（食品科学与工程专业论文）牛血血红蛋白酶法水解及产物抗氧化活性的研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 我国动物血液资源丰富，如不加以合理开发利用，直接排放到环境中，不仅浪费了宝贵的蛋 白质资源，而且对环境造成严重的污染。血红蛋白作为血液中的最主要蛋白质，由于其色泽猩红、 腥味重、不易保藏以及被人体消化吸收，而难以开发利用。利用现代高新技术开发高附加值产品 进一步提高动物血液的利用率，对动物血液制品的工业化和生态环境的保护具有重要的意义。 本研究以牛血血红蛋白为研究对象，研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、本瓜复合蛋白酶、p r o t a m e x 蛋白酶、f l a v o u r z y m e 蛋白酶单酶体系对血红蛋白的酶水解作用，并采用内切酶和外切酶分步酶 解方法，确定水解血红蛋白的最佳条件。通过测定水解度、蛋1 3 质回收率、氨基氮含量、t c a 可 溶性氮含量、血红素含量等指标，确定最佳的酶解工艺条件，为血红蛋白制品的开发和工业化生 产提供理论依据。并利用体外抗氧化活性测定方法对酶解产物的抗氧化活性进行检测，探索利用 动物血液血红蛋白提取抗氧化肽的可行性，为动物血液制品的开发利用探索新的道路。 实验结果表明，对牛血血红蛋1 3 进行酶法水解，以水解度( d h ) 和t c a 可溶性氮含量为指 标，中性蛋白酶水解效果最好；以蛋白回收率、血红素含量作为衡量指标，木瓜复合蛋白酶效果 最好。通过单因素水平试验和正交实验，确定了中性蛋白酶的最佳水解条件、中性蛋白酶和风味 蛋白酶的双酶复合酶解最佳工艺和木瓜复合蛋白酶分段升温酶解最佳工艺。实验证明采用双酶复 合酶解血红蛋白效果明显好于单酶酶解，水解液的水解度、蛋白质回收率、氨基氮含量、t c a 可 溶性氮含量都有所增加，水解度可达到5 2 9 ，比单酶水解提高了5 5 ，水解液中t c a 可溶性 氮含量为7 0 6 。 通过s d s - p a g e 电泳研究血红蛋白酶解产物的分子量分布，探讨酶的种类，水解方式对酶解 产物分子量分布的影响。结果显示，双酶分步酶解所得水解液中多肽平均分子量明显小于单酶水 解液，单酶水解液中多肽分子量集中在3 0 0 0 8 0 0 0 d a ，双酶复合水解液中大部分多肽分子鼍低于 6 0 0 0 d a ，部分多肽分子量在3 0 0 0 d a 以下。 本研究采用荧光光度法检测了酶解产物抗氧化活性。发现牛血血红蛋白水解液具有较强清除 羟自由基的能力，最高清除率可达到7 6 。而且酶解产物清除羟自由基能力受到蛋白酶种类、水 解方式、水解时间、水解度、水解液蛋白浓度的影响。并通过对荧光光度法的反应体系进行研究， 证明该方法相比紫外分光光度法灵敏度高，数据重现性好，操作方法简便，并且不受水解液中血 红素和f e ”、f e ”的干扰，可以广泛应用于水溶性有色抗氧化物质清除羟自由基能力的检测。 关键词：血红蛋白、酶解、抗氧化、清除羟自由基 中国农业大学硕士论文 摘要 a b s t r a o t i nr e c e n ty e a r s ，w a s t e so fa g r i c u l t u r a la n df o o dp r o c e s s i n gh a v eb e e nc o n s i d e r e da sv a l u a b l er e s o u r c e s r e c y c l i n go ft h e s ep r o d u c t si sn o wr e g a r d e da r li m p o r t a n ti n d u s t r i a lp r o c e d u r e a n i m a lb l o o d ，o n eo f t h e s ep r o d u c t s ，c o n t a i n sa b o u t1 8 p r o t e i n ，w h i c hi sc u r r e n t l yu n d e r u t i l i z e d a n i m a lb l o o da l s o c o n t a i n sh e m o g l o b i n , w h i c ha c c o u n t sf u rm o r et h a nh a l f o f t h et o t a lb l o o dp r o t e i n s t h ei n v e s t i g a t i o no nt h ep r o d u c to fh e m o g l o b i nc a l ln o to n l yc o n v e r t st h ew a s t et ot h eu s e f u l n e s s ，b u t a l s op r e v e n tt h eh a r mc a u s e db ya n i m a lb l o o di m m e d i a t e l ye j e c t e di n t oc i r c u m s t a n c e t h e r e f o r e ，t h e i n v e s t i g a t i o ni sg r e