Agilent_1200型高效液相色谱仪标准操作规程.doc

Shandong Simcere-Medgenn Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.山东先声麦得津生物制药有限公司Applicable dept.: TC分发部门：技术中心Subject: Standard operation procedure of Agilent 1200 HPLC文件名称：Agilent 1200型高效液相色谱仪标准操作规程Document No.: TC171-00 文件号： TC171-00 Supersedes document No.:替代文件号：无Revision:修订号：00Effective Date:生效日期：2009.11.01Approvals批准Dept.部门Occupation职务Signature签名Date日期Draftsman起草人TC技术中心职员Verifier审核人QD质量管理部文件主管Verifier审核人QD质量管理部经理Approved by批准人GMO技术中心总监1 目的建立Agilent 1200高效液相色谱仪的操作规程，保证其正确使用。2 范围Agilent 1200高效液相色谱仪的操作与维护。3 职责操作人员和责任人员对本规程的实施负责。4 内容4.1 组成G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1330B自动进样器恒温器、G1315B可变波长检测器（DAD）、GB16A 柱温箱和一套Agilent 1200 CHEMSTATIONS 软件（软件光盘与说明书原件由工程部保存），打印机。 4.2 在线清洗若实验的流动相中含有的缓冲盐和离子对等试剂干后会留下固体印迹的物质时，必须要进行在线清洗过程。首先配制好10%异丙醇溶液，经0.45m有机膜抽滤后，装入已用滤过的10%异丙醇溶液洗过三遍的洁净玻璃瓶内，调整流量为23滴/分钟，10%异丙醇溶液必须每周更新。4.3 开机接通电源，打开计算机，等计算机启动成功后，含四元泵的Agilent 1200高效液相色谱仪系统：从上到下，依次打开脱气机、泵、进样器、进样器恒温器、柱温箱和多波长检测器。约30秒钟后，各部件自检完毕，进入待机状态，指示灯为黄色或无色。双击桌面上的Instrument 1 Online，计算机进入工作站的Method and Run Control操作界面。画面如下所示。 4.4 色谱条件的设定4.4.1 方法的编辑 在method and run control 状态下，单击“method”选择“edit entire method”，请先在复选框中选择method中需要编辑的项目。 进入method information 在method comments 中输入方法的名称及相关描述，参数设置完毕后单击OK。 进入泵参数设置画面，设置泵流速（ml/min），流动相组成，冲洗梯度，停针时间等，参数设置完毕后单击OK。 进入column thermostatted method 编辑状态，选择柱温箱温度，设置完毕单击OK。 进入VWD编辑状态，选择方法中所需波长、峰宽、响应时间等，参数设置好单击OK。 进入signal details 编辑画面，选择下拉菜单中的VWDIA 进行参数设定，点击“DAD”图标，点击“Setup DAD Signals”，在“Signals”下方的空白处输入所需的检测波长，并在前面的方框里画“”设置完毕单击OK。 进入编辑积分表画面，对所需积分的峰斜率、峰宽、峰高、峰面积、肩峰等参数进行设定，设定完毕后单击OK。 进入specify report 编辑画面，单击screen 前的方框，设置报告。使其输出结果到屏幕，在calculate 选项中选择percent，在report style 选项中选择short， 单击singnal options 设置打印信号范围，单击OK。 进入时间编辑，在data acquisition 和standard data analysis 的复选框中打，选择好后单击OK，则方法编辑完毕。 在method and run control 状态下，单击method，选择save method as 选项，编辑方法名存储。4.4.2 进样操作4.4.2.1 调用方法进入method and run control 状态下，单击选择method 选项，单击load method 选择所要使用的方法。此时系统将根据所选择的方法进行相应的设置。开始前请根据方法对相应的参数例如：泵参数、自动进样器参数、自动进样器恒温器参数设定、柱温箱参数设定、检测波长设定等进行验证是否与方法设置中的一致。 4.4.2.2 自动进样序列的设定a 单个样品进行分析 在命令栏“Run control”下，选择“SampleInfo”或单击快捷操作的“一个小瓶”图标，然后单击样品信息栏内的小瓶，选择“Sample Info”，即打开了样品信息页面，可输入操作者（Operator Name）、数据存贮通道(Subdirectory)、进样瓶号(Vial)、样品名(Sample Name)等信息，单击“OK”，即完成。b 多个样品连续进行分析 编辑新序列：在命令栏“Sequence”下，选择“New Sequence”；然后再在命令栏“Sequence”下，选择“Sample Parameters”，可输入操作者（Operator Name）、数据存贮通道(Subdirectory)等信息；然后再在命令栏“Sequence”下，选择“Sequence Table”或单击快捷操作的“三个小瓶”图标，单击样品信息栏内的样品盘，选择“Sequence Table”，即进入连续进样序列表的编辑，可输入进样瓶号（Location）、样品名（Sample Name）、方法名（Method Name）、进样次数（Inject/Location）、进样体积（Inject Volume）等信息，单击“OK”，即完成。 