医学微生物学实验指导.doc

高等医学院校实验教材医学微生物与免疫学实验指导供临床医学、影像、护理、中医等专业使用 三峡大学医学院病原生物与免疫学教研室二00五年六月高等医学院校实验教材医学微生物与免疫学实验指导主 编 韩 莉副主编 张昌菊 宋利琼编 者 （以姓氏笔画为序）王 磊 朱 平 刘 嘉 刘 英 宋利琼 吴红艳 杨建林 周永芹 张 颖 张昌菊 韩 莉三峡大学医学院生物病原部2005年6月29日前 言本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。为上好实验课，要求同学课前做好预习，明确实验任务、目的、原理、方法及操作中的注意事项等，避免和减少发生错误，实验过程中必须持严肃认真的态度，对实验结果必须进行仔细地观察和认真地记录，然后进行科学分析，得出恰当结论，独立认真完成实验报告，书写实验报告要字迹清楚，语言简练，表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。 编者 2005年6月29日内 容 简 介第一篇 医学微生物学医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分，我们将医学微生物学实验课内容分为六个单元，改变以往单一的实验方式，在综合性实验的基础上开设设计性实验，学生能比较系统地了解常用微生物学实验的原理、方法、结果分析、注意事项及用途，可以帮助学生理解和巩固所学的理论知识，培养学生的操作技能以及观察问题，分析、解决问题的能力、严谨的科学态度，同时实验与病案讨论结合，学生能将理论知识与临床实践有机联系，为学习其它基础医学，临床医学及预防医学奠定基础，从而提高学生的综合素质。第二篇 医学免疫学实践教学是课程建设的重要环节，培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容，将免疫学的16学时实验内容分为两大部分，第一部分为综合性实验，包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测；常见体液免疫检测指标的设计，使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术，能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测，并对检测结果进行合理的临床解释和分析。为了学生既能适应一般临床与科研工作，又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验：市场有某一生物制剂有免疫增强作用，请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计，掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用（ELISA检测细胞因子）、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。目 录第一篇 医学微生物学实验室规则6实验一 常见细菌形态学检查方法（综合性实验）7实验二 细菌的分离培养法与消毒灭菌（综合性实验）15实验三 化脓性球菌的分离鉴定（设计性实验）30实验四 肠道杆菌的分离鉴定（设计性实验）34实验五 厌氧菌、分支杆菌的检查法（综合性实验）43实验六 各种微生物形态、病毒学检查法（综合性实验）49微生物学各论自学提纲 59第二篇 医学免疫学实验一 天然免疫功能的检测（综合性实验）60实验二 常见抗原抗体反应（综合性实验）67实验三 细胞免疫检测I：细胞因子的检测（设计性实验）86实验四 细胞免疫检测II：淋巴细胞分离、计数及活性检测（设计性验）96实验五 细胞免疫检测III：淋巴细胞增殖实验（设计性实验）105综合复习104附录115实 验 室 规 则由于实验对象主要是病原微生物，进入实验室必须严格遵守下列规则： 一、必须穿工作服（白大褂）才能进入实验室，除必要的书籍、文具外，其它杂物不得带入室内，离室时脱下的白大褂折叠好。 二、实验室内不准吸烟、饮食，不准口吸移液管或用嘴湿润铅笔、标签等。实验室要保持肃静和秩序，不得高声谈笑和随处走动。三、实验室中若不慎发生病菌污染桌面、衣物、伤口等意外，请报告指导教师进行适当处理，微生物学实验室意外的紧急处理办法：1皮肤破损：先除去异物，用生理盐水或蒸馏水洗净后，涂2 %红汞或2 %碘酊。2烧伤：局部涂凡士林、5 %鞣酸或2 %苦味酸。3化学药品腐蚀伤：强酸-先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和。强碱-先用大量清水冲洗，再用5 %硼酸溶液洗涤中和。如受伤处为眼部，经上述步骤处理后，用橄榄油或液体石蜡12滴滴眼。4菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器内，并用1：1000高锰酸钾液或3 %双氧水漱口；根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。5菌液污染桌面：将适量2 3 %来苏或0.1 %新洁尔灭倾倒于污染处，浸泡30分钟后抹去。