a t l ye c o l o g i c a l l ym e a n i n g f u la n de c o n o m i c a l l yv a l u a b l e i nt h i sp a p e r , t h eb o v i n eh e m o g l o b i nw a st r e a t e dw i t hs e v e r a lp r o t e a s et op r o d u c ep e p t i d e p r o t e a s e s u s e dw e r ei n d u s t r i a l l ya p p l i c a b l eo n e sw h i c hc o n t a i n sn e u t r a s e ，p a p a i n ，p a p a i nc o m p o u n d ，p r o t a m e x a n df l a v o u r z y m e t h o u g hm e a s u r i n gd e g r e eo f h y d r o l y s a t e ( d h ) ，t h en i t r o g e ns o l u b i l i t yi n d e xi n2 0 t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a _ n s i ) ，r e c y c t er a t eo fp r o t e i na n db e r n ec o n t e n t ，t h eb e s tc o n d i t i o no f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w st h a tn e u t r a s ea n dp a p a i nc o m p o u n dw e r e o p t i m a lp r o t e a s ef u rh e m o g l o b i n i na d d i t i o n ，t h et w o - s t e ph y d r o l y s i sw i t hn e u t r a s ea n df l a v o u r z y m e c a l lf u r t h e ri m p r o v ee f f e c to fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fb o v i n eh e m o g l o b i n ，t h ed e g r e eo fh y d r o l y s a t e ( d h ) r e a c h e d5 2 9 t h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fv a r i o u sp r o t e i nh y d r o l y s i sw e r ei n v e s t i g a t e dw i t ht h em e t h o do f s d s - p a g e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to f h y d r o l y s a t ew a sm a i n l ya r o u n d3 0 0 0 - 8 0 0 0 d a , t h em o l e c u l a rw e i g h to f t w o s t e pm u t t t e n z y m a t i ch y d r o l y s a t ew a sm a i n l yl e s st h a n6 0 0 0d a , s o m e o f w h i c hw a sl o w e rt h a n3 0 0 0d a s c a v e n g i n ga b i l i t yo fb o v i n eh e m o g l o b i nh y d r o l y s a t ef o rh y d r o x y lr a d i c a lb ys p e c t r o f l u o r i m e t r yw a s i n v e s t i g a t e d t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt ov e r i f ys c a v e n g i n ge 疵c to fh y d r o l y s a t ei nw h i c h t h e r ew a so b v i o u ss c a v e n g i n ga b i l i t yf o rh y d r o x y lr a d i c a l i na d d i t o n ，t h er a l a t i o n s h i pb e t w e e n s c a v e n g i n gc a p a c i t ya n dt h ep r o t e a s ew a sv a l i d a t e da n dt h ee x p e r i m e n