虫草抗氧化分析.doc

冬虫夏草菌丝体水提物抗氧化和保护氧化损伤活性研究 罗建光 1 杨晓彤1 杨庆尧1 2 糜可1 冯慧琴1 1上海师范大学生命与环境科学学院微生物与免疫学研究所 上海 200234 2上海杨杨百草研究所 上海 200234 摘要摘要 目的目的 研究冬虫夏草 Cordyceps sinesis 菌丝体热水提物 CS HWE 抗氧化活性及 体外氧化损伤保护作用 方法方法 采用铁离子还原法 FRAP 和 H2O2氧化损伤的 PC12 细 胞模型对 CS HWE 抗氧化活性及对氧化损伤保护活性分别进行了测定 结果结果 样品抗氧化 活性为 158 03 5 39 mol Fe2 g 1 相当于天然虫草提取物活性的 75 CS HWE 在 50 100mg L 1时可明显提高 PC12 细胞对 H2O2氧化损伤的保护作用 活性与天然虫草提取物 相当 结论结论 虫草菌丝体热水提物具有一定的抗氧化作用 可作为开发天然抗氧化药物的 潜在资源 关键词关键词 冬虫夏草菌丝体 FRAP PC12细胞 抗氧化 中图分类号 中图分类号 R282 71R282 71 文章标识码 文章标识码 A A 文章编号 文章编号 自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团 其中氧自由基和氮氧自由基是与生命 或健康相关的主要自由基类型 这些自由基可与许多生物大分子发生氧化损伤反应 目前 认为衰老 炎症 癌症 白内障 心血管疾病 以及帕金森氏病 阿尔兹海默氏病等神经 退行性疾病都与自由基氧化损伤有关 1 抗氧化 减少过多的自由基产生 或促进机体产 生内源性抗自由基物质 提高机体对自由基氧化损伤的自我保护能力 可在一定程度上预 防相关疾病的发生或改善症候 因此 筛选和开发抗自由基物质受到医药界的广泛关注 冬虫夏草 Cordyceps sinensis Berk Sacc 为麦角菌科真菌寄生在虫草蝙蝠蛾 Hepialus armoricanus 幼虫上的子座及幼虫内菌核的复合体 为名贵的滋补性传统中药材 药理学研究表明 冬虫夏草及其发酵菌粉具有抗氧化的作用 并认为虫草的抗衰老活性与 清除自由基能力有关 2 目前人们对冬虫夏草抗自由基活性的测定主要采用黄嘌呤氧化酶 法 超氧化物岐化酶 SOD 过氧化物酶 POD 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH Px 活性与丙二醛 MDA 等方法进行评价 但此类方法仅反映虫草对某类自由基 如氧自由基 O2 羟自由 罗建光 上海师范大学生命与环境科学学院微生物专业 2004 级研究生 通讯作者 地址 上海市桂林路 100 号 14 号楼 8 楼 邮编 200234 Email xtyang 本课 题由香港保健协会资助 基 OH 脂质过氧化自由基 ROO 等 的清除作用 而不能反映总体抗氧化能力 因此 本研究首次采用可测定总抗氧化活性的铁离子还原法 ferric reducing antioxidant power assay FRAP 法 对冬虫夏草菌丝体水提物进行了分析 并采用 PC12 细胞氧化损伤模型研 究了虫草对氧化损伤的保护活性 结果还与天然冬虫夏草提取物进行了比较 为今后深入 开发抗氧化 抗衰老的发酵虫草产品提供前期研究和理论基础 1 1 材料与方法材料与方法 1 11 1 材料材料 1 1 11 1 1 试剂与仪器试剂与仪器 Dulbecco s modified Eagle s medium DMEM Invitrogen 产品 胎牛血清 FBS PAA 产品 噻唑蓝 MTT 与十二烷基硫酸钠 SDS 为 Sigma 产品 2 4 6 三 吡啶 1 3 5 三吖嗪 2 4 6 Tri 2 pyridyl s triazine TPTZ 为 Alfa Aesar 公司产品 其它化学试剂均为国产分析纯 酶标仪 Bio Rad680 CO2 培养箱 Heraeus 真空低温冷 冻干燥机 Virtis 2KBTES 55 高速冷冻离心 Beckman GS 15R 超净工作台 紫外 可 见分光光度计 岛津 UV 2450 电子天平 PH 计 PHS 3TC 天然冬虫夏草为上海雷允 上药业有限公司产品 产地为青海 西藏 金水宝为江西金水宝制药有限公司产品 国药 准字 Z10890003 1 1 21 1 2 细胞株细胞株 大鼠肾上腺嗜铬瘤 PC12 细胞株购自中科院上海细胞所 PC12 生长并维持 在含 10 FBS 1 105 U L 1 penicillin 1 105 g L 1 streptomycin 的 DMEM 培养基中 并置于 37 5 CO2饱和湿度的培养箱培养 1 1 