（农产品加工及贮藏工程专业论文）高纯度儿茶素单体EGCG和ECG分离及纯化工艺研究.pdf

高纯度儿茶素单体e g c g 和e c g 分离及纯化工艺研究 摘要 儿茶素是茶叶中的重要成分，由于其具有重要的生物活性、抗氧化性及清除自由 基的能力而日益受到人们的重视。已鉴定出的儿茶素单体主要有八种，可分为酯型与 非酯型两类，其中的酯型儿茶素表没食子儿茶素没食子酸酯e g c g 和表儿茶素没食子酸 酯e c g 药理活性最强，需求量较大。 本文以茶多酚粗品为原料，采用正交试验系统研究了儿茶素e g c g 和e c g 在葡聚糖 凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 柱上的分离及纯化条件。预分离试验采用无水乙醇为洗脱剂( 柱 高5 0 c m ，洗脱流速0 7 5 m l m i n ) ，实现了原料茶多酚中儿茶素单体e c g 与e g c g ( 含没 食子儿茶素酸酯g c g ) 的有效分离。e c g 单体洗脱率9 7 6 4 ，纯度达9 7 6 2 ，提取率 ( 8 5 6 7 ) ；e g c g ( 含g c g ) 单体洗脱率9 8 4 5 ，纯度达8 8 6 6 。预分离所得e g c g ( g c g ) 组分适度浓缩后，再经s e p h a d e xl h 一2 0 纯化( 洗脱剂为4 0 乙醇水溶液，柱高5 0 c m ， 洗脱流速0 6 0 m l m i n ) ，可制备得到高纯度e g c g 单体( 色谱纯度9 9 9 ) ，提取率 ( 8 5 3 1 ) 和色谱纯度( 9 9 ) 均接近或高于目前国内外报道的儿茶素分离提取方法。 本文研究的方法大大简化了儿茶索单体分离纯化设备，只需经过常规的两次柱层 析系统即可完成单体e g c g 的分离提纯，实现了e g c g 和e c g 柱分离与柱纯化步骤的连 续操作，方法简便，成本低廉，溶剂无毒，单体提取率及产品纯度均较高，并可实现 e g c g 一次性克量级以上的制各。对分离纯化后的产品e c g 及e g c g 采用紫外光谱( u v ) 、 红外光谱( i r ) 、液相色谱一质谱联用( l c m s ) 及核磁共振( h n m r ) 四谱分析技术鉴定，验 证了其化学结构。 本文初步探讨得出，儿茶素单体在s e p h a d e xl h 一2 0 上的分离机理是分子筛作用、 吸附作用及分配作用的共同效应。 关键词：儿茶素 e g c ge c gg c g 葡聚糖凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 s t u d i e so nt h e s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fh i g hc o n t e n tt e a c a t e e h i n se g c ga n de c g a b s t r a c t t e ac a t e c h i n sa r et h ei m p o r t a n ti n g r e d i e n t si ng r e e nt e a s d u et ot h e i rw i d e s p r e a d b i o l o g i c a la c t i v i t y , a n t i o x i d a n ta b i l i t ya n d t h ec a p a b i l i t yt or e m o v ef r e er a d i c a l s ，m o r ea n d m o r ei m p o r t a n c ea r ea t t a c h e dt ot h e m c u r r e n t l yt h e r ea r em a i n e i g h tk i n d so f c a t e c h i n s m o n o m e r st h a th a v eb e e ni d e n t i f i e da n dt h e yc a nb ed i v i d e di n t ot w o g r o u p s ，o n ei se s t e r t y p ea n dt h eo t h e ri sn o n - e s t e rt y p e t h em o s tu s e f u la n dd e m a n d e dm o n o m e r sa r et w o e s t e rt y p em o n o m e r s - - e g c ga n de c g r a wt pw a se m p l o y e da sm a t e r i a la n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tm e t h o dw a su s e dt o s y s t e m a t i c a l l ys t u d yt h ep r e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so fe g c g a n de c g