t a ld a t ei n d i c a t e dt h a tt h ei n c r e a s e o fd hi sn ob e n e f i tt ot h ei m p r o v e m e n to fs c a v e n g i n gc a p a c i t y t h e r e f o r e ，t h ep r o p o s e dm e t h o dc o u l d b eu s e dt os e a r c hp r o t e c t i n gf r e s hr e a g e n ta n da n t i o x i d a n t s t h em e t h o di ss i m p l e ，r e l i a b l ea n ds t a b l e t e c h n i q u ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh o i ti sb e n e f i c i a lt od e t e r m i n es a m p l e sw i t hc o l o rt h a ti so fn o i n f l u e n c et ot h ep r e c i s i o no f t h i sm e t h o d k e yw o r d s ：b o v i n eh e m o g l o b i n ，h y d r o l y s i s ，a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y , s c a r v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：同霜兰 时间：2 d 如年6 月2 1 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 同兰 时间： 加6 年石月纠日 导师签名：曼呸千 时间：力年6 月纠日 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 动物血液的应用前景 1 1 1 动物血液资源概况 第一章绪论 动物血液是畜、禽屠宰加工过程中的主要副产品之一，全世界每年可利用的动物血液总量相 当可观。根据f a o 的资料，2 0 0 3 年全世界屠宰约2 4 亿头牛、猪和羊，血液产量约为1 2 0 0 万吨。 我国畜、禽类动物血液资源也十分丰富，从1 9 9 3 年以来，我国肉类生产量一直居世界第一其 中生猪产量接近世界总量的1 2 ，2 0 0 3 年，中国猪牛羊出栏总数达到8 亿9 千万头，畜血总量达 3 0 0 万吨。 动物血液占活重的比例依动物种类而异。牛、羊血约占活体重的7 6 8 3 5 ，猪血约占活体 重的4 5 。正常屠宰动物时收集到的血液占总量的6 0 7 0 ，其余血液滞留于肝、肾、皮肤和 体内。用空心刀采取食用血和制药用血时，可以采集到血量：牛为放血量的7 5 ，猪为放血最的 6 0 。照此推算，全国每年可采集牛、羊、猪和大型牲畜血液总量达到2 9 3 万吨1 1 , 2 , 3 j 。另外，还 有大量的鸡、鸭、鹅等家禽血液。 1 1 2 动物血液的成分特性 血液对动物体十分重要，它是一种结缔组织，在体内流动时，为其它器官和组织提供氧和营 养物质，去除代谢产物。全血的比重为11 6 ，呈弱碱性，p h 值为7 3 7 5 。血液中各种成分的含量 相当稳定( 图1 1 ) ，它富含蛋白质和微量元素，以及适量矿物质、维生素、激素、酶系和其它一 些生理活性物质( 图1 - 2 ) 。采用离心技术可以将血液分离成血浆和细胞两个部分；血浆约占总晕 的6 5 ，其中蛋白质含量为8 ，用离子交换层析可将其分为三种主要成分：各种球蛋白、白蛋白 和纤维蛋白：剩余的约3 5 的细胞成分主要是红细胞浓缩物，含有3 6 的蛋白质，主要是血红蛋 白【3 4 1 。 _ 血浆 ( 2 ) 广白蛋白 蛋白质一球蛋白 ( 8 ) l 纤维蛋白质 电解质 其他营养物质 r 红细胞( 4 0 0 5 0 0 万m m 3 ) 血小板( 1 0 3 0 万m m 3 ) i中性粒细胞( 5 0 7 0 ) m 细胞、广淋巴细胞( 2 0 4 0 ) 白细胞单核细胞( 4 8 ) l ( o4 1 万) 1 嗜酸性粒细胞( 2 4 ) l 嗜碱性粒细胞( 05 i ) 囝i - 1 血液的组成示意围 f i g 1 - lt h ec o m p o s i t i o no f b l o o d 厂l， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 动物血液营养丰富，全血蛋白质含量为1 7 - 2 1 ，干燥血粉蛋白质含量达8 0 以上，是全乳粉 的三倍。血液蛋白质氨基酸组成平衡( 表i 3 ) ，是一种优质蛋白质，其必需氨基酸总最高于人乳 和全蛋，尤其赖氨酸含量很高，约为9 。由于谷物蛋白中赖氨酸含量低，蛋氨酸和胱氨酸含量高， 血液蛋白可以与谷物蛋白相互补。此外，血红索铁是血液的另一种重要营养素，血红素由卟啉环 和二价铁构成，每1 0 0 9 血液中铁的含量高达4 0 m g 以上，而瘦牛肉、瘦羊肉和瘦猪肉则只有 2 1 6 m g 、2 1 o m g 和1 1 6 m g 。