31 1 3 样品制备样品制备 冬虫夏草 Cordyceps sinesis CS 1 菌株 经液体发酵培养所得菌丝体 用热水浸提 离心分离提取液 再经减压浓缩 冷冻干燥 得到虫草发酵菌丝体水提取物 CS HWE 各样品用磷酸缓冲生理溶液 PBS 配制成10mg ml的贮备液 用0 22 m除菌并保藏在4 冰箱中备用 临用前用DMEM完全培养基 C DMEM 配制成所需实验浓度 天然冬虫夏草 和金水宝均经与CS HWE相同方法提取 干燥 分别得到天然冬虫夏草水提物 NCS 和 金水宝水提物 JSB 在实验中作为阳性对照 1 21 2 方法方法 1 2 11 2 1 FRAPFRAP 法测定虫草菌丝体水提物的抗氧化活性法测定虫草菌丝体水提物的抗氧化活性 其原理为 Fe3 三吡啶三吖嗪 TPTZ 可被样品中的还原物质还原为二价铁形式 呈 现出蓝色 并于 593nm 处具有最大光吸收 根据吸光度的大小可计算出样品抗氧化活性的 强弱 具体方法按参考文献进行并略作改动 4 5 FRAP 试剂用 NaAc HAc 缓冲液 pH 3 6 10mmol L 1 TPTZ 用 40mmol L 1 HCl 配制 20mmol L 1 FeCl3按体积比 10 1 1 配 制而成 取精确配制的待测样品溶液 1g L 1 200 l 加入 6ml FRAP 试剂 混匀后 37 反应 4 10 分钟 测定 593nm 处吸光度 以 1 0mmol L 1 FeSO4为标准 样品抗氧化 活性 FRAP value 以达到同样吸光度所需的 FeSO4的毫摩尔数表示 每个样品设三个平 行 取其平均值 计算试样含量 X V C m 式中X 为试样中FeSO4的含量 mol g 1 V为定容后的体积 L C 为测定液中 FeSO4的含量 mol L 1 m为试样的重量 g 1 2 21 2 2 虫草菌丝体水提物对氧化损伤的虫草菌丝体水提物对氧化损伤的 PC12 细胞保护活性的考察细胞保护活性的考察 试验分为正常对照组 H2O2损伤模型组 CS HWE组 浓度 25 50 100mg L 1 和相 应浓度的CS HWE H2O2损伤模型组 将对数生长期的PC12细胞用胰酶制备成单细胞悬液 并用C DMEM把细胞密度调整为1 108个 L 1 种于96孔板中 每孔50 l 于37 5 CO2饱 和湿度的培养箱预培养24小时 HWE组与CS HWE H2O2损伤模型组每孔分别加入不同浓 度的HWE溶液50 l 使HWE终浓度分别达到25 50 100mg L 1 正常对照组与H2O2损伤 模型组每孔加入C DMEM 培养24小时 96孔板弃去培养基 并用PBS洗2次 无血清的 DMEM洗1次 然后 H2O2损伤模型组和CS HWE H2O2损伤模型组孔中加入用无血清DMEM 配制的200 mol L 1 H2O2 50 l 孔 1 正常对照组和CS HWE组用不含H2O2的DMEM同 法处理 96孔板在CO2培养箱中孵育2小时后弃去培养基 用PBS洗2次后 加入100 l 孔 1 C DMEM并在CO2培养箱中继续孵育4小时 用MTT法检测细胞的生存率 6 以正常对照组 细胞存活率作为100 模型组存活率 模型组吸光值 正常对照组吸光值 x100 药 物处理组存活率 CS HWE H2O2损伤模型组吸光值 对应浓度的CS HWE组吸光值 x100 1 2 31 2 3 统计方法统计方法 数据用均数 标准差 s 表示 分析比较采用配对t检验 x 2 2 结果结果 2 12 1 FRAPFRAP法对法对虫草菌丝体水提取物虫草菌丝体水提取物的抗氧化活性的检测的抗氧化活性的检测 以标准品 FeSO4 溶液的吸光度值与标准品的浓度 mol L 1 进行线性回归 并求得回 归方程和相关系数 R2 见图 1 结果表明 FeSO4浓度在 0 1000 mol L 1范围内与吸光 度值有良好的线性关系 对同一虫草样品 5 次重复测定 RSD 为 3 41 表明结果是精确 可靠的 表 1 用该法测定得到的 CS HWE 抗氧化活性结果显示在表 2 可见虫草菌丝体水提物与天然 虫草水提物和金水宝提取物均具有抗氧化能力 其中 CS HWE 的活性与金水宝接近 p 0 05 相当于天然虫草水提物活性的 75 4 y 0 0003x 0 0024 R2 0 9993 0 00 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 35 0 40 02004006008001000 Fe2 mol L 1 Abs 图 1 FRAP 法测定的标准曲线 Fig 1 Standard curve of FRAP assay 表 1 精密度实验 Table 1 