b y g e lc h r o m a t o g r a p h y t o o ks e p h a d e xl h - 2 0a ss t u f f i n gw i t ht h eh e i g h to f5 0c ma n d e t h a n o la se l u t i o na g e n tw i t ht h ee l u t i o ns p e e do f0 7 5 m l m i ni nt h ep r e s e p a r a t i o n p r o c e s s ， w ee f f e c t i v e l ys e p a r a t e de g c g ( i n c l u d i n gg c g ) a n de c g f o re c gt h ee l u t i o nr a t ew a s 9 7 6 4 a n dt h er a t eo fp u r i t yw a s9 7 6 2 ，a b s t r a c tr a t ew a s8 5 6 7 ；f o re g c gt h e e l u t i o nr a t i ow a s9 8 4 5 a n dt h er a t eo f p u r i t yw a s 8 8 6 6 1 1 1 ee g c g ( i n c l u d i n gg c g 、 f r a c t i o no b t a i n e di nt h ep r e s e p a r a t i o np r o c e s sw a s p r o p e r l ye n r i c h e da n de m p l o y e da sr a w s t u f fi np u r i f i c a t i o np r o c e s s a f t e r p u r i f i c a t i o np r o c e s s a l s oc a r r i e do u t b ys e p h a d e xl h - 2 0 w i t ht h eh e i g h to f5 0 c mu n d e rt h ec o n d i t i o no f4 0 e t h a n o la se l u t i o na g e n tw i t ht h e e l u t i o n s p e e d o f 0 6 0 m l m i n ，h i g h p u r i t y e g c gm o n o m e r sw e r e o b t a i n e d ( t h e c h r o m a t o g r a mp u r i t yo fo b t a i n e de g c g m o n o m e r sw a sa b o v e9 9 、a n dt h ee l u t i o nr a t e w a sa b o v e9 8 a b s t r a c tr a t ew a s8 5 1 3l ，c o n t i n u o u s o p e r a t i o n so fp r e s e p a r a t i o np r o c e s s a n dp u r i f i c a t i o np r o c e s sw e r ea c h i e v e db yt h i sm e t h o da n di tw a se a s i l ym a n i p u l a t e d b e s i d e s ，i tn e e d e dl o wc o s t ，p r o d u c e dn op o i s o n sa n dh a dh i g he x t r a c t i o nr o t ea n dp u r i t y m o r e o v e r , t h ep r e p a r a t i o na c h i e v e dg r a mm a g n i t u d ef o ro n c et i m e t h e i rm o l e c u l a r s t r u c t u r ew e r ei d e n t i f i e do rv e r f i e db yu v ，i r ，l c - m s ，h - n m ri n s t r u m e n t a lt e c h n i q u e s i na d d i t i o n ，e l e m e n t a r yc o n c l u s i o nf o rt h em e c h a n i s mo ft h es e p a r a t i o np r o c e s so f c a t e c h i n sw i t hs e p h a d e xl h - 2 0w a so b t a i n e dt h a tt h es e p a r a t i o nw a sa c h i e v e db yt h e c o m b i n e da c t i o no f m o l e c u l a rf i l t e re f f e c t s ，a d s o r p t i o ne f f e c t sa n dd i s t r i b u t i o n a le f f e c t s k e y w o r d s ：t e ac a t e c h i a se g c ge c gg c g s e p h a d e x l h - 2 0 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指婚下进行的研究工作及取得的研究成裂。