorus中提取出的蛋白质对A1型血细胞凝集作用明显好于A2型血细胞,只有从Griffcifonia sim plicifolia 中提取的蛋白质对B型血细胞完全不凝集。自此以后,陆续又发现只凝集A型和O型血细胞(不凝集B型血细胞)和只凝集一种其他血型的凝集素,诸如: N (V icia gra2m inea凝集素) , T (豌豆凝集素, PNA) 和Tn (V iciavillosa和M olucella laevis凝集素) 。在早期的对抗原特异性结构的研究中,以ABO血型系统为基础的血型特异性凝集素起了至关重要的作用。20世纪50年代, Morgan和Watkins发现能凝集A型血细胞的利马豆凝集素能够很好的被2GalNAc抑制,能凝集O型血细胞的L tetragonolo2bus凝集素能够很好的被2岩藻糖抑制5。因此得出结论:2GalNAc和2岩藻糖分别是A 型血和O型血的决定性糖。Morgan和Watkins的先驱性工作最早揭示了细胞表面的糖结构。在细胞表面糖链供体被发现以前,人们发现了能识别这些糖链的内源凝集素,随后研究了第一个哺乳动物肝脏去唾液酸蛋白质受体。2凝集素对淋巴细胞的促有丝分裂作用和对癌细胞凝集20世纪60年代早期的两项重要发现使得凝集素成为关注的焦点。第一项是Nowell发现了红肾豆( Phaseolus vulgaris)凝集素( PHA)具有促有丝分裂作用6,也就是具有刺激淋巴细胞有丝分裂的能力。在随后很短的时间内,又陆续发现了其他有促有丝分裂作用的凝集素。更重要的是发现了Con A可以作为有丝分裂原,且其促有丝分裂活性可以被低浓度的单糖抑制,比如甘露糖。这些发现证明了促有丝分裂作用是凝集素与淋巴细胞表面糖链结合的结果,也证明了早期认为凝集素在细胞表面的生物作用。这些凝集素很快被用来研究细胞信号传导,其分析体外淋巴细胞增殖过程中的生物化学事件。其中最有价值的成果就是Gallo的研究小组通过在有条件的培养基中用PHA刺激正常人淋巴细胞而发现了T细胞生长因子7。第二项是Aub发现了小麦胚凝集素(WGA)能够选择性地凝集恶性细胞8。随后Burger、Leo Sa2chs和Michael Inbar报道了Con A也具有同样的作用。Nathan Sharon、Sachs和Benami Sela发现大豆凝集素( SBA)也有同样的作用。这些发现为癌症发展过程中癌细胞表面糖链变化提供了早期的证据,同时可以进一步假设凝集素可以凝集所有的恶性细胞。3大量凝集素的发现到20世纪70年代早期,人们在很多有机体中都发现了凝集素,这些凝集素主要存在于植物体中,如大豆、绿豆、Dolichos biflorus种子、小麦胚和蘑菇(Agaricus campestris) ; 也有在动物中提取的凝集素:鳗鱼9,蛇10和马蹄蟹11。Goldstein和Agraw2al发明了用亲和层析的方法分离凝集素,他们最初用固定化葡聚糖( Sephadex)12分离纯化了Con A。随后分离纯化凝集素的步伐大幅加快,人们获得了大量的凝集素,到现在大概有500多种。人们发现凝集素对于在检测生理病理过程中可以作为十分重要的工具后,研究兴趣大大地被激发起来。凝集素的主要应用如表1所示。表1凝集素的主要应用a细胞的鉴定和分离糖蛋白的检测、分离和结构研究细胞表面及亚细胞细胞器的糖链的研究:组织生物化学和细胞生物化学绘制神经元途径对淋巴细胞的促有丝分裂作用b净化移植骨髓b选择抗凝集素突变体研究糖蛋白的生物合成注: a植物凝集素为主, b临床应用。人们提出动物凝集素的概念相当早,并且提出在大多数无脊椎动物和低等脊椎动物中都存在凝集素。但是到20世纪70年代中期,只提及3种凝集素:一种是从鳗鱼中提取出来的对一种糖特异性(后来研究为L2fucose) 凝集素5; 1974 年Ashwell和Morell共同发现了第一个哺乳动物凝集素Gal特异性肝去唾液酸糖蛋白受体1314; 与此同时, Teichberg报道了从电鳗中分离出的第一个Gal特异性凝集素家族的成员15,包括了12个成员的这个凝集素家族在1994 年被命名为galectins。从20世纪80年代以后,在重组技术的支持下,人们得到了越来越多的动物凝集素。13精细与专用化学品第14卷第8期4从凝集素的一级结构到三级结构20世纪70年代人们加强了在分子特征上鉴别特定的凝集素,这些成为随后在分子水平上更深入研究凝集素活性的先决条件。这些研究包括从确定凝集素主要的物理化学参数到确定其氨基酸序列和揭示其三级结构。在重组技术兴起以前,确定凝集素一级结构的步伐相当的慢,到70年代末,只有6种已知的植物凝集素完成了全序列的测定, Con A成为第一个测定全序列的凝集素。