如手上沾有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和清水洗净。 6火警：如发生火警时须沉着、冷静，切勿惊慌，应立即关闭电闸和煤气阀门。如为酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭。 四、请爱护、节约实验材料，若有损坏应报告教师，适当赔偿。 五、沾染过传染材料的吸管、滴管、玻片等不要乱放乱动，须按规定处理，未经许可室内物品不得携出室外。六、实验完毕，及时清理实验室，肥皂、清水洗手；值日生打扫室内卫生，关好水电、煤气、门窗、肥皂、清水洗手后离室。实验一、常见细菌形态学检查方法（综合性实验）【实验内容】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法。二、细菌的基本形态与特殊结构观察。三、细菌动力的观察（悬滴法）。四、显微镜油镜的使用和维护。五、电镜观察细菌的菌毛。【目的要求】一、初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术。二、认识细菌基本形态。三、了解细菌特殊结构及其与医学实践关系。四、初步掌握油镜的使用和维护。五、了解电镜在医学微生物学研究中的应用。【实验原理】一、革兰染色法细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术。由于细菌个体微小，无色半透明，在普通光学显微镜下不易清晰观察，一般需经染色来增加反差，从而有利于对细菌标本的观察。染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料。在一般生理条件下（pH 7.4左右），细菌菌体都带负电荷，故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯胺染料，如美蓝、结晶紫、碱性复红等，它们较易与细菌菌体结合。染色方法可分单染色法和复染色法两大类。前者只用一种染料染色，只能观察细菌的形态和排列，不能显示细菌结构及染色反应性；后者是以两种以上的染料染色，可显示出细菌的特殊结构或染色反应性能，在细菌的鉴别上有一定意义，其中最常用的为革兰染色法。细菌革兰（Gram）染色是最常用的细菌鉴别染色法，首先由Gram创用而得名。细菌染色后不仅可区别其形态和排列方式，还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类；不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌（G+菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌（G-菌）。革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。革兰染色的原理目前存在三种假说：1通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2等电点学说 革兰阳性菌等电点（pI 2 3）比革兰阴性菌（pI 4 5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。3化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。在细菌标本染色前，必须将细菌固定在载玻片上，常用的固定方法为加热法，其目的是杀死细菌，且保持原有形态，并使细菌粘附在载玻片上，不致染色时脱落。二、细菌的基本形态和特殊结构观察细菌形体微小，且为无色半透明，必须经过适当的染色，经显微镜(如图1)放大1000倍才能观察清楚，故须用油镜观察。使用油镜时，要在标本上滴加香柏油，其目的是增加进入透镜的光线，使视野明亮度加强，物象才看的清楚。原理为：透镜的孔径小，进入的光线先通过标本玻片，再通过透镜与油镜头之间的空气，然后进入油镜头。由于玻片与空气折射率不同，光线通过两种折射率不同的介质，就会发生折射（如图2），以至进入油镜头的光线不够强，致使物象不清晰。当油镜头与玻片之间加香柏油后，由于香柏油的折射率（1.515）和玻璃的折射率（1.52）相仿，因此，进入透镜的光线增加了（如图2）。视野明亮度加强，物象也就看得清楚了。目镜物镜转换器物镜标本推进器载物台光圈集光器反光镜镜座标本推进器旋钮细调节轮粗调节轮镜臂图1 普通光学显微镜的结构 玻片透镜香柏油图-2 油镜的原理 细菌的基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌三类。球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列情况又分为双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等；杆菌也有球杆菌、链杆菌、分枝杆菌、棒状杆菌等之分；螺形菌中菌体仅有一个弯曲，呈逗点状者叫弧菌，菌体有23个弯曲，且较僵硬者为螺菌。某些细菌除了有细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质这些基本结构外，还具有其他特殊结构，包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。