据 我所知，除了文中特剐加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获褥焱g 王冀纛堂藏其他教蠢机构的学位或证书面使髑过的榜 料。与我- - n ：i ：作的同志对本研究所做的任何贡献均已襁论文中作了明确的说明并寝示谢 意。 学位论文作赣签字i * 吨签字b 期如海二月墨 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者宠全了解金自l 薹骥友堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部f 1 或机构送交论文的复印 牛和磁盘。允许论文被套润或借阅。本人授粳金 世点业去堂可以将学位论文的全部域部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、 编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者撼名：芗、叱导师签名： 签字日期：函坼年占月f 日 墨稆纽 麓字日翌如中年古月口日 碱；争p 哪 鳃争p “黼 致落 我的硕士毕业论文熊够顺利完成，首先凄感谢导娈荽姜绍避教授，从 论文躲避怒、 舞究方寨设计、论文 舞究进震裂论文撰鸶的每个琢节，譬 雾季都倾注了大麓戆，玉巍。导鎏器严谨憋治学态度、开放豹学术思想秘求实 麓工俸俸风也使我受燕霉摹浅，阏露程我也要感谢灌露军教授对我论文期 阆静关，翻指簿。 本试验是在合月巴王监大学生物与食晶工程学院实验室完成憋，论文 躲避褥过稷褥到了实验窒缀多豢爨潋及毫鼙究生粕静热心帮助秘支持，在 此一荠表示我赢挚的谢意。 最话我要慧谢我的家人在我求学生涯中给予酶默默支持和毽解 第一章绪论 茶叶是倍受人类喜爱的保健饮料之一，与人们的生活息息相关，其中存在 多种有效活性成分，如具有保健、药效功能的茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ) 和咖 啡因( c a f f e i n e ) 等。自从1 9 2 9 年日本人首次从茶叶中提取分离出儿茶素以来， 许多学者对儿茶素进行了深入的研究。研究表明茶多酚的主体化合物儿茶素既 是理想的天然抗氧化剂，又是一类极有价值的天然药物原料，它具有抗肿瘤、 降血压、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等多种独特功效”_ 5 1 。 近十年来，世界发达国家积极推进儿茶素应用产品的开发，以其作为天然抗氧 化剂和自由基清除剂，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域”， 尤其是f d a 确认儿茶素具有药效功能后，国际市场对其需求量日增。研究各利， 儿茶素的药理活性和协同作用以及其在体内的代谢情况，开发儿茶素类新药， 均需大量高纯度的各类儿茶素单体。我国是产茶大国，茶叶资源十分丰富，由 于对茶树修剪叶及茶叶生产过程中产生的大量茶末，甚至滞销的低档茶，全部 当作废料处理，造成茶叶资源的严重浪费。因此，深入开展茶叶的深加工，研 究茶叶儿茶素单体的提取纯化方法和生产工艺具有重要的现实意义。 1 1 儿茶素的组成和结构 茶叶中的化学成分已分离和鉴定的有近5 0 0 种，分为1 2 类，主要的有茶色 素、咖啡因和茶多酚。其中茶多酚( t e a p o l y p h e n o l s ，t p ) ，又名茶单宁或茶鞣 质，是一类存在于茶叶中的多羟基酚类化合物的简称，其在茶叶中的含量最高， 约占干茶重的2 0 一5 0 ，茶多酚的结构通式见图1 - 1 。茶多酚主要包括儿茶素类 ( 黄烷醇) 类、黄酮醇类、花青素类、花白素类和酚酸及缩酚酸类。3 ，这些化合 物都具有2 一苯基苯并吡喃的基本结构，故统称为类黄酮物质。其中儿茶素类是 茶多酚的主体，约占茶多酚总最的8 0 0 左右，属于黄烷醇类化合物。儿茶素的基 本结构见图卜2 。 d r 3 圈卜1 茶多酚结构通式 f i g u r e1 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so ft e a p o l y p h e n o l s 0 h e c ： r = r 2 - - - - h e g c ： r 1 = o h ，r 2 = h e c g ： r 1 _ h ，r 2 = 2 田。g ：r 1 2 0 h 警 麟：r | 2 c h 警 恨洲 c = o o h 峨囟“ c = o 图卜2 儿茶素结构通式 f i g u r e1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f t e a - c a t e e h i n s 理论上分析儿茶素应有十六种同系物及其同分异构体。