人体对血红索铁的吸收率是无机铁的3 倍，因此，血液中的卟啉铁对 于改善由于食物中缺铁或吸收障碍性缺铁所造成的缺铁性贫血效果明显i ”。 ，血浆蛋白 ，蛋白质一 fl 血红蛋白 i，常量元素：钠、钾、钙、镁、磷 全血矿物质j l 微量元素：铁、铜、锌、锰 维生素：硫胺素、核黄素、泛酸、叶酸、烟酸、胆碱 l 其它：碳水化合物、脂肪、游离脂肪酸、激素、其他代谢产物 图i - 2 血液的营养成分 f i g 1 - 2 t h e n u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o n o f b l o o d 表i 1 牛血各部分中的氨基酸组成 t b | c l - 1t h ea a c o m p o s i t i o no f b o v i n eb l o o d 。亲慧白， 血黼血娜c m c 一血蠊 67 3 3 3 5 93 4 6 6 0 1 6 8 08 6 2 5 4 4 7 8 4 7 9 5 1 6 4 1 8 7 4 7 l1 8 9 8 0 6 6 7 1 4 0 8 4 7 4 3 3 9 5 0 0 8 4 4 0 1 4 1 4 8 0 5 5 0 u n 03 6 o3 6 2 3 9 76 2 1 0 1 6 7 6 4 1 0 0 4 1 0 3 9 7 7 70 0 6 1 0 3 7 7 4 0 9 1 0 1 6 85 0 u n 1 39 2 5 1 1 u n 03 6 o3 6 2 - 3 9 8 1 9 1 0 5 8 63 8 1 0 3 7 u n 1 1 0 3 5 4 7 8 0 9 32 4 45 1 9 4 7 1 0 6 7 u n 1 2 9 8 45 6 u n 2 1 5 2 1 5 2 1 8 92 9 1 14 7 3 s o 1 06 4 u n 1 2 1 8 3 2 6 9 6 8 25 8 46 7 8 3 5 a r g 33 0 17 520 722 4 2 m m莹协研枞弧啪研脚船蛳胁嘶舶 总 总 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 国内外动物血液开发研究现状 1 2 1 国内动物血液制品及应用概况 我国虽然具有充足的动物血液资源，但由于受诸多因素的限制，对血液的利用还根不完善， 致使大量动物血液资源浪费，并且造成环境污染。2 0 世纪7 0 年代以前利用量很少，一部分作为食 用，加上成传统血豆腐、血肠，另有极少部分用作饲崩血糟，绝大部分血液作为废弃物放掉。7 0 年代末期和8 0 年代初期，国家开始重视血液的综合利角，对其作为重点课题进行攻关，相继开发 研究出一些血液的产品，例如用于饲料的发酵血粉。近年来随着现代分析技术和分离加工技术的 发展，血液的利用取得很大进展，相继出现了许多重大科研成果，使血液利用的经济效益和社会 效益大幅度提高。尤其是作为畜禽饲料、营养补剂、血红素、血卟淋衍生物、超氧化物歧化酶( s o d ) 、 氨基酸营养液等项目，达到了国际先进水平j l 。 1 2 1 1 血浆蛋自 全血经离心分离后可以得到淡黄色的血浆，血浆中水分约占9 1 ，蛋白质含量约为7 5 。血 浆蛋白真消化率为9 2 1 ，生物学效价为8 7 o ，蛋白质利用率为8 0 。血浆蛋白具有良好的乳化 性能，在香肠、灌肠、西式火腿和肉脯中添加适量的血浆蛋白，不仅可以提高产品蛋白质含量， 降低脂肪含量，而且使产品的保水性、切片性、弹性、粒度、产品率等得到改善。血浆蛋白也是 一种良好的发泡剂和粘结剂，可以代替鸡蛋和牛奶添加到面包、饼干、馒头等糕点和糖果中，经 应用发现效果很好，产品的蛋白含量得到提高而且具有较好的外观色泽。血浆蛋白作为一种食品 添加剂具有广泛的应用前景。 1 2 1 2 血红蛋白 血红蛋白是血液蛋白中最主要的成分，约占蛋白质总量的2 3 ，其分子量为6 8 0 0 0 ，有四条多 肽链构成球状结构称t ：1 链和b 链，每条多肽链在其非极性氨基酸残基富集的疏水区内含有一个 血红素，血红蛋白中血红素和多肽链之间以非共价键结合，血红素由卟啉环和二价铁构成，每1 0 0 9 血液中铁的含量高达4 0 m g 以上，人体对这种铁的吸收率是无机铁的三倍。 血红蛋白虽然具有较高的营养的价值，但存在着一些问题制约着血红蛋白的应用：第一，血 腥味较重；第二，产品颜色感观性差；第三，血红蛋白特殊的组成和结构，造成人体或动物的消 化吸收利用率低。目前在食品工业中的应用主要有以下几个方面： ( 1 ) 肉品发色剂 f o x p ( 1 9 7 6 年) 最先提出了添加由血红蛋白台成的亚硝基血色原可使腌肉制品获得较稳定的 粉红色，减少亚硝酸盐的使用量。s h a h i d i 丰l l p e g g l 7 ，5 1 等人( 1 9 8 5 1 9 9 1 年) 对血红蛋白制取亚硝 基血色原的方法，化学结构和抗氧化能力等方面进行了一些研究，取得了较好的效果，他f 用从 牛血血红蛋白中提取的_ 衄红素与n o 进行反应。制得肉制品发色剂。日本坂田亮一【1 0 1 等人( 1 9 9 4 年) 以商业血红蛋白粉配成溶液和亚硝酸钠与抗坏血酸钠制各血红蛋白反应混合物，并将反应物 用于猪肉香肠中获得显著效果。