这些特殊结构有着各自的不同意义。三、细菌动力的观察（悬滴法）许多杆菌、弧菌具有鞭毛，有动力，在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方。一般球菌无鞭毛，没有动力，但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动。 四、电镜观察细菌的菌毛电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子。【实验材料与仪器】一、无菌牙签、革兰染色液（结晶紫染液、碘液、95%酒精、复红染液）、生理盐水、载玻片、冲洗用具等二、普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸三、球菌、杆菌、螺形菌及特殊结构示教片四、葡萄球菌、变形杆菌幼龄（812小时）肉汤培养物、凹玻片、盖玻片、 凡士林等五、电镜H-7500，放大倍数2060万倍，最大分辨能力0.204 nm【实验方法与步骤】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法 1制片： 涂片：取清洁玻片一张，在玻片的中央滴一小滴生理盐水（滴加生理盐水不宜过多）。用无菌牙签挑取牙垢少许，与玻片上的水滴混匀，涂布成一厘米大小的均匀薄膜。 干燥：将涂片放室温中自然干燥，切勿紧靠火焰烘烤，以免标本烤焦，损害菌体结构。 固定：持玻片一端，标本面向上，迅速通过火焰三次（约23秒），以玻片温度达到皮肤能耐受的温度为宜。固定的目的是杀死细菌，使其固定于玻片上，并能增强细菌对染料的通透性。2革兰染色： 初染：将已固定的涂片标本，加结晶紫染液于涂面上染色1 min，然后水洗。 媒染：加革兰氏碘液媒染1 min，水洗。 脱色：滴加95%酒精，频频摇动载玻片，斜持载玻片，使脱下的染液流下，再次滴加酒精脱色，直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止，水洗。 复染：用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min，水洗，自然干燥或吸水纸印干。 3观察结果： 用油镜观察染好后的标本片，记录所见结果，染成紫兰色者为革兰氏阳性菌，染成红色者为革兰氏阴性菌。注意事项1玻片一定要清洁无油。2加生理盐水切莫贪多以免难于干燥，涂片要均匀且薄。3固定标本时切勿过热，以免菌体变形。4要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色的时间，不宜过长或过短，以脱色至涂片为灰色为宜。5水洗时要以细流水徐缓冲洗，否则会将玻片上的标本冲掉。二、细菌的基本形态与特殊结构观察1方法（1）使用显微镜油镜、观察各种球菌、杆菌和螺形菌以及细菌特殊结构的示教片，比较各菌的形态、大小、排列和特殊结构特点。（2）绘图：将观察到的结果画在报告纸上并加以适当的描述。2结果（1）细菌基本形态的观察球菌：见排列方式不同的各种球菌，而且革兰染色性亦不同。杆菌：大肠杆菌为革兰阴性的短杆菌；炭疽杆菌为革兰阳性杆菌，可见菌体粗大，两端平齐，酷似竹节状。弧菌：弧菌为革兰阴性菌，菌体略带弯曲，呈逗点状或括弧形，霍乱弧菌涂片染色可出现“鱼群状”的排列特点。（2）细菌特殊结构观察： 肺炎链球菌（荚膜）：肺炎链球菌为革兰阳性菌，成双排列。在双球菌体外围有一层较厚的透明区域，即为荚膜。 变形杆菌（鞭毛）：变形杆菌为革兰阴性菌，通过鞭毛染色，可见菌体周围有细长弯曲的数根丝状物，即为鞭毛。 破伤风梭菌（芽孢）：破伤风梭菌为革兰阳性菌。经芽胞染色后，可见菌体顶端有一圆形，比菌体宽的结构，即为芽胞。芽胞与菌体相连形似鼓槌状，在细菌中为独有的形态。肉毒梭菌菌体次极端有一椭圆形、比菌体宽的芽胞，与菌体相连，形似网球拍状。三、细菌的动力观察（悬滴法） 图3 细菌的动力观察（悬滴法）制片方法1取凹玻片两张、在凹窝周围涂抹少许凡士林。2各取一接种环的变形杆菌、葡萄球菌幼龄培养物，分别放于两块盖玻片中央。3将凹玻片反转。使凹窝对准盖玻片中心，覆于其上，粘住盖玻片后再反转。以接种环柄轻压盖玻片，使与凹窝边缘粘紧。4先以低倍镜找至悬滴的边缘后，再换用高倍镜观察（因凹玻片较厚，油镜焦距很短，故一般不能用油镜来检查）。5观察时，注意比较变形杆菌和葡萄球菌的运动情况有何不同。 注意事项1观察悬滴标本时，先用低倍镜找到悬滴的边缘，然后将视野移至悬滴中央，将集光器下降，缩小光圈，使亮度减弱，再用高倍镜观察，否则亮度太强，不好观察。2调节螺旋时，切忌过度下旋，以免压碎盖玻片。3用接种环在试管中取材的方法（如图4）：（1）左手拇指、食、中三指持试管底，右手拇、食、中三指握笔式持接种环，并垂直于火焰上烧灼至发红为止。移至火焰旁待冷。 （2）在火焰附近用右小指夹取试管上的棉塞，移动后轻轻拔出，并持于小指与小鱼际之间，不得将棉塞放置桌上或触及任何物品。 （3）将试管口移至火焰上旋转烧灼，灭菌后移至火焰附近，用冷却后的接种环插入试管内取少许生理盐水（若为液体则沾取一环菌液后退出），接种环不可与试管壁接触，以免环上生理盐水碰落。取出后立即将管口在火焰上转动灭菌后塞上棉塞。接种环使用后经烧灼灭菌插入试管架上。