1 ，但在新鲜茶叶中仅 鉴定出七种，而在成品茶叶中也只鉴定出十种，这是加工过程产生化学变化的 结果。不同儿茶素因其结构的不同而导致它们的理化性质及其某些药理功效也 各异“1 。到目前为止研究较多的儿茶素单体主要有8 种，它们分别是： o 、l 一儿茶素( d 、l _ c ) ， l 一表儿茶素( l _ e c ) ， l 一表没食子儿茶素( l e g c ) ， d 、l 一没食子儿茶素( d 、l g c ) ， l 一表儿茶素没食子酸酯( l _ e c g ) ， l 一表没食子儿茶素没食子酸酯( l e g c g ) ， l 一没食子儿茶素酸酯( 卜g c g ) ， l 一儿茶素酸酯( l c g ) 其结构式见图1 - 3 0 1 。 由于c g 、e c g 、g c g 、和e g c g 中发生了儿茶素与没食子酸的酯化作用，故 称其为酯型儿茶素：而没有发生酯化作用的c 、e c 、g c 、e g c 称为非酯型儿茶素， 各儿茶素的结构较为相似，有些为同分异构体，结构的主要区别在于羟基取代 的数量和位置不同。各种单体的含量也因茶叶品质不同各异，一般来说e g c g 和 e c g 的含量较大，也是研究的重点。 左1 旋l - 一e 裹c ( j e e 寨巢锰疑左旋一裹儿荼索d 厦式) h 0 2l c ( c a t e c h l n ) 左旋一儿茶素c 匣式) 0 h 3 d - c ( = l t l c h i a ) 右旋一儿荼素c 魇式) 左4 旋l - 一e 表g c 没( e 告p i 子5 l l 儿。荼c a 索t e c a h 匝i 式a ) )5 篆箍j 攫警莩， 纂豢磕式)右5 旋d - 一没g c 警享儿l o 茶c a 素t e c ( h 反i 式n ) ) h 0 左9 旋l - 一e 裴疑翟擎咒桨巢淀窑；稚碥樯妥)左摇二襄薤譬鞘璨檗莲警擎酷l a c 反t e 式) 图卜3 绿茶中八种主要儿茶素单体的结构 f ig u r e1 3s t r u c t u r e so fe i g h tm a j o rc a t e c h i n sf r o mg r e e nt e a 4 h h h 洲妒 噼 明白二 h-t月 0 v 刺洲 6 蔷道 旺。 焱掣j 火 q 。 焱。 几 一 咄 1 2 儿茶素的生物活性 茶儿茶素具有广泛的生物活性，其抗氧化性及清除自由基的能力在治疗多 种疾病的试验性研究中起了重要作用。近年来国内外诸多研究证明，儿茶素具 有抗肿瘤。1 ”、抗突变、降血压、降糖、降血脂“、抗动脉粥样硬化、抗菌消炎、 抗病毒、降低龋菌的蚀斑、保护肝细胞“、治疗病风“、预防癫痫“、参与抗 过敏反应“、对抗辐射作用“7 1 及抑制h i v 逆转录酶“8 1 等多种功效。 1 2 i 儿茶素的抗氧化性 儿茶素结构中有多个酚羟基，易被氧化成醌类而提供h + ，有显著的抗氧化作 用“”2 。研究表明，不同儿茶素按等摩尔浓度的抗氧化活性秩序是。“： l - e g c g l e c g l e g c l e c ；按等重量的抗氧化活性秩序是：l - e g c l e c l e c g l e g c g 。另有体外研究表明。2 “，茶多酚及l - e g c g 对o 。一的清除能力强于v 。和 v 。，并在一定范围内随浓度增加而加强，且与v c 及有机酸等具有协同作用。 1 2 2 儿茶素清除自由基作用机理 儿茶素类的抗氧化作用多指其清除自由基的作用。自由基是指含有未成对 电子的原子、原子团或分子。生物体内自由基的生成途径主要有三条：( 1 ) 分 子氧的单电子还原途径，这一过程产生0 2 ，。0 2 ，0 h 和h ：o 。；( 2 ) 酶促催化产生自 由基：( 3 ) 某些生物物质的自动氧化生成自由基。“。生物体内自由基处于生物 生成体系与生物防护体系的平衡之中。一旦平衡被破坏，就会危害机体，产生 疾病，所以需要外源的抗氧化剂清除自由基，保护机体正常运转。 由儿茶素基本结构可知它们都含有两个以上互为邻位的羟基，较易氧化而 提供质子h + ，具有酚类抗氧化剂的通性。研究结果表明儿茶素的抗氧化机理是由 于其b 环上的邻位羟基或连位酚羟基易发生氧化生成成邻醌类物质。2 ”，而提 供的h + 与自由基结合，可使之还原为惰性化合物或较稳定的自由基，从而可直 接清除自由基，避免机体氧化损伤“”1 。 1 。3 ，k 萘豢麴应翅 茶多黪磷究发鼹始予8 0 年代，进入年代彤成离潮积热门，修为黪赣 型熬天然攘鳜纯赛 l ，筏强予1 9 9 1 年姆荚列入食鑫瓣家标溱 4 s 】。幸箬毙茶多瓣主 体残分熬j l 茶素瘦建磅突，嚣蘩融缀_ 开涉及翔健妆翳、夔舞、糖爨纯学麓、傈 稳赫簿各个领域。尤獒是e g c g 擎俸，蕊在已寝弼为 孛潜程躯抗癔药物在中美 等国被深灭磷究。”。，l 茶豢帮效袋分麴撬纯鞠应麓磷究仍照予方兴来艾阶段。 1 3 。1 医蓊保健律鹰 g c g 麴生物警效应，主溪宥抗突变、抗萎孛瘪澎袋、消炎等 乍霜洳。磅蠢表 嚼，绿茶戏其组分儿茶索对脾瘤的形成的各个阶段郝有预防葶b 搏剿捧用”“。 e g c g 缝秘涮惫牲擞糠鑫巍瘸( a m l ) 缀溅熬攮藏，可艇怒逶；窭瓣刳綦些壤熬嚣子瑟 起馋怒5 “。