转基因技术及其在植物育种中的应用.doc

转基因技术及其在植物育种中的应用一、概述从70年代重组DNA技术创建，到1983年第一株转基因烟草获得以来，国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点：接受？抵制？随着技术日趋成熟，转基因作物由实验室进人大田中试，不少作物已向商品化发展。与此同时，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。转基因技术实际上已由学术观点分歧，发展到知识产权问题、环境问题、经济问题甚至政治问题二、什么是转基因技术转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。又名遗传工程、基因工程、遗传转化。三、几种常用的植物转基因方法遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。 1农杆菌介导转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。 2花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 3. 基因枪法利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。四、转基因植株的检测标记基因(包括选择标记基因及报告基因)用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因等，其中用得最多的是抗生素抗性标记基因。报告基因包括 葡糖醛酸苷酶(gus)、荧光素酶(1uc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、以及绿色荧光蛋白(gfp)基因等。标记基因通常与目的基因构建在同一植物表达载体上，一起转人植物，但标记基因本身有时也可作为目的基因，如除草剂抗性基因提供除草荆抗性。（一）报告基因的捡测报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位索放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达，从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。1 抗性基因的酶活性检洲 （新霉索磷酸转移酶(NITII)、氯霉索乙酰转移酶(CAT)、PPT乙酰转移酶(PAT)是常用的3种抗性酶，因其易于检测，编码基因常用作报告基因。）2 腑脂碱和章鱼碱的测定3 荧光素晦活性检洲检4 GUS晦活性检测（二）PCR法检测转化植株PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达到ng乃至旭水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，谟化乙锭染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。（三） 点杂交和Southern杂交点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交，可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云渡等 用DNA、RNA的点杂交技术对转基田植株进行鉴定。取得与田间表现一致的结果。但点杂交的特异性差，阳性植株 譬进一步作Southern杂交验证。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术（四） Northern杂交Northern杂交是将试材RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上，用特定的DNA探针来检测RNA（五） Western杂交Western缸交技术是将蛋白质从SDS-PAGE胶中电转移至固相支持体上，彝；后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。Western杂交灵敏度极高髂达到标准的固定相放射免疫水平Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果髂直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现四、转基因作物研究进展（一）国际转基因作物的研究进展 自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。中国是国际上第一个商品化种植抗黄瓜花叶病毒(CMv)和抗烟草花叶病毒(TMv)双价转基因烟草的国家，但后劲不足。美国发展很快。发展态势： 1是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，研究手段、装备水平不断提高，基因克隆技术突飞猛进，一些新基因、新性状和新产品不断涌现。品种培育呈代际特征，目前全球转基因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合的复合性状正成为转基因技术研究与应用的重点。2是产业化应用规模迅速扩大。截至2009年底，全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积，由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。美国仍然是最大的种植国，2009年种植面积9.6亿亩；其次是巴西，3.21亿亩；阿根廷，3.195亿亩；印度，1.26亿亩；加拿大，1.23亿亩；中国，5550万亩；巴拉圭，3300万亩；南非，3150万亩。值得一提的是，2000年以来，美国先后批准了6个抗除草剂和药用转基因水稻、伊朗批准了1个转基因抗虫水稻商业化种植；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚4国批准了转基因水稻进口，允许食用。3是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。