图4 接种环在试管中取材的方法四、油镜的使用和保护1光源的采用实验室里通常采用间接阳光，日光灯，或显微镜照灯。使用显微镜照灯时，通常要加一兰色滤光片，以滤过黄色光线。观察染色标本时，要求有较强的光线，故应把光圈开足，把集光器上升至与载物台相平。2镜检要领把载玻片固定于载物台上，利用低倍镜来对准光，并寻找标本范围，旋转回转板，使油镜头对准镜筒。于载玻片上滴一小滴香柏油，眼睛从镜筒侧面看，旋转粗调节器，使镜筒下降浸入镜油并贴近标本，但勿触及玻片。然后将眼睛移至目镜，一面观察，一面把粗调节器作些微转动，待看到模糊物象时，再旋转细调节器至物象清晰为止。3保护方法（1）镜检完毕后，把镜筒升高，用擦镜纸把油镜头上的镜油擦净，如油已干，或透镜模糊不清，可以用擦镜纸沾少量二甲苯擦净，然后再用干的擦镜纸把二甲苯擦去。（2）旋转回转板，使物镜头呈八字形，降低镜筒，把集光器稍微下降，然后把显微镜装入镜箱，锁紧箱门，以防跌出及尘埃侵入。（3）显微镜应放置于干燥的地方，以防止镜头发霉，但也要避免阳光曝晒。（4）酸、碱、酒精、乙醚等物对镜头均有损坏作用，禁用于擦拭镜头。 注意事项1显微镜使用时应小心爱护，不得随意拆卸。2搬动显微镜时，用一手持镜臂，一手托镜座平端。3载物台要放平，以防滴加的香柏油流出玻片。4玻片干后才能加香柏油，滴时要避免气泡形成，香柏油要适量，不宜过多或过少。5调节粗调节器时，动作要轻，侧面观察镜头和玻片的距离，注意使镜头与玻片不相碰。6用擦镜纸擦拭油镜头时，注意手法轻柔，并按同一方向拖拭，防止旋转擦拭，以免损伤贵重的油镜光学系统五、电镜观察细菌的菌毛1将变形杆菌幼龄肉汤培养物制备成一定浓度的悬浮液。2滴于带有支持膜的铜网上，数分钟后吸去多余液体。3滴上染液，负染色12分钟。4吸去多余染液，干燥后即可电镜观察。【思考题】一、据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？为什么制片要完全干燥后，才能用油镜观察？油镜的使用和保护方法注意那些事项？二、细菌的形态检查法的基本程序是什么？细菌经革兰染色后，为什么有的呈紫色，有的呈红色？能否根据细菌在显微镜下的形态来鉴别细菌。三、书写牙垢涂片革兰氏染色的实验报告并记录细菌的基本形态与特殊结构。【附】一、革兰氏染色法各种染液的配制 1.结晶紫染液 用天秤量取结晶紫5 g放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95酒精使之溶解。加入酒精全量为100 m1，制成酒精饱和液 (原液)。取原液20 ml，与1草酸铵水溶液80 ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。 2.碘液 碘 1 g 碘化钾 2 g 蒸馏水 300 ml 配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后加蒸馏水至300 ml。供革兰氏染色媒染用。 3.稀释石碳酸复红染液 首先，取碱性复红10 g和95酒精100 ml，制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10 ml，与5石碳酸水溶液90 ml混合，用滤纸过滤，再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。二、鞭毛染色法(魏曦染色)1染液配制：2 ml饱和钾明矾液，5 ml 50 g/L石炭酸液和2 ml 200 g/L鞣酸液混合。临用时加1 ml碱性复红乙醇饱和液混合后过夜，次日过滤后使用，3 d内使用效果最好。2染色方法：先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代67次。取琼脂斜面培养基吸出凝渗水，加入2 ml无菌蒸馏水，然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处，再从该交界处向上划一直线，放入温箱中培养16 h。用接种环从交界处取一环菌液，轻轻放入盛有34 ml蒸馏水的小碟液体表面，使细菌自由弥散，浮在液体表面，静置于孵箱内45 min后，用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上，切勿研磨和摇动。置35或室温下让其自然干燥，切勿火焰固定，加数滴染液染色0.5 1 min，水洗，干后镜检，可见菌体和鞭毛均呈红色。三、荚膜染色法1染液：结晶紫乙醇饱和液5 ml加蒸馏水95 ml，混匀；20 %（200 g/L）硫酸铜水溶液。2染色方法：将经小白鼠传代培养的肺炎链球菌进行涂片，在空气中自然干燥，无需加热固定，先滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止。不要水洗，用硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干后油镜观察，结果菌体及背景呈紫色，菌体周围有一圈淡紫色或无色的荚膜。四、芽胞染色法1染液：石炭酸复红染液、95%乙醇、碱性美蓝染液。2方法：用芽胞菌制成涂片，干燥后加热固定，加数滴石炭酸复红液，微加热染色5 min，冷却后用流水冲洗，用95%乙醇脱色2 min，水洗，再加数滴碱性美蓝30 sec，水洗，吸水纸吸干后镜检。