凡耱j k 茶豢摹抟掘e g c g 、e c g 秘e g c 黪诱发漤巴缨照牲邀彀瘸m o l t4 r 纲施瓣撼亡8 “。努黔，b 蕊豢憩弓| 怒一l o s 、e m y c 、c - r a f 帮e h - r a s 等多稀 癌蕊溺表达懿欢变脚3 ，馥癸，l 蓉蠢述髓攘潮蛋鑫酪熬遗瞧。 憨练j l 荼素静主要蓊遴功能主要有8 ”1 ：( 1 ) 消除蠢由藻，调憋弓 发物的 代 囊 过程：( 2 捧秘岛氨酸嚣莞羧酶( o d c ) 滔往和勰甄讫酶滔链：( 3 ) 瓣翻燕基 因和d n a 的菇价结合；( 4 ) 抑制驻消佬过程；( 5 ) 抑制细胞增穗过猩；( 6 ) 提 鑫i 褥髓甘款一s 一转移酶、避戴识骜、n a p p ( h ) 、冁还琢酶( 毽r ) ，超歧氯纯酶( s o d ) 等有懿酶的濑性。 1 3 2 食赫工照上翡液爝 ，l 茶素在食菇领域的寝翊主要崧双下凡方面： 许多食物均爨有较高的脂肪禽筮，如色摭油、猪油等备种食用油；禽脊摄 入人髂内魏许多藏瓣虢食瀛，魏瓷禽鱼褒及菠制菇秘高l 罄糕嶷。这魍离g 簿食晶 在光、漫、激环蟪中摄易辍化变威，会成抗畿化剂二t 基羟攥苯( b h t ) 釉丁羟 綦裁露醚( b h a ) 在食熬中豹黢蘧，蠖褥遮黧含l 冀黪食熬氧纯酸效遂菠大大下辩， 遐阉孵也繁采了一令安垒瞧黪逮鼷。男耪上枣骢台成食品捷氧化剡维生豢e 东食瀑安全缝上襞显羧善，毽宙予它燕一类l 鏊溶髅镁二食兹，蠢拳枣甏中a 乎不滚， 逡戏巍瘸菠麓上戆麓羧蛙。j l 茶素穆为谯楚懿撬氧纯裁，其虢氧纯穗强予b h t 、 8 h a 、v 。v 。，出于，l 茶素楚多羟蘩的强裰往纯舍耪，它易溶予7 k 、酸蒋极健溶 液中，使麓越来黎露方便。 6 勇据磺究发嚣，b 茶素箕鸯缀强豹抗菌、撩菌淫髓，露予莛然雾中1 9 类群鹣 近酉种细菌均有优异的抗菌活性，驻示出抗菌的广谱性，其抗菌活性比黄芩素 强，抗菌广谱性也磁黄芩素广潮。 儿茶素述对a 一淀粉酶，蔗糖酶均有良好的抑制能力，拶为理想的保鲜剡， 可以减缓采摘后的水果、蔬菜、饮料、畜牧、水产晶深加工等的腐败；且儿茶 素具有较强鼹还原性，霹防止上述锻索氧化褪色，僳持其色泽鳞憨稳定娜3 。 同时儿茶索还可有效去除肉类、粮、油作物及其制品的异味，如大豆制品 蕊豆艟妹，小麦异昧，添熬，b 茶素霹起蕊蘩去臭终耀潍1 。 1 3 3 日化产晶中的应用 儿茶素程日化产品上可作特殊功能的保质剂，护肤剂和香烟解毒剂。 在霉瀑下， 磊浓溲下j b 茶素其有缀强懿拣氧证、湾骧蠡囱基、基萤、去髯 味等功能，因此添加少量的儿茶素即可防止化妆品的变质。儿茶素在化妆晶中 静俸爝狡捂翔下：( 1 ) 抗衰老作焉； 9 8 ) ，( 购于美国s i g m a 公司) ； 甲醇，乙酸乙脂，乙腈，( 色谱纯) 上海振兴化工一厂生产。 2 1 2 主要设备 w a t e r s 515 2 4 8 7 ，一2 9 9 6 高效液相色谱仪( 包括体积2 0 微升进样器温控系 统) ，美国w a t e r s 公司：超声波脱气器，滤膜过滤器等，w s c 5 0 色谱工作站( 大 连化物所) 2 z 试验方法 l 、准确称取茶多酚o 1 9 ，重蒸水溶解于l o o m l 容量瓶中，经微孔滤膜( 巾0 4 5 pm ) 过滤 睾表褥测缮鑫。 2 、高效液相色谱条件：色谱分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) ；检测器：2 4 8 7 双波长紫努检测器；检测波长：x = 2 8 01 3 m ；流动樯：重蒸求乙虢乙酸乙 酯：8 6 1 2 2 ( 体积比) ；流速：1 o m l m i n ：a u f s = 2 0 0 0 。 2 3 结果与分析 2 3 1 定性测定 离效液楣色谱主要是采用保豫值比较法定性，即当未知峰的保留值( t 。) 与 菜一己知标准物完全相同时，则未知峰可能与此融知标准物是同一物质。 在2 2 所述魏谱条转下，分别注入l o hl 各玉辩l 茶素标壤溶渡及蜘蹲因 标准品溶液，并测定各组分的保留时间，然后注入它们的混合溶液，得到五种 j l 茶素及秘蹲因瓣撂攀惫港圈( 藏匿2 - 1 ) ，缳蘩瓣阉冕裘2 - 1 。采爰稳麓色落 袈件测定原料茶多酚中各组分，液相色谱图见图2 2 。 824881 0 21 4 61 b 痢 渡：横坐标表示色谱峰傈窝俊t 一( m i n ) ，缀坐标表示梭测器的储号响应镄( m v ) 鹫2 - i 五秘j k 蒺素器攘瑟与魏礤因混台物熬h p l c 分离圈 f i g 2 - 1h p l cc h r o m a t o g r a m s o f 伽es t a n d a r dc a t e c h i n sa n dc a f 1 6 黼雠 瀚 啪黜 榔霎 猫 b 枷 表2 一l 儿茶素标品、咖啡因混合液h p l c 测定结果 t a b l e2 1d t e t e r m i n a t i o nr e s u l t so fh p l co f f 萱v es t a n d a r de a t e c h i n sa n dc a f 1 c a f2 c3 e c4 e g c g5 g c g6 e c g 图2 2 原料茶多酚( t p ) 的h p l c 分离图 f i g 2 - 2 h p l c c h r o m a t o g r a m s o f t h es a m p l et p 从图2 - 1 看出咖啡因及五种儿茶素单体( c 、e c 、e g c g 、g c g 、e c g ) 分离 效果较好，峰形尖锐，基线平稳，分离度均大于1 5 ，且检测可在2 0 分钟之内 完成，解决了过去一些研究报道中。