质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用.ppt

质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用 306医院检验科易勇2016 03 岛津 梅里埃 MALDITOF产品系列 LinearonlyMALDI TOF LinearandreflectronMALDI TOFPSDcapability LinearandreflectronMALDI TOF TOFPSD CIDcapability UniqueinstrumentMALDI iontrap TOFreflectrononlyMSncapabilityHighresolutionandhighmassaccuracy 布鲁克各类现代生物质谱 离子阱 MALDITOF TOF ESI Q TOF FTMS 质谱仪的工作原理 质谱仪是利用电磁学原理 使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置 离子电离后经加速进入磁场中 其动能与加速电压及电荷z有关 即m z 2U v2其中z为离子的电荷 U为加速电压 m为离子的质量 v为离子初加速后的运动速度 具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中 根据所选择的分离方式 最终各种离子按质荷比 m z 的不同实现分离 电离源 质谱仪中产生离子的装置称为离子源 ionsource 电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子 由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大 因此 对于不同的分子应选择不同的离解方法 通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法 而给样品较小能量的电离方法为软电离方法 质谱技术中的几种离子源 基质辅助激光解吸离子化 MatrixAssistedLaserDesorptionIonization MALDI 2 电喷雾离子化 Electrosprayionization ESI Sampletarget Ionoptics Lineardetector Laser MALDI TOFMALDI 线性工作原理 Mixmatrix sampleontargetFirelaseratmatrix sampleIonizesample solidtogasphase Accelerate extractionsSeparateionsinanalyzerRecordspectrumatdetector Timeofflight TOF massanalyzer fieldfree 0 20 40 60 80 100 10000 20000 30000 40000 m z vemode M H ions MALDI基质辅助激光解析附原理 Streptococcuspneumoniae masssignalsmatchingtoribosomalproteins consideringpossiblemethioninecleavageand ormethylation aremarkedinred 50 ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteins proteinmassesobtainedfromtheSwiss Prot TrEMBLsequencedatabase 质谱仪的基本结构 一 真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态 离子源真空度应达1 3 10 4 3 10 5pa 质量分析器中应达1 3 10 6pa 若真空度过低 则会造成离子源灯丝损坏 本底增高 副反应过多 从而使图谱复杂化 干扰离子源的调节 加速极放电等问题 一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后 再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空 图5 1质谱仪的构成 微生物鉴定方法 耗时 气质法 GC MS 脂肪酸 小分子糖 MALDI TOFMS 12 Jan 20 10 微生物鉴定新方法 MALDITOF 比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体分析时间仅1 2minutes 现代微生物分类学 蛋白组学 基因组学 Protein DNA Genome Proteome DNAFingerprint MassFingerprint SpeciesDefinition Determination MALDI TOFMS 12 12 不同细菌代表性指纹图谱不同 各菌种代表性峰型分布存在显著差异 有助于鉴定各个菌种 13 13 肠杆菌 Enterobacteriaceae MS图谱示 科 属 种特异性峰值 部分峰值是多数菌种共有的 如m z4365 核糖体蛋白L36 峰值有科 属 种或亚种 特异性 种间特异性代表峰值用来区分不同菌种 核糖体蛋白不受生长条件影响 MassspectraofProteusmirabilisDSM4479atdifferentincubationtimesNomajorqualitativechangesinpeakpatternsdistinguishingfamily genusandspeciesDecreaseofsignalintensityovertimePresenceandabsenceofpeaksIdentificationwith 99 confidence SARAMIS工作流程 微生物鉴定流程 生长在固体培养基上的菌落 全细胞MALDI TOF谱图 数据库中参考谱图 输出可信鉴定结果 找到匹配度最可信的谱图 17 鉴定结果界面 只需数秒 全自动添加新采集数据至鉴定结果界面 不同颜色代表不同置信水平深绿 99 9 浅绿 90 99 9 黄色 85 90 白色 70 85 低于70 不显示置信值红色 提醒复杂的结果 匹配2种或以上菌种 置信度 99 鉴定混合菌 SARAMIS鉴定混合菌种 AmassspectrumofamixedsamplecontainingPseudomonasaeruginosaandAchromobacterxylosoxidansShowspeaksspecifictobothspecies 单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes Lm 兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌 自然界分布广泛 是食源性李斯特病 人畜共患病 的致病原因 低温仍具有增殖能力对老年人 婴儿 孕妇和免疫缺陷者的致死率是20 30 该菌经常存在于速食食品中Ex About2 500cases yearinUSA 食品安全TokyoMarineUniversity ProfKimuraandDr Takahashi