同时, Edelman小组和Hardman与Ainsworth分别用高分辨率X晶体衍射的方法分析了Con A的三级结构, Con A同样是第一个测得三级结构的凝集素。甚至在完成WGA全序列工作以前,这项技术很快被应用到研究WGA的结构上。1973年, Sharon和Lis确定了ConA和WGA在结构上的不同很大程度上是由于组成的不同17。获得了很多凝集素的一级结构以后,就可以从不同相关分类中的凝集素确定凝集素氨基酸序列的同源性。Sharon和Strosberg最先共同研究了豆类凝集素的同源性。在80年代,人们又发现了其他的凝集素家族,如Galectin和C型凝集素。在过去的几年,有接近200个凝集素的三级结构被鉴定出来,并且很多凝集素的糖复合结构也被鉴定出来。令人惊奇的是,很多不同种类起源的凝集素它们的一级结构没有任何同源性,而四级结构却极其相似。20世纪80年代末期, X晶体衍射和定点突变技术为研究凝集素和糖链上的化学基团相互作用提供了很重要的基础。因此,凝集素以不同的方式识别糖链就像其他蛋白质识别它们的配体一样。5凝集素的糖识别域通过分析已知氨基酸序列的动物凝集素, Co2lumbia大学的Kurt Drickamer提出大多数凝集素的糖结合活性决定于有限的肽片断,他自己命名为糖识别域CRD18。他将Galectin中的糖识别域命名为S2CRD,将C型凝集素中的糖识别域命名为C2CRD。到现在已经辨别出包括上述提到的几种CRD在内的多个CRD,每种CRD都共有一种不变的形式,并且在特征空间都共有高度保守的氨基酸序列。以此为基础,可以将动物凝集素按照结构相关性分成主要家族和超家族,最大的家族是C型凝集素。其他家族中P型凝集素和I型凝集素是比较特殊的。多数C型凝集素是大型的、不对称的跨膜糖蛋白,它们的CRD是很多不同功能和结构的多肽域组成。与此相反, Galectin一般都是很小的、可溶、没有糖基化的蛋白质并且不像C型凝集素, Galectin的活性不需要Ca2 +的存在。C型凝集素又分成3 个凝集素家族selectin, collectin和endocytic。1987年, Harvard医学院的Bevilacqua及其同事又发现了两个可以确定细胞表面抗原的单克隆抗体,其中一个命名为ELAM21 (内皮白细胞黏附分子) , ELAM21只在刺激的人类内皮细胞中表达,对于没有刺激的人类内皮细胞没有表达19。另一个静脉细胞黏附分子最初由RodgerMcEver和Tufts大学的Bruce与Furie各自分别从活化的血小板中分离出来,并各自命名为GPM2140和PADGGEM。这3个细胞黏附分子曾经被共同命名为LEC2CAMS,但是在1989年,几乎是同时发表的几篇文章都报道了它们的一级结构,这些研究结果产生了它们现在各自的名字L2selectin, E2selectin, P2se2lectin。它们都含有一个类似的结构域胞外部分是由一个氨基酸末端组成的CRD、一个类似表皮生长因子的结构域和几个与补体结合蛋白相关的短重复序列单元。它们对三糖都能特异性结合,并且都在岩藻糖和唾液酸位置结合。selectin只在糖配体出现在特定的糖蛋白上时才会识别糖配体,就像细胞表面的粘蛋白在凝集素与糖相互作用中起到转运分子的作用;对这样的转运体研究最好的一个是P2selectin糖蛋白配体。6凝集素的保护和共生作用在研究凝集素的开始阶段,人们就对凝集素可能具有的生理作用具有了很大的兴趣。人们在20世纪70年代提出了两个假设:一个是凝集素能够保护植物抵抗植物病原微生物,也能保护昆虫抵抗食肉动物;另一个假设就是凝集素参与到豆类植物与它们共生的固氮菌之间的互相作用。最早关于凝集素具有杀虫作用可能是在1976年Minnesota大学的Irvin E. Liener实验室报道,他们用含有黑豆凝集素的食料饲养一种甲虫,最后导致了甲虫幼虫的死亡20。可见,豆类凝集素的主要142006年4月21日熊川男,等: 凝集素的研究历史及其生物功能作用是保护它们的种子免受昆虫的侵害。在后来人们又发现了其他一些凝集素也具有杀虫剂的作用,比如WGA、Galanthus nivalis凝集素和jacalin。早在30多年以前,人们就提出凝集素是为植物提供必要的氮源的固氮根瘤菌与豆类植物之间特异联系的桥梁这个想法。是因为人们发现由一个特定的豆类凝集素与该豆类共生的根瘤菌表面上的多糖或脂多糖以糖特异性方式结合,却不能于其他豆类上的共生菌相结合。比如: SBA可以凝集使大豆产生根瘤的大多数Bradyrhizobium japonicum菌株,却不能凝集没有该作用的菌株。