其结果为菌体呈蓝色，芽胞呈红色。实验二 细菌的生长繁殖与消毒灭菌（综合性实验）【实验内容】一、培养基制备、种类、用途。二、细菌的分离接种技术及生长情况的观察。三、消毒灭菌的方法。【目的要求】一、了解培养基的制备过程及常用培养基的种类，初步学会细菌的接种方法及无菌操作法。二、观察细菌在各种培养基中生长现象。三、认识常用的物理和化学消毒灭菌法。四、观察药物敏感试验的结果并了解其临床意义。【实验原理】一、培养基是指在人工培养细菌时，提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源和无机盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分（如糖类、血液、抑制剂等）则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等。此外，还需具备一定的酸碱度（pH）、温度、渗透压、必要的气体、无菌等要求，用于人工培养各类细菌。二、固体培养基的平板是从混杂的材料中分离出所需的细菌，以获得纯种；琼脂斜面培养基一般供细菌繁殖，用作纯培养；某些特殊斜面培养基可作观察生化反应等特殊用途；普通液体培养基一般作增菌用；半固体培养基可用来检测细菌是否具有动力。三、不同细菌的新陈代谢特点不同，在各种培养基中的生长现象不同，有利于鉴别与利用细菌；不同细菌对不同抗生素的敏感性不同，药物敏感试验帮助我们了解细菌对抗生素的敏感性，指导临床用药。四、消毒（Disinfection）：杀灭病原微生物的方法。用以消毒的药物称为消毒剂(Disinfectants)一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌繁殖体有效。对于芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间；灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的方法。无菌（Asepsis）指物体上或容器内无活菌存在的意思。无菌操作是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。例如，进行外科手术或微生物学实验时，须注意无菌操作；防腐（Antisepsis）指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物称为防腐剂，许多药物在低浓度时只有抑菌作用，浓度增高或延长作用时间，则有杀菌作用。 物理消毒灭菌法即利用温度、辐射、超声波等物理条件的改变，使得蛋白质变性；核酸断裂或变构,从而抑制细菌代谢和生长或损害细胞膜的结构，破坏其生理功能等，从而起到消毒灭菌作用的方法。化学消毒灭菌法：利用化学药物渗透细菌的体内，使菌体蛋白凝固变性，干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长或破坏细胞壁、损害细胞膜的结构，改变其渗透性，破坏其生理功能等，从而起到消毒灭菌作用。所用的药物称化学消毒剂。有的药物杀灭微生物的能力较强，可以达到灭菌，又称为灭菌剂。凡不适于物理消毒灭菌而耐潮湿的物品，如锐利的金属、刀、剪、缝针和光学仪器（胃镜、膀胱镜等）及皮肤、粘膜，病人的分泌物、排泄物、病室空气等均可采用此法。【实验材料与仪器】一、各种培养基成品、血液 (脱纤维羊血或兔血) 约10 20 ml。二、枯草杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等菌种。三、接种环（针）、培养皿、试管等。 四、 药物纸片、酒精 、镊子。【实验方法与步骤】一、培养基制备 1一般培养基的制备过程 准确称量培养基各成分、混合溶解、测定及矫正pH分装、包装灭菌检定保存。2常用培养基的种类 根据不同细菌的营养要求及实验目的制成的培养基种类很多，按培养基的作用可分为：（1）基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分，按物理性状可分为液体（普通肉汤）培养基、半固体培养基、固体培养基。具体过程：按一定稀释度加热熔化牛肉膏或溶成普通琼脂培养基。15磅高压蒸气灭菌20 30 min。趁热将熔化的培养基倒入灭菌试管或灭菌平皿内，每个试管按不同实验要求倒入一定数量，每个平皿约15 ml，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。（2）营养培养基：供培养营养要求较高的细菌用，如血琼脂培养基（加热熔化普通琼脂培养基 待冷至50左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿产生泡沫) 分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基），血清肉汤培养基（在普通肉汤培养基中加入血清）。另外还有选择培养基，可选择性抑制非病原菌的生长，有利于分离病原菌，如中国蓝琼脂培养基、SS琼脂培养基。鉴别培养基是供细菌生化反应试验用的，以鉴定细菌，如糖发酵管、含铁双糖培养基。厌氧培养基用以培养厌氧菌，如疱肉培养基。