The results of the precision test 表 2 冬虫夏草菌丝体水提物的抗氧化活性 Table 2 Antioxidant activities of HWE from mycelia of Cordyceps sinensis SampleAntioxidative activity mol Fe2 g 1 Number of testResult mol Fe2 g 1 RSD 1158 64 2156 16 3151 99 4156 74 5166 64 3 41 NCS CS HWE JSB 209 55 5 98 158 03 5 39 161 51 1 04 注 与天然冬虫夏草提取物比较 p 0 05 p0 05 Note p 0 05 p0 05 vs JSB 2 22 2 虫草菌丝体水提取物虫草菌丝体水提取物对对 PC12 氧化损伤的保护作用氧化损伤的保护作用 表3表明 PC12细胞经H2O2处理后 细胞生存率明显下降 模型组与对照组相比呈现 极显著差异 p 0 01 表明氧化损伤模型是成功的 PC12细胞如果先用虫草菌丝体水提 物处理 再用H2O2损伤 其细胞生存率相对模型组有明显提高 当CS HWE浓度达50mg L 1 100mg L 1 时 差异达到统计显著性 p 0 05 vs model group 在100mg L 1 浓度时 CS HWE的氧化损伤保护活性与天然虫草水提物及金水宝接近 无统计学显著差异 p 0 05 表 3 冬虫夏草菌丝体水提物对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用 Table 3 The protection effect of CS HWE on PC12 cell injured by H202 treatment 注 与正常对照组比较 p 0 05 p 0 01 与 H2O2损伤模型组比较 p 0 05 p0 05 与金水宝提取物比较 p 0 05 Note p 0 05 p 0 01 vs normal control p 0 05 p0 05 vs H2O2 injury model group p 0 05 vs NCS group p 0 05 vs JSB group 3 3 讨论讨论 目前测定抗氧化活性的方法较多 大多数方法仅针对某一种自由基的清除活性 如黄 GroupCell survival rate Normal control 100 00 0 40 H2O2 injury model group 59 38 1 58 NCS 100mg L 1 68 71 2 36 JSB 100mg L 1 74 24 8 05 CS HWE 25mg L 1 66 67 4 90 CS HWE 50mg L 1 67 44 1 64 CS HWE 100mg L 1 70 10 0 67 嘌呤氧化酶法仅测定样品对 O2 的清除能力 ORAC 法仅能测定样品清除 ROO OH 等自 由基的能力 不能测定对总体自由基的清除活性 此外黄嘌呤氧化酶法不容易标准化 ORAC 法手工操作费时费力 自动化方法则需要昂贵的全自动生化分析仪 很难推广应用 而 FRAP 法原理明确 操作简便 易于标准化 结果可靠 测定不需昂贵的仪器 同时其 不是针对某一种自由基的清除活性 而是反映样品总的抗氧化活性 更适合用来评估含有 多种成分 可清除不同自由基的天然药物产品 我们的结果显示 FRAP 法可用于虫草菌丝 体水提物总抗氧化活性的测定 并且线性好 测定范围大 精密度高 PC12 细胞具有交感神经元细胞特性 常作为研究神经元发育 分化和功能的体细胞模 型 而 H2O2本身就是与氧化应激反应密切相关的活性氧之一 易穿过细胞膜在细胞内产生 氧自由基 攻击细胞内的蛋白 DNA 等成分 引起广泛的氧化损伤 6 7 本实验采用 PC12 细胞模型对 HWE 抗氧化损伤的保护活性进行研究 结果显示 PC12 细胞经虫草菌丝体水提 物预处理后 其抗 H2O2氧化损伤能力明显增强 其原因可能在于虫草菌丝体水提物可能参 与细胞内抗氧化酶系统的调节 通过刺激细胞产生内源性抗氧化物质来保护细胞免受或降低 氧化损伤 我们由此推测 虫草菌丝体水提取物的抗氧化抗自由基机制可能有双重途径 一是直接清除自由基 通过减少自由基的生成降低对脂质 蛋白和 DNA 的损伤 二是通 过调节细胞内抗氧化系统的能力 以发挥其抗氧化的作用 虫草提取物对 PC12 细胞氧化损 伤的保护也提示虫草可能对因氧化损伤引起的神经退行性疾病有预防和治疗作用 本研究结果还显示 菌丝体水提物对氧化损伤的保护活性与天然虫草提取物相当 其 总抗氧化活性虽只有天然虫草提取物的 