1 c 与e c 不能很好分离的问题。 2 3 2 定量测定 色谱中常用的定量方法有归一化法、标准曲线法、内标法和标准加入法1 。 按测量参数分，又可将上述四种定量方法分为峰面积法和峰高法。本文采用实 验室较为常用的标准曲线法定量，并以峰面积作为定量参数。 州如 咖 瑚 抛 御伽 卯。 勋 2 3 2 1 椽溱工掺蘸线 标准曲线法也称为外标法或赢接比色法，是h p l c 定嫩分析中比较常用的方 法，也是一耱篱馁、茯遮的绝对定量方法。具体骰法是：雳标稳样品酝成不同 浓度的标准系列，在与预测组分相同的条件下，等体积准确量进样，测量峰的 峰面积，蠲峰面积对样品浓度绘制标准工作曲线，然后利用此该曲线测定待铡 组分的含魅。标凇曲线一般要求网归系数大于0 9 9 本试验将各标准品配制成标凇溶液，精密移取0 5 m l ，混合均匀后得到混合 标榉，剥爝外标滋雩# 出各标准品熟工 乍鳆绫见表2 - 2 。 表2 - 2 儿茶素标鼯、咖啡阁混合液标准品：e 作曲线 t a b l e2 0s t a n d a r dc n r v e so f 鞠秘c h i n sa n do a f 结暴表疆，程给定静浓度范豳肉，线往关系蓬盎手，辆稚因及羞种，l 茶素荤 体( c 、e c 、e g c g 、g c g 、e c g ) 的相关系数均大于0 9 9 。 2 ，3 2 2 方法精密度考察 穗对檬疆编熬r s d 怒耀寒译徐定量分凝结暴耱密爱鹣量度，趋怼嗣一榉晶 多次测定结果的熏复性和再现性的评价，r s d 越接近零，袭明方法精密度越好。 一般要求应在5 骧疼。为考察本文建立懿色谱定囊方法懿精确觳与稳定镶，对 各标准品煎复进行5 次h p l c 的测定，以峰面积作为考察参数。结果见表2 - 3 。 簌2 3 方法鬻塞凄 f a b l e2 - 3d e t e r m i n a t i o nr e s u l t so ft h ep r e c i s i o no fc a t e c h i n s 结荣表甓该方潼精密凄较好，套缀分熬摇对橱臻糠差在 2 l 婚一3 0 9 之鲻。 2 。3 。2 。3 最小梭溺黻溺霆 最小检测限又称敏感魔，定义为响应值为2 倍噪声所需要的样品量，即是 蠢在曝声鸷疑上蛰熊产空霹蒺囊靛蘩号对，雀单谴髂稷或革爱辩灏露霞囱捻溅 器邀入的样晶量。w 辨别的信号一般规定受大于或簿于2 倍噪声。最小检测限 越小，该稔潞方法静敏感壤越高。 本试验以信噪比( s n ) 等于2 测得c 毪f 、c 、尊e 、e g c g 、g c 6 、e c g 驹最 小稔测限为分跗为7 5 n g 、1 8 0n g 、1 7 8 n g 、2 4 2n g 、2 4 9 n g 、2 8 7n g 。 2 ；3 。2 ，4 霞牧率实验 回收察是用来评价色谱定量分析结果准确度的指标，其方法媲将被测样品 分为两费，其中一份攘天矗黯量氆辩霰溅短分，然后餍同样静方法分橇速褥镑 样潞，得到鞭份结果；a ( 加入欲测组分榉赧豹测定结果) ，m7 ( 米加入欲测组 分样品的测定结采) 。色谱璃论认为理论缡祭应为b ( m 哟，雨毡为实测值， 则隧故率。定义为；实测毯与理论值豹拢值。回收察越接邋t 0 0 ，定量分析结 果的准确就越高。 试验巾精密稼取茶多酚榉鑫5 0 m g ，重蒸承落髂嚣定容至5 0 m l 容量甄中搀为 底液，分别移取该底液l m l 予5 个l o m l 容髓瓶中。分别穆教e g c g ( 0 5m g m 1 ) 蚕准港滚稻e c g ( 0 2 窭g 内i ) 标箍溶滚各0 5 蕊 、t 。0 m l 、t 5 鞴i 、2 ，0 m l 、 1 9 2 5m l 于前述l om l 容量瓶中，重蒸水定容至刻度。以e g c g 和e c g 为指标进行 h p i c 回收率实验，重复测定5 次，结果见表2 4 。 表2 4 方法回收率 注：a ：n 量值b ：理论值；c ：回收率 n o r ：a ：t e s t e dv a l u e ；b ：a c t u a lv a l u e ；c ：r e c o v e r yr a t e 从表2 - 4 看出，各该h p l c 方法对儿茶素中e g c g 和e c g 的回收率在 9 5 0 一1 0 4 3 范围内，效果良好。 2 3 2 5 定量测定结果 采用上述h p l c 检测方法，配置一定浓度的标品，测定得到原料t p 中各 成分质量百分含量，见表2 5 。 表2 - 5 原料茶多酚中儿茶索含量 t a b l e2 5c o n t e n t so fc a t e c h i n si nm a t e r i a l ( t p ) 2 4 夺结 建立了茶叶中咖啡因及c 、e c 、e g c g 、g g c 、e c g 几种儿茶素单体的等梯度 流袋h p l c 色谱分离方法。 