二、细菌的分离接种技术及生长情况的观察（一）细菌的分离接种法：1平板划线分离培养法 细菌在自然界中分布广、种类多，而被检材料又常含有一种以上的细菌，为了对特定细菌进行研究或鉴定，必须从混杂的材料中分离出所需的细菌，以获得纯种。分离的方法有多种。常用平板分区划线法。 烧灼灭菌接种环，以接种环取一环混合菌液。 左手立即持起平板，五指固定平皿盖边缘，向外反转手掌使平皿盖向上，则平板落于手掌内，用拇指和中指固定平皿边缘，再向内反转手掌，使平皿盖向下放于桌面上，但此时手指仍持住平皿边缘，并稍微提起，作好备用状态（如图1）。 图1 平板划线的手法 左手斜持（45角）平板，右手持已取材的接种环，两肘固定于实验台边缘使双手等高，平板在煤气灯或酒精灯火焰前上方56 cm距离，以右手持接种环在平板上侧的原始部位3040角度反复涂45次，然后烧灼接种环，待冷后，稍微通过原始部位向图示“1”区引出直线，如图示“1”区往返划线；旋转平板，重新烧灼接种环，待冷后，通过“1”区向“2”区引出一直线往返划线，如此重复4次。要求：划线每区之间只有一条线连接；划线既密又不重叠；四个区占据整个平板为宜（见图2）。图2 四区平板划线法 划线完毕，将平板放进平板盖内，并在平板底玻璃上用蜡笔标明标本（菌种）名称，班室座号、日期，将平板倒置（底在上）放于37孵育箱培养。 经1824 h后取出，观察平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、透明度、颜色等特征。 2斜面培养基接种法 取一菌种管与培养管置于左手食指、中指、无名指之间，拇指压住试管底部上方，使菌种管靠近火焰一侧，接种管位于外侧，斜面均向上。 右手拇指和食指分别松动两管棉塞，火焰灭菌接种环。 以右手小指与手掌，小指与无名指分别拔取两管棉塞（先外后内），将两管口迅速通过火焰灭菌。 将灭菌的接种环插入菌种管，从斜面上取菌苔少许。退出菌种管，迅速伸入待接种的培养管，在斜面上先由底部向上拉一条线，再从斜面底部向上轻轻曲折连续划线（见图3）。取出接种环，在火焰上灭菌管口，顺序塞上棉塞（先塞菌种管，后塞接种管），然后灭菌接种环；做好标记。37孵育1824 h后观察结果。细菌在培养管中的接种线上，生长出许多菌落连成一片，形成了菌苔。不同种的细菌菌苔，其透明度、颜色等特征不同。不正确正确图3 斜面接种法3液体培养基础接种法 肉汤、蛋白胨水、各种单糖发酵管等液体培养基都用本法接种细菌。接种肉汤经孵育后，可观察细菌不同生长情况。有的均匀混浊，有的沉淀生长，亦有表面形成菌膜。其他的液体培养基接种后，大多供作测定生化特性使用。如斜面培养基接种法握持菌种管，挑取少量菌苔，伸入待接种的培养基管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少许培养液调和，使菌混合于其中（见图4）。 4穿刺接种法 凡培养基制好后，其外形呈一圆柱直立于试管内者，均用穿刺法接种之。属于此类接种法的有半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、明胶培养基等。 （1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种管培养基。（2）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔接种半固体培养基时，垂直刺入培养基的中心。接种醋酸铅培养基时，则沿管壁的一侧穿刺于近底部0.5 cm处，然后循原路退出。半固体琼脂培养基穿刺接种，主要是观察细菌有无动力。接种后经孵育，有动力的细菌，该细菌沿着接种向外扩散，呈毛刷状生长；无动力的细菌，该力沿接种线生长、无扩散现象出现。醋酸铅培养基观察有无黑色沉淀物形成（见图4）。图4 液体培养基接种法 穿刺接种法（二）细菌在培养基中生长现象的观察1细菌生长的环境条件欲使细菌生长繁殖，除了合适的培养基（营养料）外，尚需适宜的温度（一般致病菌所需的温度为37）及一定的环境条件，例如有的细菌初次分离时，需在含有510%CO2的环境中，因此培养细菌的方法，通常有以下三种。（1） 需氧培养法 将已接种的试管或平皿培养基放置37温箱中培养1824小时。（2）厌氧培养法 厌氧培养的装置和仪器目前常用的有厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋、旋转管和手套箱等，具体内容见实验五。（3）二氧化碳（CO2）培养法某些细菌如脑膜炎球菌、布鲁氏杆菌等，初次分离培养在含510% CO2的环境中生长较好。一般最简单的二氧化碳培养法是将接种好的培养基放在玻璃缸中，在缸内燃点一支蜡烛，将玻璃缸用盖密封，当烛火熄灭时，缸内即已含一定量的二氧化碳。2细菌的生长现象的观察（1）液体培养基中的生长现象 均匀混浊状态：大多数细菌属此类。 沉淀生长：主要是呈链状的细菌。 表面菌膜：多是专性需氧菌。 （2）固体培养基中的生长现象：菌落与菌苔。菌落是细菌划线接种于固体培养基表面，由于划线的分散作用，使许多混杂的细菌在培养基表面上散开，经过一定时间的培育后繁殖成为一堆堆的细菌集团，肉眼可见。在一般情况下，一个菌落是由单独一个细菌不断分裂反之堆积而成，属于同一种细菌，挑出一个菌落， 移种到另一个培养基中，则所生长出来的细菌均为纯种，即纯培养。