因此可以判断,根瘤菌与植物根部结合的原因是由于豆类植物根部产生的凝集素与细菌表面糖链相互作用的结果。这些判断使凝集素成为了当时人们所公认的识别分子,但是由于一些矛盾和缺少明确的证据,这个假设一直是人们争论的话题。然而对于所研究的大多数共生系统来说,没有证据显示凝集素和它们的配体在特定的时间和特定的地点各自出现在植物的根部和细菌上。并且宿主凝集素与它所能识别的能产生根瘤的细菌之间的相互关系并不是很严格。几种在种子和生长组织没有检测到凝集素存在的大豆同样在相对应的共生根瘤菌作用下产生根瘤。最近,人们又提出另一种假设,根瘤菌之所以能够与宿主特异性结合,是由于细菌产生的特定的脂,即几丁质寡糖与一种只在不同豆类植物中发现的新型植物根部凝集素相互作用产生的结果21。7凝集素作为识别分子尽管在70年代以前就报道称凝集素具有识别分子的作用,但是在当时并没有引起人们的关注。在50年代,澳大利亚Walter and Elisa Hall研究所的Alfred Gottschalk报道了能够凝集流感病毒的凝集素是流感病毒与宿主细胞相互接触,并导致感染的先决条件。然而直到1974年人们分离出了唾液酸糖蛋白受体一个肝脏凝集素,并且发现它有意想不到的识别和结合血清糖蛋白N 末端半乳糖残基后22,凝集素的生物识别功能才引起人们的关注。随后, St. Louis大学的W illiam S. Sly鉴定出了能够参与溶酶体酶在胞间穿梭的Man262P受体23,给这个假设提供了支持。肝脏凝集素在没有调理素(抗体和补体)存在的条件下也能参与将细菌从血液中清除掉,这个现象也是凝集素参与非免疫防御或先天免疫的一个早期的证据。另外一个重要的发现是在1979年, Sharon等人证明甲基化的2D 2甘露糖能够预防由甘露糖特异性Escherichia coli菌引起的小鼠尿道感染24。这是发现在感染初期参与感染的细菌凝集素的第一个直接证据,也是当前用于学术研究和将糖用于抗黏附疗法治疗此类疾病的基础。与此同时, Sharon和Ofek等人又发现细菌表面甘露糖特异性凝集素在没有调理素存在的条件下也参与细菌与噬菌细胞间的互相接触,导致吞噬和杀死细菌25。这个过程是先天免疫的另一个例子,我们称之为凝集素吞嗜作用。凝集素的生物功能如表2所示。表2凝集素的生物功能凝集素生物功能微生物中阿米巴虫感染细菌感染流感病毒感染植物中多数凝集素防御功能豆类凝集素与固氮菌的共生作用动物中Calnexin, 控制糖蛋白的生物合成calreticulin 控制糖蛋白的生物合成ERGIC253 控制糖蛋白的生物合成Collectins 先天免疫作用Dectin21 先天免疫作用Galectins 调节细胞生长和凋亡调节细胞周期调节胞间和细胞与基质间相互作用Macrophage mannose receptor 先天免疫作用清除硫化的糖蛋白激素Man262P recep tors 胞内溶酶体酶靶点L2selectins 淋巴归巢E2 and P2selectins 白血球穿梭至炎症部位Siglecs 免疫和神经系统中细胞间的相互作用Spermadhesin 精子卵子相互作用人们发现并证明, selectin在淋巴归巢和白血球穿梭至炎症部位过程中起到非常重要的作用,这是在凝集素研究过程中的里程碑。实际上, selectin是生物识别作用中糖凝集素相互作用的典范。它们参与了白血球与内皮细胞的结合,形成了一个旋转区,凝集素在其中与聚糖配体发生短暂地相互作用,最终导致了它们的外渗。另一种抗黏附疗法的应用,即通过抑制白血球与内皮细胞间的相互作用15精细与专用化学品第14卷第8期来阻止有害的炎症反应,已经成为生物医药和制药业的主要目标。也有研究显示selectin可能对癌细胞的扩散具有一定影响,因此可以通过阻断它们的结合位点,进而可能阻止癌症的转移。从80年代末期,越来越多的证据显示,不同种类的多种凝集素作为分子伴侣和分泌途径中的分选受体,直接参与了胞内跨膜糖蛋白的运输。Calnexin是一个内质网膜结合蛋白,功能与可溶性的相似体calreticulin相似,它的作用类似于质量控制系统,保证糖蛋白按照细胞表面指定的方式折叠。Galectin被认为是细胞与底物间相互作用的调控者,也是所有多细胞动物正常分化和成长所必须的。它们可以诱导细胞增殖、细胞释放和细胞凋亡,并且参与器官形成、癌细胞转移、白细胞转运、免疫反应和炎症反应等。开发新型的具有识别能力的新的凝集素,无疑是当今研究开发领域的热点,也会使得科学家可以更为直接和有效地探索生命现象的无穷奥秘。参考文献1Sumner J B, Howell SF. 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