张坤生【“l ( 1 9 9 8 年) 等人在分离得到的血红蛋白中加入抗坏血酸， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 使p h 值为5 9 0 , - - 60 0 ，通入n 2 以排除空气，晟后通入n o 进行亚硝基血红蛋白的台成。王远明i i q ( 1 9 9 8 年) 将沉降的红细胞血浆移置反应器中，搅拌后加入乙醇和乙酸等作防腐脱腥处理，然后 在一定条件下加入烟酸和烟酰胺和t e a 、抗坏血酸及葡萄糖等作发色及抗氧处理，反应产物经均 质后得到里清香味深红色粘稠状物的无硝血红蛋白着色剂。湖南农业大学的马美湖 1 3 , 1 4 , 1 5 1 ( 1 9 9 7 年，2 0 0 1 年) 经反复多次试验，认为在最佳条件下合成制取亚硝基血红蛋白方法是可行的添加 到香肠等肉制品的效果较为理想，色泽、风味、稳定性、保存性与对照组无差别，同时大大降低 了肉制品q a n o 一的残留量，只有对照组的1 1 3 ，真正实现低硝肉制品，保证了肉制品的安全性。 解万翠、陆晓滨l lb j ( 2 0 0 2 年) 直接采用血红蛋白为原料，再与弧硝酸钠反应，制备安全发色剂。 孔保华7 1 ( 2 0 0 2 年) 用猪血中的血红素，将其与一定量的亚硝酸盐反应，经真空冷冻干燥合成制 得腌肉色素( c c m p ) 。 ( 2 ) 补血营养剂 研究发现，血红素铁在人体消化吸收过程中不受植酸和磷酸的影响，其吸收率较普通含铁食 品高3 倍以上，达u 3 0 ，所以可将其制成保健食品，用于治疗缺铁性贫血引起的各种疾病【”1 。 此外，血红蛋白的降解产物可制成氨基酸e 1 服液、注射液及复合液用于补充强化各种氨基酸。 在医疗保健方面，利用血卟啉制得血卟啉衍生物，用于癌症的辅助治疗，效果显著。用脂化法研 制成功的原卟啉钠，有保肝和降转氨酶作用，用于治疗各种肝炎”1 。晟近研究发现，血红蛋白不 仅可以作为血液代用品，在肿瘤资料、骨髓细胞造血、外科手术、抗休克、提高器官灌注和保存 效果等方面有良好的应用前景1 2 0 , 2 1 1 。 1 2 1 3 超氧化物歧化酶( s o d ) 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 简称s o d ，是广泛存在于好氧微生物和动植物中的 金属酶，是生物体内主要的氧自由基清除剂，可催化超氧阴离子自由基( 0 2 一) 发生歧化反麻： 2 0 2 一+ 2 h + 一h 2 0 2 + 0 2 。s o d 在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起重 要作用，它可以防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，还可以预防衰老，以及在一些疾病，如 肿瘤、炎症和自身免疫的治疗中有良好的疗效。日前，s o d 已, 进入化妆品、食品和医药等领域。 早在1 9 3 9 年m a n n q k e i l i n 就从牛血中分离到这种金属蛋白，并命名为血铜蛋白。直至1 9 6 9 年 m e c o r d 和f r i d o v i c h 发现了它的酶活性后，才命名为超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，缩 写为s o d ) ，并引起了人们的高度重视口”。 1 2 1 4 其他血液制品 动物血液中还含有其他各种活性物质，随着现代分析技术和分离加工技术的发展，这些活性 物质可以作为制剂应用于医药工业中：球蛋自制剂，从猪血中制取球蛋白制剂，其中丙种球蛋 白含量为8 5 以上，该种制剂目前主要应用于动物医学上；血活素：血活素是从发育旺盛的幼 牛血液中除去蛋白质的提取物。血活素具有抗溃疡、愈合创伤皮肤的作用；氨基酸：应用畜禽 血液制取的氨基酸有注射剂、口服液等多种形式。氨基酸的应用方向是治疗疾病和营养补剂： 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 水解蛋白：用血纤维蛋白经酸解或酶解水解蛋白，可用作营养剂、休克急救、代血浆等；凝血 酶：畜禽血液中含有凝血酶。具有良好凝血止血作用。用于治疗呼吸道和消化道出血；免疫血 清；血液中的免疫因子主要存在于血清中；生化试制：由于茸禽血液中所含物质极为丰富，目 前已使用或正研制的生化试剂有：血纤维蛋白溶酶原、血红蛋白氧化血红素、组氨酸、精氨酸、 苯丙氨酸及其衍生物等。 1 | 2 2 国外血液制品及应用概况 在动物血液制品方面的研究国外起步较早。日本科学家将血液分解、中和、脱臭、脱色，干 燥后获得畜血调味粉，加上呈味物质制成复合调味品，具有肉类特有风味，富含氨基酸，产品价 值离，应用十分广泛。俄罗斯科学家通过动物血成分的分提处理，充分利用了各种成分的功能性 质，将血液应用于多种食品当中，如巧克力、咖啡、蛋糕、面包、肉肠、酸奶等。德国、英国、 法国、比利时将猪血主要用于饲料。德国和比利时将大量血浆粉作为食品粘结剂和乳化荆。瑞典、 丹麦把血浆用于肉制品中，保加利亚用血生产酸乳酪，原苏联利用猪血制作血肠，利用血浆作饺 子馅。日本将血色素作香肠的着色荆，将血浆粉代替肉作为香肠原料。美国从牛血浆蛋白中制作 血纤维组织制品口”，此外还应用于饲料、林化工业、肥料、制药、葡萄酒等工业。 