（细胞生物学专业论文）人组蛋白乙酰转移酶elp3多克隆抗体的制备及其应用.pdf

摘要 e l p 3 是e l o n g a t o r 复合物中的一个重要的活性亚基，具有组蛋白乙酰转移酶的催化 活性。通过乙酰化特异染色质区组蛋白尾部的赖氨酸残基，e l p 3 参与特异染色质区结 构的改变，为染色质结构调控蛋白提供识别信号，在转录延伸中发挥重要的作用。 为了研究人e l p 3 蛋白的功能，我们用p c r 的方法，以h e l a 细胞系基因组d n a 为模板，扩增出人e l p 3 基因编码区的一部分，将其插入原核表达载体p g e x 一5 x 一1 中构 建e l p 3 的原核表达质粒；转化大肠杆菌b l 2 l 并用i p t g 诱导后使e l p 3 得到高表达。 通过n i ”_ n t a 亲合层析纯化，将得到的e l p 3 蛋白抗原用于免疫家兔。经过1 0 周免疫 后取免疫家兔的血清，经纯化后得到抗e l p 3 抗体。我们用e l i s a 的方法测定了得到的 多克隆抗体的效价，并用w e s t e r nb l o t 的方法证实了e l p 3 抗原和抗体的有效结合。在 e l i s a 方法检测e l p 3 反义寡核苷酸对细胞内源e l p 3 蛋白水平的实验中，我们利用制备 的多克隆抗体对细胞内的e l p 3 蛋白进行杂交，证实e l p 3 反义寡核苷酸能剂量依赖的降 低内源e l p 3 蛋白的水平，说明我们制备的多克隆抗体是有效的。 我们的实验为在人的细胞系中研究的e l p 3 功能提供了重要的实验手段，有助于我 们对其在真核基因表达调控中的作用有新的认识。 关键词：转录延伸；组蛋白乙酰转移酶；e l o n g a t o r 复合物；e l p 3 多克隆抗体 a b s t r a c t e l p 3 ，w h i c hp o s s e s s e st h ea c t i v i t yo ft h eh i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ( h a t ) ，i sa l li m p o r t a n t s u b u n i to fe l o n g a t o rc o m p l e x a sat r a n s c r i p t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r ，i tp l a y si m p o r t a n tr o l e si n r e c r u i t i n g c h r o m a t i nr e m o d e l i n g p r o t e i n s ，a n di nm o d u l a t i n gc h r o m a t i ns t r u c t u r eb y a c e t y l a t i n gt h eh i g h l yc o n s e r v e dl y s i n er e s i d u e si nn t e r m i n a lt a i l so fh i s t o n e s i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o n so fh u m a ne i p 3 ，af r a g m e n to ft h ec o d i n gr e g i o no fh e l p 3 g e n ew a sa m p l i f i e db yp c r f r o mt h eg e n o m i cd n af r o mh e l ac e l l s t h ed n af r a g m e n t w a si n s e r t e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 5 x - - 1a n dt h e nt r a n s f o r m e di n t ot h e e c o l ib l 2 1s t r a i nt oe x p r e s st h e6 x h i s - e l p 3f u s i o np r o t e i na f t e ri n d u c t i o nb yi p t g t h e f u s i o np r o t e i nt h u sp r o d u c e dc a nb er e a d i l yp u r i f i e db yn i 2 + - n t aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h ee l p 3f r a g m e n to b t a i n e dw a su s e da st h ea n t i g e nt oi m m u n i z ear a b b i t i nt h ef i r s t i m m u n i z a t i o n ，e q u a lv o l u m eo ff r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n tw a sm i x e dw i t ha n t i g e ns o l u t i o n t oe n h a n c et h ea n t i g e n i c i t y a f t e rt w om o r et i m e so fs t r e n g t h e n i n gi m m u n i z a t i o n ，t h es e r a n l o ft h er a b b i tw a ss a m p l e da n dp u r i f i e da st h ep o l y c l o n a ta n t i b o d y w ed e t e n n i n e dt h e c