质谱技术介绍.doc

1. 基本原理基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。2 分子量测定 分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1%0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。 我们第一次获得了SARS病毒N蛋白整体分子量我们测定的某纳克级蛋白质的分子量我们测定的某糖蛋白分子量某外资企业的新型日用化学品的分子量分布3. 蛋白质组学中的质谱技术肽质量指纹谱技术（PMF）蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱（PMF）在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质，是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。在我们关于蛋白质组学研究的实际工作中，几乎所有的发现均是从这一部开始做起来的！利用该技术鉴定的一系列蛋白质已经发表在Oncogene、Clinical Cancer Research、Electrophoresis、Proteomics、中国科学 等一系列国内外学术期刊上。4. 蛋白质组学中的质谱技术肽序列标签技术（PST）由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响，使得部分鉴定结果往往不是十分明确，特异性不高。多肽氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白质组学研究中，利用质谱测序一般采用两种方式：一种是利用串联质谱（MS/MS）测序；另一种是利用源后衰变（PSD）技术测序。 在反射式MALDI-TOF-MS中，当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时，能量通过基质传递给样品，导致样品被解析电离，电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区（即飞行管区）时发生裂解（其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞，在无场区与残留气体的碰撞，激光辐射及各种热机制等）所产生的子离子（即源后分解碎片离子），可以通过不断改变反射器电压来进行分离、收集并记录于检测器，形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图，结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。目前，在蛋白质组学研究中，部分经2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不明确，可将PSD测序功能应用于这些蛋白质的鉴定。随着对PSD技术的不断研究和发展，尤其是结合MALDI-TOF-MS本身所具有的高灵敏度、高通量、样品靶点可多次应用测定、分析时主要产生单电荷准分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特点，PSD-MALDI-TOF-MS将会在蛋白质组学、代谢组学以及药物筛选的研究中发挥更大的作用。5. 寡核苷酸的分析随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展，越来越多的寡核苷酸片段被合成，用以作引物、探针以及反义药物等。对这些片段进行快速检测，以判断合成的是否完全及合成的序列是否正确，是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在内的生物质谱是迄今为止进行这种检测最好的手段。用MALDI-TOF-MS测定分析寡核苷酸，简单、快速、准确、灵敏。结合3外切酶和5外切酶可以对寡核苷酸全序列进行测定。蛋白质组学网NCBA蛋白质组学网站是国家生物医学分析中心一个主要针对电泳和生物质谱技术的生物信息学网站。网站于2002年1月在中国互联网信息中心注册，3月1日起正式对院内外提供服务。现已初具规模，拥有了多种数据库检索、用户数据查询、软件下载、分析技术方法、技术论坛、相关知识介绍等功能，并且仍在不断的完善之中。在蛋白质组学网中，我们现已初步建立了以下几个数据库：1. 质谱数据库：主要由MALDI-TOF-MS、Q-TOF、Ion-Trap、GC-MS等质谱数据库组成。2. 电泳数据库：包括2D蛋白电泳图及其图中蛋白质斑点的相关数据。该数据库的数据均来自NCBA蛋白质组技术平台提供的电泳图谱。http:/2/ 3. 用户数据库：包括送检样品在线用户注册、在线申请检测项目以及在线数据浏览、下载和在线蛋白质数据库检索等功能模块。/2005/userdata/user_online.asp 4. 蛋白质数据库： 本网站现安装了SWISS-PROT蛋白质序列数据库。扩充的糖蛋白、磷酸化蛋白质以及其他特殊修饰的蛋白质以及蛋白质复合物等数据库正在构建中。5. Global Server蛋白质数据库检索：该检索系统是由Micromass公司开发基于本地SWISS-PROT蛋白质序列数据库的检索引擎，经该公司授权，我们将其改为了基于Web的蛋白质检索系统。该系统可通过PMF和MS/MS数据进行蛋白质快速检索和鉴定（约10秒左右），检索结果不仅包含蛋白质匹配的肽段，还提供谱图模拟和匹配分布图。 6. Mascot蛋白质数据库检索：经Matrxiscience公司同意，我们建立了Mascot蛋白质数据库中文检索系统，用于INTERNET在线PMF、MS/MS以及蛋白序列的识别和数据库检索。包括肽质量指纹谱的检索；肽序列、氨基酸组成、子离子的检索；MS/MS原始数据的检索。/ 应用文章摘录1. Xia Q, Wang HX, Wang J, Zhang JY, Liu BY, Li AL, Lv M, Hu MR, Yv M, Feng JN, Yang SC, Zhang XM, Shen BF. Proteomic analysis of interleukin 6-induced differentiation in mouse myeloid leukemia cells. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2005 (in press) 2. Jin BF, Wang HX, He K, Yu M, Hu MR, Yang SC, Shen BF, Zhang XM. Proteomic analysis of apoptosis triggered by inhibition of ubiquitin-proteasome pathway in M07e leukaemic cells. Cell Research, 2002, 12:271. 3. Jin BF, He K, Wang HX, Wang J, Zhou T, Lan Y, Hu MR, Wei KH, Yang SC, Shen BF, Zhang XM. Proteomic analysis of ubiquitin-proteasome effects: insight into the function of eukaryotic initiation factor 5A. Oncogene，2003 22:4819-4830. 4. Cui JW, Wang J, He K, Jin BF, Wang HX , Li W, Kang LH, Hu MR, Li HY, Yu M, Shen BF, Wang GJ, Zhang XM. Proteomics analysis of human acute leukemia cells: insight into their classifications. Clinical Cancer Research, 2004 Oct 15; 10(20):6887-96. 5. Cui JW, Wang J, He K, Jin BF, Wang HX , Li W, Kang LH, Hu MR, Li HY, Yu M, Shen BF, Wang GJ, Zhang XM. Two-dimensional electrophoresis protein profiling as an analytical tool for human acute leukemia class