01显微镜的使用及简单染色法.doc

实验一 显微镜的使用及细菌的简单染色法一、实验目的：1.了解显微镜的成像原理及油镜加香柏油的原理。2.熟练掌握显微镜的使用方法。3.掌握简单染色方法，并初步认识细菌的形态特征。4.掌握油镜的使用方法和无菌操作技术。二、原理：1.普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜都是由一套透镜组成的。普通光学显微镜通常能将物体放大1500-2000倍。分辨率（可辨出两点间最小距离），公式如下：为所用光源波长；为物镜镜口角；n为玻片与物镜间介质的折射率。最短可见光450nm。空气n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.52。光学显微镜在最短波长450nm，用油镜其最大的分辨率为0.18m。肉眼正常德分辨率为0.25mm。因此光学显微镜有效的最高总放大倍数能达到10001500倍。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。数值孔径（numerical apeature简写为NA）是物镜的主要参数，是决定物镜性能的最重要指标。数值孔径可用下式表示：NA=镜口角总是小于180。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05-0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。2. 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞常带负电荷，而碱性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。染色前必须固定细菌。热固定的目的有三：一是杀死细菌以固定其形态；二是使菌体粘附于玻片上；二是改变细胞壁的通透性，增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。三、材料：1.菌种：黄色四联球菌（1218h营养琼脂斜面培养物）2.染色剂：石炭酸复红染液。3.仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。四、实验内容及步骤：内容一：显微镜的使用操作及注意事项：显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。（一）观察前的准备1、拿取显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3、调节光照 自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。（二）低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，将观察部位移至视野中央进行观察。（四）油镜观察 油浸物镜的工作距离很短，一般在0.2mm以内，并且无“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。内容二：细菌的简单染色1.涂片：取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接种环以无菌操作斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。注意蒸馏水和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2.干燥：室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。3.热固定：将玻片连续从酒精灯火焰上通过34次。4. 染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液12滴于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。石炭酸复红2030秒5.水洗：倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。6.干燥：甩去