在医药工业中的利用。从动物血液中制取具有胰岛素作用的物质，促进伤口愈合物质，抗炎 类新药，人体组织粘结胶，具有免疫调节作用的物质等应用于医药工业是目前研究的熟点，但尚 未有大规模的产业化。 从国内外对畜禽血液的利用来看，人类对畜禽血液的利用逐渐由初级的粗制品向高级的精细 品发展。随着技术的进步，人们对血液蛋白的分离、纯化手段的提高，对血液的利用也开始从饲 料、食品添加剂转向医药、保健食品、特殊营养食品等方面。 1 3以动物血液为蛋白源的酶法水解及产物的研究进展 由蛋白质酶解获得的活性肽，是功能性食品研究最活跃的领域之一。生物活性肽具有涉及神 经、激素和免疫调节，抗血栓，抗高血压，抗胆固醇，抗细菌、病毒，抗癌，抗氧化，清除自由 基，改善食品风味、口味、硬度等功能。现已发现源于食物蛋白质的酶解物的一些小分子肽不仅 能提供人体生长发育所需的营养物质，同时具有防病、治病、调节人体生理机能的功效，因而人们 有可能从食品蛋白质中生产满足人们特定需求的活性肽。这就为人类更为充分的利用蛋白资源， 尤其那些生物效价不高和未被利用的蛋白资源开辟了一条新的途径。 国内外的研究者从食品蛋白质的酶解物中发现了一些小分子肽，这些肽按生理功能主要可分 为：吗啡样活性肽( o p i o i dp e p t i d e ) 、抗高血压肽( a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e ) 、免疫调节肽 ( i m m u n o m d o d u l a t i n gp e p t i d e ) 、促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽( p h o s p h o p e p t i d e ) 、抗血栓肽 ( a n t i t h r o m b o t i cp e 砸d e ) 、促进d n a 合成和细胞生长的肽、抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ) 、 抗癌肽( a n t i c a n c e r p e p t i d e ) 、促进双歧杆菌生长的肽等。 以动物血液为蛋白源的生物活性肽是通过现代生物技术将血液蛋白转化为小分子肽。据资料 报道 2 4 , 2 5 , 2 6 】，小分子血肽不仅有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性而且在体内消化吸收快。 研究表日) t 2 7 , 2 s 0 9 3 m “，2 3 个氨基酸组成的低肽有比游离氨基酸更好的吸收性能。饮食中的寡肽 s 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 ( 2 - 3 个氨基酸) 和多肽( 1 肛5 1 个氨基酸) 能够完整地通过肠道被吸收，作为生物活性肽在组 织水平上引起机体的生物学效应。并且小肽的蛋白质利用率高，具有低抗原性，不会产生过敏反 应，还具有促进脂肪代谢等生理活性，它的应用领域见图1 。4 3 3 j 。 以血液为蛋白源 的生物活性肽 易消化吸收、低粘度性、广蛋白质强化食品 抑制低密度脂蛋白作用u 酸性饮料 酸性条件下可涪性li 运动员食品 提高运动能力、体力 促进生长 l广一些食品的添加剂 抑制血压升高lj 抑制血压升高食品 防止动脉硬化il 预防冠心病、高血脂病 降低胆固醇 l 脑血管等保健品 提高免疫力、抗衰老、 清除肠垢，有利肠通便i强身健体的保健品 排出浸入人体内的粉尘 排毒莽颜食品成药物 有害金属微粒等 补充铁元素 7 围1 - 3血液蛋白源生物活性肽的应用领域 f i g 1 - 3t h ea p p l i c a t i o n so f b i o a e t i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o mb l o o dp r o t e i n 以动物血液为蛋白源的生物活性肽的研究在日本起步比较早，目前已从血红蛋白酶解产物分 离得到多种生物活性肽。最早b r a n t lv p 4 】( 1 9 8 6 年) 报道从牛血血红蛋白中分离得到两种吗啡肽 h e m o r p h i n 4 ( b3 4 3 7 ) 和h e m o r p h i n 5 ( b3 4 3 8 ) 。l a n t z ( 1 9 9 1 年) p5 l 曾报道过在血红蛋白 的1 3 链中含有抑制a c e 活性的氨基酸系列( 3 4 3 9 氨基酸残基) ；p l o t ( 1 9 9 2 年) f 3 ”等人分离 得到虹管舒缓激肽；k a z u e m i t o 等人( 1 9 9 6 年) 3 7 1 酶解珠蛋自得到了4 种具有抑制a c e 活性 降血压的活性肽，分别是p h e g i n l y s v a l v a l a l a 、p h e g i n ，l y s v a l v a l a l a - g l y 、 p h e - g i n - l y s v a l - v a l a l a - l y s 和g l y - l y s l y s v a l - l e u - g l n 。