4转基因柞物中发展得最快的是大豆，全球1997年为510万公顷，到1998年猛增到1450万公顷。其它依次为转基因玉米、棉花、油菜，转基因马铃薯仅占很小一部分面积。5以转基因的性状而论，发展得最快的是抗除草剂转基因作物，l997年全球面积为690万公顷，1998年猛增1290万公顷，达到l980万公顷，其次是抗虫转基因作物，由1997年的400万公顷发展到770万公顷，此外抗虫与抗除草剂双价转基因作物也有所发展。（二）我国转基因作物的研究进展我国是世界上转基因作物第一个商品化种植的国家 且前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花( 棉及 +CpTI棉)、美国Monsanto公司开发的有 棉、延迟成熟期的转基因番茄、抗(Mv转基因番茄、抗cMv转基因甜椒及转查尔酮合酶(CHS)基因矮牵牛，但除转基因抗虫棉已经大面积生产外，后几种作物面积仅在1公顷左右。五、转基因技术在作物育种中的应用1 抗病毒 抗病毒方面目前以转移病毒外壳蛋白(CP)基因的技术最为成功。1986年首先将TMV外壳蛋白导入烟草和番茄，使转基因植物获得了对TMV的抗性。至今除TMV外壳蛋白基因外，还把CMV、PVX、SMV、ALMV等多种病毒的外壳基因导入烟草、番茄、马铃薯、大豆等多种作物中，在不同程度上减轻了病症，推迟了发病时间。 2 抗细菌和真菌 从抗病植物中克隆出抗病基因再导人易感病的植物中，从而提高后者的抗病性。例如已转育成功的抗白粉病、赤霉病和黄矮病的小麦，但这些基因只能对特异的病原菌生理小种有一定抗性，当新的生理小种占优势后就会丧失其抗性，因此这类基因的转育效果并不理想。 3 抗虫 抗虫方面目前应用最广泛的是苏云金杆菌的Bt杀虫晶体蛋白基因和豇豆等作物中的胰蛋白酶抑制基因。转Bt基因的作物已有烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米和棉花等，均有较好的杀虫效果。 4 抗除草剂 目前利用转基因技术获得抗除草剂作物的途径有二条，其一是改变除草剂靶物的敏感性，其二是导入编码降解除草剂的解毒酶基因，对相应的除草剂呈现出一定的的抗性。 5 改善植物品质 主要是通过转基因技术改变植物中氨基酸组成和含量，提高植物品质。其他，如分别导入抗寒基因、热休克蛋白基因和耐盐的相关基因，从而提高转基因植物的抗寒、耐热和抗盐能力。此外转基因技术还获得了一些雄性不孕植物、果实延缓成熟的番茄、改变了花颜色的矮牵牛等。六、转基因作物的利弊分析（一）.转基因技术有如下优势：1拓宽可利用的基因资源；2培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；3可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择4可以大大提高选择效率，加快育种进程。5生产转基因药品。将一种有治疗作用的基因植入某种食品，人们只需吃食物就能预防或治疗疾病。（二）转基因作物的潜在风险 1转基因作物本身可能变为杂草；2转基因作物通过基因流可使野生近缘种变为杂草；3可能产生新的超级病毒或新的病害；4作为人工制造的转基因作物，可能成为自然界原来不存在的外来品种，若干年后可能对环境造成破坏；5对非目标生物有伤害，对生物多样性形成威胁6转基因产品的毒性，能引起人的过敏反应。（三）基因水平转移(Horizontal gene transfer)的可能性 目前的结论是：这种可能性非常小，除非在特倒中需加考虑。理由是：1DNA从植物细胞中释放出来后，很快被降解成小片段，甚至核苷酸，因此植物DNA在进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠及结肠前已被降解。2即使DNA 完整地存在，DNA转移并整合进受体细胞也是一个非常复杂的过程，包括许多步骤：(1)DNA 必须与细胞结舍，穿过细胞膜进入细胞，且不被宿主细胞内的核酸酶及修饰系统降解。(2)受体细胞必须呈感受态。(3)为与受体细胞的基因组发生重组，供体和受体至少要有一段2O bp的DNA完全同源。(4)要有合适的调控系统才能表达。(5)标记基因的表达只有在筛选压下才有优势，对抗生素标记而言，只有在口服抗生素后才有这种选择压。(6)目前尚不知在消化系统中有植物DNA转至微生物的机制，上皮细胞又因新陈代谢、半衰期很短而被不断取代，不可能保存下来。七、转基因作物作为食品的安全性问题 经济发展合作组织(OECD)1993年提出了“现代生物技术食品的安全性评价：概念和原则”的报告，报告中引入了一个“实质等同性”(substantial equivalence)的概念。1996年9月30日至1O月4日第二次FAOWHO专家咨询会议于意大利罗马举行，就生物技术与食品安全性问题作了进一步讨论，会议将转基因植物、动物、微生物产生的食品分成三类：(1)与市售传统食品具有实质等同性；(2)除某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性(3)与传统食品没有实质等同性“ 。当前有的转基因食品已经上市，应该在上货架时对该食品要贴标签，让公众对是否愿意购买食用转基因食品有选择的自由八、转基因作物的专利保护国外出售的玉米种子都是杂交种，只能种一年，由于第二年会发生大量分离而收获的种子不能作种用，农民每年得向种子公司购买种子。这本身也就起到了专利保护的作用。而其它如水稻、大豆、棉花、小麦卖的都不是杂交种，应用高技术得到转基因作物种子的农民可以把收获到的种子留作种用，这样，遗传工程技术公司就赚不到高额的利润。 1“终止子技术”这项技术的大致程序是，科学家用遗传工程的技术把终止子基因插入到作物中得到转基因作物的种子；种子公司在种子出售前再加上一种诱导剂，农民播种后长出正常的植株，收获成熟的种子。这种种子在油脂、蛋白质等各方面分都是完全正常的，但不能种用。因为在诱导剂的作用下，加入的毒素基因启动产生了毒素，在种子成熟收获前就杀死了胚胎，因此这种种子不能发芽当生产用种。为了保护对世界食品的保障，要求禁止终止子技术。明确提出5点：农民留种的重要性，特别对贫穷的农民尤为重要；终止子技术对遗传多样性的影响；为了发展持续农业农民育种的重要性；由于外观上分不清终止子技术生产的种子，可能出售或交换不能发芽的种子，播种后对生产造成不可弥补的损失；通过花粉非故意传播造成生物安全的风险。 2“特殊性状的遗传利