Eatablewithoutheatedandcockedorcockedfood ex ham dailyproduct salad smokedfoodetc 现有检测方法需要2步骤和选择培养基 耗时6天 Yakult 养乐多 乳酸菌生产质量控制品种改良Performance SARAMIS Classifiedasgenus species strain Thickness ofdatabaseisimportant From2011Europeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdisease 菌种鉴定准确度 12 Jan 20 22 SARAMIS SpectralARchiveAndMicrobialIdentificationSystem 数据库含有超级谱图 SuperSpectra 和参考谱图 ReferenceSpectra 使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图软件包可实现谱图的存储 分析和比较使用者可以做聚类分析 创建系统树图用于菌株分型 SARAMIS菌种特异峰型 合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰 如 在各谱图中出现70 的 在超级谱图中 所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值具有科 属特异性的峰值权重低 这些峰值不支持菌种鉴定具有菌种特异性的峰值权重则会加重 SARAMIS 比较工具 Clusteranalysisofselectedreferenceandsamplemassspectra Comparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabase 在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株 基于质谱图谱 基因组学 表型数据 atypicalreferenceisolatesareover representedinSARAMIS phylogeneticdistance phylogeneticdistance frequency frequency 自然界菌种多样性 SARAMIS与LIMS系统 Culturefromthestockingricelol Cultureinvariousconditions Collectisolatesfromourlabandotherfacilities 10 MeasureMSspectraandconstructDatabase Applytouncertainty whichreducestabilityofidentification Differenceincolonyinasamemedia 2HWproducttolerance 3systemOperator 12peopleCulturemedia maximum5kindsCulturelength 24 48 72hCulturevender 3venders Max3 240spectra 深度透视数据库 MicroIDsystemintrucduction Version1 0 自动鉴定界面 比对鉴定界面 MicroID MALDI TOFMS微生物鉴定优势 一种对所有微生物都适用的方法无需预选测试与现代分类学结果一致高度配合有特殊需求使用者可扩展新菌种及其应用非常耐用且重复性高样品准备过程非常简化可进行高通量分析绝佳成本与效益比 32 AXIMAMALDI 线性 反射不只是微生物鉴定 MALDITOF全面解决方案 布鲁克各类现代生物质谱 离子阱 MALDITOF TOF ESI Q TOF FTMS 高分辨质谱仪全方位应用 天然产物分析药物研究蛋白质组学代谢组学 micrOTOFQ micrOTOFQ DryGasHeater OrthogonalAccelerator GlassCapillary CollisionGasSupply Hexapole 电喷雾离子源 去溶剂系统 飞行管 检测器 反射镜 离子聚焦系统 离子漏斗式传输 四级杆Q 碰撞池 布鲁克公司独家专利设计 离子漏斗式传输系统 离子流方向 离子传输率大大提高 从而提高灵敏度 增宽传输离子质量范围 离子流方向 传统的锥式离子传输 micrOTOFQ适用范围 电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 精确质量 3ppm micrOTOFQ 独特的三维信息 MS MS提供结构信息 电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 SigmaFit 参数 同位素峰形匹配 精确质量 3ppm micrOTOFQ 独特的三维信息 MS MS提供结构信息 电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 SigmaFit 参数 同位素峰形匹配 SigmaFit 参数 同位素峰形的匹配 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 C254H383N65O75S6 5735 65 0 2000 4000 6000 Intens 1146 0 1146 5 1147 0 1147 5 1148 0 1148 5 1149 0 1149 5 1150 0 m z 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 模拟同位素分布峰形 实测同位素分布峰形 SigmaFit 参数 同位素峰形的匹配 SigmaFit参数 0 SigmaFit参数 0 436 0398 Experimental 436 0400 C12H22NO10S3 436 0367 C15H18NO10S2 0 2 4 6 0 2 4 6 435 436 437 438 439 440 441 442 m z sigma 0 0167 sigma 0 0231 Intensityx104 A B C 鉴定化合物的有效工具 SigmaFit 两种可能元素组成的确定 分子量 500Da未知物的元素组成预测 人参提取液 稀释倍数1 100 HPLC microTOFQ 当设置误差范围 5ppm时 171个可能的分子式 GenerateMolecularFormula 16个可能的分子式 当设置误差范围 3ppm时 GenerateMolecularFormula C55H93O25 用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配 选择Sigma值最小的分子式 即该化合物的分子式为 GenerateMolecularFormula SigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配 1153 60114 1154 60456 1155 60742 1156 61021 C55H93O25 1153 60 1153 59527 1154 59868 1155 60170 1156 60459 C62H89O20 1153 59 0 5