观察细菌菌落大小、颜色、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘是否整齐以及透明度等方面，有助于识别和鉴定细菌，并根据固体培养基上菌落的数目，计算标本中的活菌数。琼脂斜面培养基上许多菌落融合在一起，形成菌苔。（3）半固体培养基上的生长现象如菌有鞭毛，能运动，则细菌从穿刺线向四周半固体培养基中运动弥散，培养后沿穿刺线呈羽毛状或云雾状生长，穿刺线模糊不清。如菌无鞭毛，不能运动。则细菌仅沿穿刺线成明显的线形生长，周围培养基仍然透明澄清。三、消毒灭菌（一）常用消毒灭菌器及滤菌器介绍：高压蒸气灭菌器（图5），煮沸消毒器（图6），电热烤箱，细菌过滤器、超声洗涤机等。1高压蒸气灭菌器： （1）构造：高压蒸汽灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚固厚实，其上方有金属厚盖，盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而蒸汽压力升高，随着其温度亦相应地增高。高压蒸汽灭菌器上装有排气阀门、安全活塞，以调节蒸汽压力。有温度计及压力表，以表示内部的温度和压力。灭菌器内装有带孔的金属搁板，用以放置要灭菌的物体(如图)（2）用法：加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。灭菌器下用煤气或电炉等加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气，否则压力表上所示压力并非全部是蒸汽压力，灭菌将不完全。图5-1 高压蒸汽灭菌器 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3)，保持压力和温度（注意压力不要过大，以免发生意外），维持1530 min。灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：一、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，二、湿热穿透力强，三、蒸气变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。凡耐高温和潮湿的物品，如培养基、生理盐水、衣服、纱布、棉花、敷料、玻璃器材、传染性污物等都可应用本法灭菌。注意事项：第一，无菌包不宜过大（小于50cm30cm30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。第三，定期检查灭菌效果。经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜。干热与湿热灭菌虽然都是利用热的作用杀菌，但由于本身的性质与传导介质不同，所以其灭菌的特点亦不一样（表1）。2煮沸法 将水煮沸至100，保持510分钟可杀灭繁殖体，保持13小时可杀灭芽胞。在水中加入碳酸氢钠至12浓度时，沸点可达105，能增强杀菌作用，还可去污防锈。在高原地区气压低、沸点低的情况下，要延长消毒时间（海拔每增高300 m，需延长消毒时间2分钟）。此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、玻璃、橡胶类物品。图5-2自动高压蒸气灭菌器 图5-3 手提高压蒸气灭菌器 图6煮沸消毒器4 电热烤箱：利用烤箱的热空气消毒灭菌。烤箱通电加热后的空气在一定空间不断对流，产生均一效应的热空气直接穿透物体。一般繁殖体在干热80100中经1小时可以杀死，芽胞、病毒需160170经2小时方可杀死。热空气消毒灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器以及明胶海棉、液体石腊、各种粉剂、软膏等。灭菌后待箱内温度降至5040以下才能开启柜门，以防炸裂表一、干热灭菌与湿热灭菌的比较干热湿热加热介质 对物品影响适用对象作用温度作用时间杀菌能力空气 烤焦金属、玻璃与其他不畏焦化物品高（160400）长（15小时）较差水和蒸汽 濡湿（皮革损坏）棉织品、水液等不畏湿热物品低（60134）短（460分钟）较强5辐射消毒灭菌 包括光照消毒和电离辐射。光消毒主要是利用紫外线照射，其杀菌作用主要是因为DNA吸收了紫外线引起胸腺嘧啶形成二聚体，从而干扰了DNA的复制，轻则发生突变，重则导致死亡。紫外线通过空气时，可使空气中的氧气电离产生臭氧，加强了杀菌作用。紫外线穿透性差，不能透过玻璃，尘埃，纸张和固体物质；透过空气能力较强，透过液体能力很弱。光照消毒对杆菌杀菌力强，对球菌较弱，对霉菌、酵母菌更弱。对生长期细菌敏感，对芽胞敏感性差。光照消毒因地区、季节、环境的影响，效果有所差异，当温度低于4，湿度超过50时，杀菌能力减弱。因此，消毒时必须提高温度，延长消毒时间，一般室温保持在1025为宜。减少空气中的尘埃，直接照射物品，可提高消毒的效果。（1）日光曝晒法：日光由于其热、干燥和紫外线作用，具有一定的杀菌力，将物品放在直射日光下，曝晒6小时，定时翻动，使物体各面均受日光照射。此法多用于被褥、床垫、毛毯、书籍等物品的消毒。（2）紫外线灯管消毒法：紫外线因其光谱位于紫色可见光之外，故称紫外线。紫外线灯管是一种人工制造的低压汞石英灯管，管内注入压强0.40.6kPa的氩气和水银数滴，管子两端用钨丝作成螺旋状电极。