75 左右 但考虑到菌丝体可用液体发酵方法进行 大规模工业化生产 在成本和产量上具有天然虫草不可比拟的优势 因此虫草菌丝体发酵 产品具有广阔的发展前景 REFERENCES 1 Pogocki D Alzheimer s beta amyloid peptide as a source of neurotoxic free radicals the role of structural effects J Acta Neurobiol Exp Wars 2003 63 2 131 45 2 Li S P Li P Dong T T et a1 Anti oxidation activity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia J Phytomedicine 2001 8 3 207 3 Zhang X Q Pu Y P Yin L H et al Study on scavenging effect on superoxide anion free radical and hydroxyl free radical of Cordyceps sinensis and mycelium of cultured Cordyceps sinensis J Chinese journal of gerontology 中国 老年学杂志 2003 23 773 775 4 Benzie I F F Strain J J Ferric reducing ability of plasma FRAP as a measure of antioxidant power The FRAP assay J Anal Biochem 1996 239 70 76 5 Wong C C Li H B Cheng K W et al A systematic survey of antioxidant activity of 30 Chinese medicinal plants using the ferric reducing antioxidant power assay J Food Chemistry 2006 97 4 705 712 6 Yang X T Zhou Y Q Li X Q et al A comparison study of the in vitroanticancer activity and mechanism of ethanol extracts from mycelia of different Ganaoderma lucidum strains J Mycosystema 菌物学报 2005 24 2 251 258 7 Halliwell B Aruoma O I DNA damage by oxygen derived species J FEBS Lett 1991 281 9 19 8 Denisova N A Cantuti Castelvetri I Hassan W N et al Role of membrane lipids in regulation of vulnerability to oxidative stress in PC12 cells implication for aging J Free Radic Biol Med 2001 30 671 678 The Antioxidantive Activities and Oxidative Injury Protective Effects of Hot Water Extracts from Cordyceps sinensis Mycelia LUO Jian Guang1 YANG Xiao Tong1 YANG Qing Yao1 2 MI Ke1 FENG Hui Qin1 1 Institute of Microbiology and Immunology Shanghai Normal University 200234 China 2Shanghai Yang s Herb Institute Shanghai 200234 China ABSTRACT OBJECTIVE To investigate the activities of CS HWE the hot water extracts derived from the liquid cultured Cordyceps sinensis mycelia on antioxidantion and oxidative injury protection METHOD The ant