调用已有序列：在命令栏“Sequence”下，单击“Load Sequence” 或直接单击快捷操作的“Load Sequence”图标（左边一文件夹，右边三个小瓶），选定文件名，单击“OK”即可。在对“Sequence Table”改动过后，切记要在“Sample Parameters”中改变保存路径，否则可能会覆盖以前的图谱。 指定样品进样：在命令栏“Sequence”下，选择“Partial Sequence”，选中要进的样品瓶号，单击“Run Sequence”，单击“Yes”即可。4.4.2.3 进样序列的保存在命令栏“Sequence”下，单击“Save Sequence”或单击快捷操作的“Save Current Sequence”图标（左边一软盘，右边三个小瓶）；在path下选择保存路径，在此路径下选择subdiectory输入新文件名，单击“OK”，即完成。4.4.2.4 平衡柱子 调用相应方法后，将流速改为0ml/min ，待界面变为绿色后，控制面板上显示”ready”，单击控制面板上的on，再将泵流速慢慢上升至所需流速。此时系统开始按照所设定的方法平衡柱子。4.4.2.5 HPLC自动进样在色谱图中可选择Change改变所要检测的波长，Balance使基线归零，Adjust使横纵坐标适应图谱，对于自动进样系统将自动平衡。等仪器准备好，基线平稳，直接点击“START”图标。4.5 数据分析4.5.1 谱图的调用 单击桌面上的Instrument 1 offline 打开命令窗口，单击Data Analysis此时在当前窗口左侧将出现磁盘中所保存的文件，在下拉菜单中找到所需要分析的文件并双击打开。或在Instrument 1 online 窗口中点击Data Analysis 按照上述程序操作画面中即出现所调用的色谱图。4.5.2 积分先调用所要分析的色谱图，调出后系统将根据方法中所设定的积分选项进行积分。如欲对其中某些参数进行修改，可在命令栏“Integration”下，选择“Integrate Events”或单击快捷操作的“Edit/Set Integration Events Table”图标，此时，在屏幕下方左侧出现积分参数表，右侧为积分结果，在积分参数表中按实际的要求输入修改的参数，在命令栏“Integration”下，选择“Integrate”或单击快捷操作的“Integrate Current Chromatogram”图标（左边有，右边两个峰），仪器即按照新设定的积分参数重新积分，完成后，单击积分参数表上方“Exit and save events to method”的快捷图标（右下角带勾），保存所作的参数修改并退出。 4.5.3 谱图优化从“Signals”菜单中选择“Signals Options”，如下图所示。从“范围(Ranges)” 中选择“满量程(Full)” 或“自动量程(Auto Scale)” 及合适的时间范围(Time Range)或选择“自定义量程(Use Ranges)” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“ OK”。4.6 打印报告在命令栏“Report”下，选择“specify Report”或单击最右侧快捷操作的“Specify Report Calculation and Print Style” 图标（右下角带叉的报告），根据实际要求选择报告的格式和输出形式等，单击“OK”，即完成。4.7 关机关机前，先关灯，用相应的溶剂充分冲洗系统。退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。关闭Agilent 1200各模块电源开关。4.8 Agilent 1200 LC维护保养4.8.1 色谱柱用完后，柱内应充满溶剂，两端封死（如乙腈/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。4.8.2 流动相使用前必须过滤，纯缓冲盐溶液有效期应不超过7天，有机相溶液有效期不应超过1个月。4.8.3 带seal-wash的 1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。4.8.4 应每周检查溶剂瓶中的溶剂过滤器是否堵塞，堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净。4.8.5 Agilent 1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要，方法如下：4.8.5.1 流动相使用前请必须脱气、过滤。4.8.5.2 使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。4.8.5.3 关机前，用 100%的乙腈冲洗系统20分钟，然后关泵，（适于反相色谱柱，正相色谱柱用适当的溶剂冲洗）。4.8.5.4 及时更换Purge Valve内的过滤芯。（当打开Purge Valve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。4.8.5.5 使用合适的密封圈。4.8.6 使用梯度比例时要注意事项：4.8.6.1 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。4.8.6.2 当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。4.8.7 在线真空脱气机使用注意事项：4.8.7.1 第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。4.8.7.2 不用的通道要充满溶剂或密闭起来。4.8.8 更换色谱柱时要注意事项：在使用HPLC时，应特别注意“柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要，一般Agilent 1200LC