o n c e n t r a t i o no ft h ea n t i b o d yb ye l i s aa n du s e di tt oi m m u n o b l o tt h ee l p 3p r o t e i nf o r c o n f i r m a t i o no fi t s a c t i v i t y t h ep o l y c l o n a la n t i b o d y o fe l p 3w a su s e di ne l i s at o i n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo ft h ee x p r e s s i o no fe l p 3p r o t e i ni nh u m a ne m b r y o n i ck i d n e yc e l l l i n e2 9 3 tt r a n s f e c t e db yt h es p e c i f i ce t p 3a n t i s e n s eo l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s t h er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fe l p 3w a sd e c r e a s e di nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r ， s u g g e s t i n gt h a tt h ep o l y c l o n a la n t i b o d yo f e l p 3w a se f f e c t i v e t h ew o r ki nt h i st h e s i sw i l lb eb e n e f i c i a lf o rs t u d y i n gt h ef u n c t i o n so fe l p 3i nh u m a nc e l l i i n e sa n dw i l lc o n t r i b u t et oe l u c i d a t i n gt h em e c h a n i s m so fh i s t o n ea c e t y l a t i o ni ne u k a x y o t i c g e n et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n k e yw o r d s ：t r a n s c r i p t i o n a le l o n g a t i o n ；h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ；e l o n g a t o rc o m p l e x ；e l p 3 ； p o l y c l o n a la n t i b o d y i i v 1 0 1 2 i g i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东：i l t 币范大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 仟何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 日期：逻! ! ! ! ：7 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东i l l s 范大学有权保留并i 句国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：7 ；茏巫主l 指导教师签名： f i 期：臣fj f ：五同 期： 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第一章前言 一、真核生物染色质的结构和染色质重塑 组蛋白的翻译后修饰能引起染色质结构的改变，从而在真核生物基因表达调控中 发挥着重要的作用，这些修饰包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等【1 j 。其 中研究得最清楚的是核心组蛋白尾部的乙酰化。早在三十多年以前，人们就把组蛋白乙 酰化和真核细胞的转录激活联系在一起 2 1 。乙酰化发生在核心组蛋白氨基末端尾部保守 的赖氨酸残基上，例如h 4 的第8 位和第1 6 位赖氨酸，h 3 的第9 位和第1 4 位赖氨酸 等。乙酰化是怎样使d n a 更易于接近转录因子的目前还不十分清楚，多数观点是组蛋 白乙酰化中和了其氨基末端赖氨酸残基的正电荷，削弱了组蛋白与d n a 的亲和力；另 外，组蛋白乙酰化也可能作为一种信号，改变相邻核小体上组蛋白与组蛋白问的作用以 及组蛋白和转录因子问的作用。这其中任何一种改变均可能影响核小体的结构，产生一 个更加丌放的染色质环境，有利于转录因子的结合，从而促进转录口j 。核心组蛋白n 端尾部赖氨酸残基的乙酰化修饰是可逆的，组蛋白去乙酰化酶( h d a c ) 可修饰组蛋白 的去乙酰化，导致染色质集缩，并抑制基因的转录。 ( 一) 染色质的重塑与重塑复合物 在真核生物中，d n a 被装配成染色质形式，通过这种形式限制r n a 聚合酶和它 的辅助因子，使基因处于非活性状态。染色质由d n a 和组蛋白形成的核小体结构组成。 组蛋白能在转录后被修饰，从而消弱核小体抑制转录因子结合的能力。核小体自身受 d n a 前后序列影响，装配成具有不同特征、更加有序的结构。在发育过程中，基因表 达受预先决定的程序启动和关闭，此过程最终导致细胞特异性。这一发育程序通过与受 调控基吲附近特异d n a 序列相结合的转录因子而有序的进行。一个转录因子并不是作 用于每个调控过程，而调控过程中启用的是联合调控机制。