同年m i t o ! ( 1 9 9 6 年) 用胃蛋白酶酶 解猪血红蛋白也得到了抗高血压肽，存在b 链中：06 4 - - , 6 9 ( g k k v c q ) 、t 3 1 3 0 1 3 5 ( f q k v v a ) 、 b1 3 0 , 一一1 3 6 ( f q k v v a g ) 。研究证明血红蛋白b 链中存在有抑制a c e 活性和血压的内源性调节 剂，k y o i c h i 等( | 9 9 6 年) p 砚从珠蛋白酶解物中得到抑制血清中甘油三脂水平提高的四肽： v a l v a l t y r - p m ，可以有效缓解心血管疾病以及肥胖症。z h a oq y 等”( 1 9 9 6 年) 从牛血血红蛋 白中分离得到两种具有生物活性的鸦片状肽l v v h e m o r p h i n 5 ( 03 i 3 8 ) 和v v h e m o r p h i n 5 ( b 3 2 3 8 ) 。m a n - j i ni n 等”( 2 0 0 2 年) 依次用内肽酶e s p e r a s e 外肤酶和f l a v o u r z y m e 水解猪血红蛋 白得到富含亚铁血红素的低分子量的小肽。r a e h i d 等1 42 】( 2 0 0 5 年) 最新研究报道低度水解牛血 血红蛋白可以得到具有抗菌作用的活性肽，对大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌有明显抑制作用。 因此，将动物血液中的血红蛋白酶解成为具有生物活性的肽类物质，用于食品工业和制药t 业，不仅极大满足人们对功能性食品的需求，而且解决了动物屠宰时动物血液对环境的污染，同 时提高蛋白质资源的利用率。 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 4 蛋白质抗氧化活性产物制备与应用研究进展 这类抗氧化剂在体内可以消化吸收，兼具营养和保健特性，具有广阔的应用前景。 1 4 1 蛋白质抗氧化活性研究 生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类，而且蛋白质具有优良的乳化型特性 能够在油水界面起到介导作用，对于清除生物体内过量自由基，抑制膜脂质过氧化具有重要意义。 蛋白质水解成多肽后，具有抗氧化作用的基团充分暴露出来，能够更好的发挥抗氧化作用，往往 蛋白质的水解物的抗氧化活性比相应的蛋白质抗氧化作用更强。研究发现酪蛋白可减缓猪油的氧 化，铁蛋白或铁传递蛋白能与铁结合，因而可防止铁离子引起的h o 的产生和脂类的过氧化。 胆红素是血红蛋白等含铁卟啉的化合物在体内的代谢产物，游离的胆红素具有毒性作用，但与人 血清蛋白结合后，其分子鳌合成无毒的形式，并且在低氧浓度下，胆红素一血清蛋白结合物 ( a l b b r ) 是一种生理抗氧化剂，可有效地清除过氧自由基。蛋白质的抗氧化活性多与s h 含量 有关。此外有试验证实：用含硒蛋白质饲喂老年小鼠和大鼠，能使老年小鼠淋巴细胞增殖，提高 n k 细胞活性、血清凝集素水平以及吞噬率和吞噬指数，提高大鼠的血清g s h p x 活性，降低血 清m d a 含量【4 ”j “。 1 4 2 肽的抗氧化活性研究 作为抗氧化剂，蛋白质类物质中最有前途的当属肽类。肽类不仅在油溶体系中有良好的增效 作用，如双肽对a ，6 - 生育酚有增效作用，而且在水溶体系、乳化体系及干燥体系中也有较高的抗 氧化活性，构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸的排列顺序决定着肽的抗氧亿能力。一般说来， 肽类的抗氧化能力大于氨基酸，分子量在2 5 0 0 3 0 0 0 d a 的肽类较理想，以a l a 为n 末端的双肽 中，a l a - t y r 、a l a - h i s 及a l a - t r y 的抗氧化力很强，其他双肽也都比构成它们的氨基酸的抗氧化 能力强。目前已公认的具有抗氧化性的肽有谷胱甘肽和肌肽，最近有研究发现大豆肽也具有明显 的抗氧化作用。 谷胱甘肽【4 ”( g s h ) 是一种由甘氨酸、半胱氨酸和y 谷氨酸基组成的二肽，它广泛分布丁 动植物、谷物、油料种子中。谷胱甘肽在机体的生化防御体系中起着重要的作用，而且具有多方 面的生理功能。其在机体中的抗氧化作用主要表现如下：( 1 ) 谷胱甘肽是体内的自由基清除剂。 它可与许多自由基( 烷自由基、过氧自由基、半醌自由基) 作用；( 2 ) 谷胱甘肽的主要功能是 保护红细胞免受外源性和内源性氧化剂的损害，除去氧化剂毒性。即：2 g s h + h 2 0 2 一 g s s g + 2 h 2 0 ；( 3 ) 谷胱甘肽也能清除脂类过氧化物。即：r o o h + 2 g s h g s s h + r o h + h 2 0 。 肌肽( 1 3 a l a h i s ) 是存在于动物肌肉中的天然抗氧化剂，它能够抑制由金属离子、血红蛋 白、脂酶和单线态氧1 4 7 、0 2 一、o h 一，r 0 0 一催化的脂质氧化。d e c k e r 和c r u m ( 1 9 9 1 年) 4 8 1 , 添加不同浓度的肌肽于猪肉中并煮熟，于4 c 贮存0 、3 、6 、9 d ，发现肌肽具有相同的抗氧化效 果，且浓度越高，其抗氧化效果愈好。