梭测条件：色谱分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) ： 检测器：2 4 8 7 双波长紫外检溯器：检测波长：x = 2 8 0n m ： 流动捆：重蒸水乙膪乙酸硝= 8 6 1 2 2 ( 体积比) ： 流速：1 o m l m i n ： a u f s = 2 0 0 0 。 检测结果表明：咖啡因、c 、e c 、e g c g 、g g c 、e c g 的分离度效果满意，器单 俸标准曲线戮霆系数r o 。9 9 ，方法穗密度及方法国浚攀均较麓，定量结栗准确可 靠，是一种简便、稳定、可靠的儿茶素检测方法。 2 1 第三章j 乙茶素单钵预分离条件羲暑究 儿茶索单体的提取制柱，一般是利用粗制茶多酚( t p ) 为原料，经柱层析 轫步分离成为翡型，l 茶素( e g c g 、g c g 、e c g 、c g ) 黟j 醮黧j l 茶素( e 、e c 、g c 、 e g c ) 两部分后，弭采用半制备h p l c 仪器方法进行单体的分离。而初分离方法 中溪采羁麴柱层耩填辩、洗麓裁、洗魏鼓集滚豹娃理方法等都会瓣磊续纂薅麴 分离纯化产l 重要影响。目前报邋的儿茶索初分离方法如s a i j or y o y s u “、照 边文久等9 “、王漾掰等、藏淘雨等“”部是班葡聚耱凝黢s e p h a d e xl h 一2 0 作 为桂层析介质，在沈脱剂种类方面稍有差鼯，它们均主要存在以下几方面问题： ( 1 ) 分离效率不离，经裁聚糖凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 层丰斤后，一般只能将原料 茶多酚中的儿茶素分为酯型和非酝型儿茶索两类，丽占主要含量的e g c g 及e c g 单体并未分离，e g c 6 的同分异构体g c g 觅是无法分离，需进一步纯化，对后续 技术要求较高；( 2 ) 多采蠲撵度浚残方式，涝洗灏易产生气遣，操 乍条 警不易 控制，结聚重现。陇羞：( 3 ) 洗脱剂种类繁多，分离效果欠佳，研究尚不臻统。 文黻援遵8 6 。”主要蹩采弱涎酮东溶液终燕洗魏裁，也毒少藿掇邀袋羟l 乙黪或者 越其它多元混合溶剂作为洗脱剂的“，存在洗脱周期长或溶剂毒性等缺点，并 虽来冕较为系统豹疆究：( 4 ) 评价指标不统一，绞乏逶翻往。王浚耨等采蘑 每个收集瓶中所台的各儿茶素的色谱检测峰面积除以收集到的各瓶中该儿茶素 的蜂面积憨和褥到黯百分院作为魄较指标，戚向阳等船铂用收集液静紫夕 吸竞 发作为比较，缺乏一定的囊观性牟可比性。 本章应用正交试验方法，系统研究了实现粗制茶多酚中儿茶索单体预分离 的冬季申条件因素，以期获褥麓单、易行、笼毒的e g c g ( 食有g c g ) 与e c g 单体 的次性分离条件，并建立一套科学、直观的评价系统。 3 1 层拆介质豹确定 3 11 方法比较 柱层析的关键是柱填料及洗脱粼的选择。目前，国内步卜掇道的用于预分离 制餐儿茶綮单体的柱填料主要有三大类；( 1 ) 吸附型柱：纤维素，硅胶，三氧 化= 铝，聚酰胺等；( 2 ) 离子交换柱：x a o - 2 ：( 3 ) 凝胶柱：t o y o p e a r lh w - 4 0 及s e p h a d e xh 一2 0 。文歙报道“”使臻吸附型及离子交换型糖月罄分离j l 蕊素单 体效莱欠佳，显步骤颓琰，产品蘸痰不离。t 0 z a w a t 4 6 爱t o y o p e a r l # 弘4 防震 析柱分离儿茶索单体。以丙酮为洗脱剂按浓度梯度进行洗脱，淋洗时易出现气 泡，澎蛹分离效采，并且操作不荔控翻，使瀚普及牵不高。 大量试验证明藏聚糖凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 在分离儿茶索方面有着十分明显 的优势，旱在1 9 6 9 年d j m i l l i n 等应用s e p h a d e xl 一2 0 柱层祈分离提绒茶 鲜埘“中五秘j l 茶素“3 。近年来国内也在这方蹶也进行了较为深入约研究：戚向阳 ”使用s e p h a d e xl h 一2 0 分离得到酯型儿茶素；王洪新，戴军等。7 也使用s e p h a d e x l h 一2 0 及半剁冬色谱褥到j l 茶素单锩。数凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 可馋为分离j l 茶 索单体的优良层析介质。但凝胶层析至今仍未获得较好的单体分离效果，麒主 要薮因是j l 装素魏歹l 耪攀钵熬穗对分子量魄较接遥，蘑莓聚糖凝骏分子薅俸蘧 主要是根据相对分予质量大小来分离的，用葡聚糖凝胶层析可大致把酯型儿茶 素霸饕酪登，k 茶素分离开，舔占主蘩含量豹e g c g 及e c g 荸钵并未分离。 3 1 2 蘧聚糖凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 的结构及性质 s e p h a d e xl h - 2 0 是由葡聚糖g 一2 5 经羟基丙化加工而成，属分子筛凝胶o “ “，梵英适蠲予天然产物在蠢援溶割中豹缝纯。