通电后，氩气先电离，然后冲击水银电离，发放紫外线。经57分钟后受紫外线照射的空气，才能使氧气产生臭氧。因此消毒时间应从灯亮57分钟后计时，紫外线杀菌能力与其波长有密切关系。最佳杀菌波长为2537nm（是细菌对紫外线吸收最快的波长）。常用的紫外线灯管有15W、20W、30W、40W四种，可采用悬吊式，移动式灯架照射，或紫外线消毒箱内照射。紫外线灯配用抛光铝板作反向罩，可增强消毒效果。用于物品消毒时，如选用30W紫外线灯管，有效照射距离为2560cm，时间为2530分钟（物品要摊开或挂起，扩大照射面）。用空气消毒时，室内每10m2 安装30W紫外线灯管1支，有效距离不超过2m。照射时间为3060分钟，照射前清扫尘埃，照射时关闭门窗，停止人员走动。 注意事项：注意眼睛、皮肤的保护，照射时嘱病人勿直视紫外线光源，可戴墨镜，或有用纱布遮盖双眼。用被单遮盖肢体，以免引起眼炎或皮肤红斑。紫外线灯管要保持清洁透亮。灯管要轻拿轻放。关灯后应间隔34分钟后才能再次开启。一次可连续使用4小时。定期监测消毒效果。紫外线的杀菌力取决于紫外线输出量的大小，灯管的输出强度随使用时间的增加而减弱。故日常消毒多采用紫外线强度计或化学指示卡进行监测，新管（30W）不低于100Wcm2 ；使用中的旧管在50-70Wcm2 ，则需延长消毒时间；低于50Wcm2 者必须更换。定期进行空气细菌培养，以检查杀菌效果。（3）臭氧灭菌灯（电子灭菌灯）消毒法 灭菌灯内装有14支臭氧发生管，在电场作用下，将空气中的氧气转换成高纯臭氧。臭氧主要依靠其强大的氧化作用而杀菌。使用灭菌灯时，关闭门窗，确保消毒效果。用于空气消毒时，人员须离开现场，消毒结束后2030分钟方可进入。6、除菌滤器除菌滤器简称滤菌器。种类很多，孔径非常小，能阻挡细菌通过。它们可用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃屑等制成。下面介绍几种常用的滤菌器。（1）结构： 赛氏(Seitz)滤菌器(图7)：由三部分组成。上部的金属圆筒，用以盛装将要滤过的液体；下部的金属托盘及漏斗，用以接受滤出的液体；上下两部分中间放石棉滤板，滤板按孔径大小可分为三种：K滤孔最大，供澄清液体之用；EK滤孔较小，供滤过除菌；EKS滤孔更小，可阻止一部分较大的病毒通过。滤板依靠侧面附带的紧固螺旋拧紧固定。 玻璃滤菌器（图8-1）：由玻璃制成。滤板采用细玻璃砂在一定高温下加压制成。孔径由0.15250m不等，分为G1、G2、G3、G4、G5、G6六种规格，后两种规格均能阻挡细菌通过。图7赛氏滤菌器 薄膜滤菌器(图8-2)：由塑料制成。滤菌器薄膜采用优质纤维滤纸，用一定工艺加压制成。孔径：200nm，能阻挡细菌通过。图8-1玻璃滤菌器 图8-2薄膜滤菌器（2）用法：将清洁的滤菌器(赛氏滤菌器和薄膜滤菌器须先将石棉板或滤菌薄膜放好，拧牢螺旋)和滤瓶分别用纸或布包装好，用高压蒸汽灭菌器灭菌。再以无菌操作把滤菌器与滤瓶装好，并使滤瓶的侧管与缓冲瓶相连，再使缓冲瓶与抽气机相连。将待滤液体倒入滤菌器内，开动抽气机使滤瓶中压力减低，滤液则徐徐流入滤瓶中。滤毕，迅速按无菌操作将滤瓶中的滤液放到无菌容器内保存。滤器经高压灭菌后，洗净备用。 （3）用途：用于除去混杂在不耐热液体（如血清、腹水、糖溶液、某些药物等）中的细菌。7超声波消毒法 是利用频率在20200kHz的声波作用下，使细菌细胞机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。如超声洗手器，用于手的消毒。超声洗涤机，用于注射器的清洁和初步的消毒处理。（二）常见化学消毒灭菌剂介绍（种类见医学微生物学）1化学消毒灭菌剂的使用原则（1）根据物品的性能及病原体的特性，选择合适的消毒剂。（2）严格掌握消毒剂的有效浓度、消毒时间和使用方法。（3）需消毒的物品应洗净擦干，浸泡时打开轴节，将物品浸没于溶液里。（4）消毒剂应定期更换，挥发剂应加盖并定期测定比重，及时调整浓度。（5）浸泡过的物品，使用前需用无菌等渗盐水冲洗，以免消毒剂刺激人体组织。2常用化学消毒灭菌方法（1）浸泡法：选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性消毒剂，将物品浸没于消毒剂内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。（2）擦拭法：选用易溶于水、穿透性强的消毒剂，擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。（3）薰蒸法：加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气体，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。适用于室内物品及空气消毒或精密贵重仪器和不能蒸、煮、浸泡的物品（血压计、听诊器以及传染病人用过的票证等），均可用此法消毒。纯乳酸：常用于手术室和病室空气消毒。每100m2空间用乳酸12 ml加等量水，放入治疗碗内，密闭门窗，加热熏蒸，待蒸发完毕，移去热源，继续封闭2小时，随后开窗通风换气。食醋：510ml/m3加热水12 m3，闭门加热熏蒸到食醋蒸发完为止