d e c k e r 和c r u m 【4 ”( 1 9 9 3 年) 添加不同浓度纯肌肽于绞碎 猪肉中，测其硫代巴比妥酸反应物( t b a r s ) 值，并与三聚磷酸钠( s t p ) ，c t 生育酚及b h t 等抗氧化剂作比较，测其对贮存期间绞碎猪肉的保存效果。结果发现，添加o 5 肌肽即可有效抑 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 制加盐绞碎猪肉的氧化作用：添加1 5 肌肽的抗氧化效果比添加o 5 s t p 或d - 生育酚( 脂肪量 的o 0 2 ) 或b h t ( 脂肪量的0 0 2 ) 之抗氧化的效果佳。c h a n ( 1 9 9 3 年) ”人研究加热( 6 0 及1 0 0 。c ，1 0 m i n ) 、超滤及经离子交换色谱进行去离子等处理对牛肉萃取液中肌肽、铁离子及 血红素含量的影响，结果发现牛肉萃取液在1 0 0 * c 自b 热1 0 m i n ，并经去离子过程，最后用真空加 热干燥( 6 0 0 c 。4 8 m ，所得牛肉萃取液之抗氧化性最强，证实牛肉萃取液具有良好的抗氧化效果， 为良好的天然抗氧化剂。 最近，有研究发现大豆中具有天然抗氧化活性的物质，如异黄酮类、磷脂类、多肽和各种氨 基酸。这些物质有的已从大豆粉中被分离而得，并证实具有一定的抗氧化性1 5 “。h u a - m i n gc h e n 等( 1 9 9 5 年) p 2 1 以5 种不同的酶，m 、n 、p 、s 、胰蛋白酶水解大豆蛋白及b 大豆皂甙，分离 出6 种高活性的抗氧化多肽，并确定了其氨基酸序列。实验指出，这6 种高活性抗氧化多肽都是 水解蛋白酶s 的水解产物，均由5 1 6 个氨基酸残基组成，包括羟脯氨酸、撷氨酸、亮氨酸，n ， 末端包括脯氨酸、组氨酸和色氨酸。蛋白酶s 水解b 大豆皂甙，0 5 h 时达最高活性，以后逐渐 下降。h u a - m i n gc h e n 选用来自芽抱杆菌的蛋白酶，制备具有抗氧化性的短肽。他提出具有抗氧 化性的多肽片段由5 1 6 个氨基酸残基组成，分子量在6 0 0 n 1 7 0 0 d a 范围内。也有研究认为认为分 子量在2 5 0 0 3 0 0 0 d a 的肽类，其抗氧化性较理想。 另外，研究发现马铃薯和蘑菇中含有抑制多酚氧化酶( p p o ) 的寡聚肽。在蜂蜜中也发现一 种肽可抑制苹果片、葡萄汁中的p p o 。这些肽除了抑制p p o 外，可直接与p p o 催化产生醌式产 物反应，从而明显减少食物的酶褐变。 1 4 3 氨基酸的抗氧化活性 氨基酸也可作为抗氧化剂使用，组氨酸和色氨酸在亚油酸、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯中有抗 氧化活性，研究证实o 0 2 的色氨酸和0 1 5 4 ) 2 0 的赖氨酸能够有效的防止奶油的氧化。甲硫 氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸和色氨酸能够有效提高维生素e 的抗氧化活力。碱性氨基酸中 的赖氨酸和精氨酸可与不饱和脂肪酸反应生成盐，因而可抑制不饱和脂肪酸的氧化反应的发生。 半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸能够有效的防止辐射损伤，其中半胱氨酸还是谷胱甘肽与 谷胱甘肽过氧化物酶的必须组成成分。因此对辐射损伤的病人应该多补充含硫氨基酸高的蛋白 质。支链氨基酸能够有效提高机体抗氧化水平，保护体内谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶 的酶活力；并使心肌中谷氨酸、天冬氨酸水平显著升高，血清和心肌中丙氨酸水平显著提高。因 此，对心脏缺血性损伤病人补充支链氨基酸具有一定的防护效果p ”。氨基酸抗氧化剂的缺点就是 氨基酸抗氧化性随反应体系p h 值和氨基酸浓度变化较大，通常p h 值越高氨基酸的抗氧化性越 强，只有一定浓度范围的氨基酸才显示抗氧化活性，过高浓度的氨基酸抗氧化性减弱，甚至表现 出促氧化性o ”1 。 1 5 抗氧化活性体外测定方法研究进展 抗氧化活性测定的根本标准和目的是，最高限度地、客观地反映所测抗氧化剂的抗氧化活。 抗氧化活性体外测定方法的研究中主要为三方面：一是以什么作为基质体系来测定；二二是以什么 方式来加速；三是用什么方法来指示氧化诱导期的终点。这三个要素的任何一要素改变都会使结 8 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 果有所变化。所以在研究物质的抗氧化活性时，应根据物质的特性和抗氧化机理，选择相适应的 测定方法。 抗氧化作用的强弱不仅与抗氧化剂的结构有关，而且与其所处的体系也有很大的关系，不同 的体系中，同种抗氧化剂的活性也不尽相同。在乳浊液中，t b h q 的抗氧化活性最弱，b h t 的活 性最强。而在高温煎炸条件下或在人体中，a 生育酚的抗氧化活性最强。p r y o r ( 1 9 8 5 年) 1 5 ”等 发现尽管维生索c 在水溶液中是一种很好的抗氧化剂，但在模拟生物膜中抗氧化能力却大大降 低，浓度低时甚至会促氧化。1 3 胡萝h 素只有在氧分压较低时表现抗氧化活性，氧分压较高时则 促氧化p 。 体系氧化的过程需要较长时间，如油脂中抗氧化剂的添加量通常为0 0 2 。