它在分离j l 茶素单髂方嚣其巍较 多优势：( 1 ) 分离范围是1 0 0 4 0 0 0 ，儿茶素各单体分子量均在此范围，可用该 凝羧进褥有数分离；( 2 ) 该凝获藏瓣荚釜亲求及亲蠹双重瞧滋，茏英适弱予天 然产物在有机溶剂中的纯化，同时通用于分子类别非常相似的物质的分离如同 分异构体懿分离；( 3 ) 蓝类介质静分离效聚优良，受载量可遮3 0 0 m g 祥晶m l 凝 胶：( 4 ) 该凝胶层析条件温和，具有生物大分子的相容性，不影响天然产物活 性。凝胶材料本身不带电荷，不会与被分离物质相嚣作用，因而溶质回收率接 近l o o ：( 5 ) 该凝胶分离效果好，震现性强，完成次分离霈时较短。每个样 品洗脱后柱翁再生，可反复使用，寿命长。 练上本磺究选搦s e p h a d e xl h 一2 0 终为艨辑分质。 3 2 试验材料与设备 3 2 1 材料 主要试验用材料见表3 一l ，3 2 2 3 表3 - 1 主要试验原料 t a b l e3 - 1m a i nm a t e r i a l s 乙醇 丙酮 甲醇 甲醇 乙腈 乙腈 二次重蒸水 上海振兴化工一厂分析纯 中国医药集团上海化学试剂公司分析纯 上海振兴化工一厂色谱纯 江苏淮阴汉邦公司色谱纯 中国医药集团上海化学试剂公司色谱纯 江苏国达公司色谱纯 试验室制备 3 2 2 主要设备 主要设备见表3 3 。 表3 - 3 主要仪器设备 ! 垒垒! ! 曼：兰坐璺! 翌! g 翌! p 巴! 坠塑 名称产地 高效液相色谱仪( h p l c ) 色谱柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 a m ) 2 4 8 7 双波长紫外检测器 层析柱 d h la 电脑恒流泵 b s z - 1 0 0 自动部分收集器， t h - 1 0 0 0 a 梯度混合器 旋转蒸发仪 超声波脱气仪 f d l 型冷冻干燥器 w a t e r s5 1 5 系列 w a t e r s w a t e r s 上海华美宝试验仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海精科实业有限公司 上海沪西分析仪器厂 上海申胜生物技术有限公司 江苏淮阴汉邦 北京博医康技术公司 3 2 3 儿茶素单体预分离试验装置 儿茶素单体预分离试验装置图见图3 - 3 图3 - 1儿茶素单体预分离试验装置图 3 3 试验方法 3 3 1 试验步骤 1 、凝胶柱的预处理：称取适量的干凝胶，用洗脱剂充分溶胀( 可用加热法溶 胀缩短溶胀时间) ； 2 、分离柱：将溶胀好的凝胶缓慢倒入层析柱，使其均匀沉降。待沉降到所需高 度后，继续用3 5 倍柱床体积的洗脱液淋洗以平衡柱子： 3 、样品：称取适量样品溶于少量洗脱剂中充分溶解，超声排气后，用滴管缓慢 将其加入柱内，待样品完全渗入凝胶后接上自动部分收集器开始收集； 4 、收集洗脱液：设定适当的恒流泵流速和自动部分收集器的收集时间； 5 、收集液的检测； 6 、合并含e c g 儿茶素单体的洗脱液，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得成品。 7 、合并含e g c g ( g c g ) 儿茶素单体的洗脱液，旋转蒸发浓缩后待纯化。 3 3 2h p l c 检测条件 仪器：w a t e r s5 1 5 系列高效液相色谱仪器 分析柱：s y m m e t r yc 1 8 ( 5 u m * 1 5 c m ) 检测器：2 4 8 7 双波长紫外检测器 检测波长： = 2 8 01 m 流动相：重蒸水乙腈乙酸乙酯= 8 6 1 2 2 ( 体积比) 流速：1 o m l m i n a u f s = 2 0 0 0 3 3 3 正交试验设计 本试验目的在于选择适宜预分离儿茶索单体的试验条件，由于影响因素多， 欲从较少的试验中得到最优的试验条件，故采用正交试验设计方法。 3 3 3 1 试验目的及考察指标 1 试验目的： 使用安全无毒，廉价的原料，采用简单易行，成本低廉的操作，一次分离 儿茶素单体e c g 及e g c g 。由于e g c g 和g c g 为同分异构体，难以一次将其分开， 嚣戴预分离玲段将泼袋戆e g c g 积g c g 两个零体夔瀑合滚终为一令筑分，德爱续 纯化。 2 ，试猃考察撵标：( 为考察嚣条锌藩努离洼黢辩窝躬澎璃，均澄蘸2 0 0 0 r a l 浚虢 液为分析对毅) ( 1 ) 考察鑫单钵戆分离度： 试验中，采用自动部分收集器收集洗脱液，每试锗收集的洗脱液体积约l o m l 采用2 + 2 中建立的离效液搬色谱定性及定量方法对每试管中的洗脱液成分避行 定憔、定量测定。将每试管中测得的儿茶素e c g 质徽之和作为洗脱出的e c g 总 质量，而将与其它儿茶素及咖啡因完全分离，h p l c 检测图上只含有e c g 吸收峰 的洗脱液部分中e c 6 的质量作为洗脱液中e c g 单体质量。隔理，可以测褥浇脱 出的e g c g 及g c g 总质量和单体质量，在这里由于e g c g 及g c g 较难分离，先将 它 l 作为一个整体考察，印谈为h p l c 检测潮上只食有e g c g 帮g c g 吸浚蜂静洗 脱液就是e g c g 单体及g c g 单体部分。各儿茶索单体质量与该儿茶索总质量的百 分比为分离鹰，势离发越接送予1 0 0 ，表臻单薅蒜效采越搿。 a