在联合调控中，细胞中普遍 存在与细胞类型特异的调控蛋白，参与不同的调控机构，以启动和关闭有关基因表达。 根据协同性和协同作用的原则，一个生物体可以通过启用少数调拧蛋白完成多种调控作 用。 大量研究表明真核生物的染色质结构在转录调控中起重要作用。目前已发现了两 类高度保守的能改变染色质结构的复合物：( 1 ) 组蛋白修饰酶类重塑复合物和( 2 ) 依 赖a t p 的染色质重塑复合物。早在三十多年以前，人们就已经知道组蛋白赖氨酸残基 的乙酰化与转录激活有关。最近的研究表明，许多转录调控子( t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r s ) 是组蛋白乙酰转移酶或组蛋白去乙酰化酶。与d n a 特异结合的转录因子招募组蛋白乙 酰转移酶和去乙酰化酶到启动子处，从而激活或抑制转录。这些结果有力地支持了这样 的结论，即：组蛋白乙酰化和去乙酰化在转录调控中起重要作用。最近也发现了依赖 a t p 的染色质重塑复合物参与转录调控的分子机制。另外，人们已经发现一些依赖a t p 1 的染色质重塑活动与组蛋白去乙酰化酶有关。在到目前为止研究过的复合物中，依赖 a t p 的染色质重塑复合物增强了组蛋白去乙酰化酶的活性。这表明这两类复合物能够协 同作用来完成对转录的精确调控。染色质重塑状态的失调与一些疾病相关，要发现这些 疾病的新疗法，就必须对染色质重塑机制有全面的理解。 1 染色质的高级结构和转录调控的关系 真核生物细胞核中的d n a 被包装成高度有序的染色质结构。染色质的基本结构单 位是核小体。核小体是由1 4 6 b p 的d n a 以环形超螺旋的形式绕组蛋白八聚体1 6 5 周而 形成的。组蛋白八聚体包括h 2 a ，h 2 b ，h 3 和h 4 各两个分子。绕着核小体缠绕构成 1 0 r a n 纤维，再螺旋缠绕成3 0 n m 纤维。这些3 0 r i m 的纤维构成在初期染色质中观察到的 环，然后再盘绕成高度压缩的中期染色质。核小体、连接d n a 和组蛋白h 1 组成了染 色质的基本重复单位。核小体阵列( a r r a y s ) 进一步包装成高度有序的染色质结构。染 色质包装的结果之一是阻止调控转录的d n a 结合蛋白与启动子接近。生化和遗传证据 表明核小体通常是抑制转录的f 4 。然而，染色质结构是动态的，它经历重塑后导致转录 的激活或抑制。近年来人们发现了一类能够通过改变染色质构型来影响( 活化或抑制) 转录的蛋白质复合因子，统称为核小体重塑复合物( n u c l e o s o m er e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 。 目前了解得比较清楚的染色质重塑复合物主要是两大类起不同作用的蛋白质家族，组蛋 白修饰酶类重塑复合物和依赖a t p 的染色质重塑复合物。 2 、组蛋白修饰酶类改构复合物 这类改构因子通过共价修饰组蛋白来影响转录。由于组蛋白被修饰所引起的染色质 结构的改变在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用，这些修饰主要包括甲基化、 乙酰化、磷酸化和泛素化等，其中组蛋白乙酰化尤为重要。 首次观察到转录活性的染色质与组蛋白乙酰化的关系是在三十多年前。组蛋白乙酰 转移酶( h a t ) 和组蛋白去乙酰化酶( h d a c ) 参与决定组蛋白乙酰化状态。h a t 通常 作为多亚基辅激活物复合物的一部分，催化组蛋白乙酰化，导致染色质结构的松散，激 活转录；而h d a c 是多亚基辅抑制物复合物的一部分，使组蛋白去乙酰化，导致染色 质集缩，从而抑制基因的转录。核心组蛋白n 端尾部区域的赖氨酸残基可进行川1 逆的 乙酰化修饰，组蛋白乙酰化中和了其氨基末端赖氨酸残基的正电荷，削弱组蛋白与d n a 的接触；组蛋白乙酰化也可能作为一种信号，改变相邻核小体上组蛋白与组蛋白问的作 用以及组蛋白和转录因子问的作用。这其e i t 任何一种改变均可能影响核小体的结构，产 生一个更加开放的染色质环境，有利于转录因子的结合，从而促进转录口】。组蛋白乙酰 化作用增强了转录因子的结合。近年来的研究发现，许多转录斟子同时具有h a t 的活 性，最早发现的例子是酵母中的g c n 5 蛋白，还有例如，t a f ，1 2 5 0 ( t f i i d 的一个组件) 、 a c t r 、p 3 0 0 c b p 和s r c l 。 h a t 家族被分为两个种类型， i a t - a 和h a t - b ，前者存在于核中并参与基因表达 调控，后者存在于细胞质中并参与新合成的核心组蛋白的乙酰化。根据这些酶的结构和 性质，可分为几个人的家族，如g n a t 家族( g c n 5 一r e l a t e dn a c e t y l t r a n s f e r a s e ) 、m y s t 家族( m o z ，y b f 2 s a s 3 ，s a s 2 和t i p 6 0 ) 和p 3 0 0 c b p 等。研究表明组蛋白乙酰转移酶 及其复合体除具有调控基因转录起始的功能外，还参与了细胞周期调控、d n a 复制、 修复以及染色体组装等许多重要的生理过程【6 。 3 依赖a t p 的改构复合物( a t p d e p e n d e n tr e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 依赖于a t p 的改构复合物是一类能够改变核小体结构的蛋白质复合物，它们通过 a t p 水解提供动力，实现对染色质的改构口】。其中有的被证实可以通过增强核小体d n a 与转录装置的可接触性而激活转录。所有这些复合物都含有一个具有d n a 激活的a t p 酶活性部位( d n a s t i m u l a t e da t p a s e ) 。a t p 是核小体在体外重组所必需的，它能增强对 转录因子和核酸酶的可靠近性。 这类因子包括s w i s n f ，r s c 8 | ，n u r f ，c h r a c ，n u r d 等等，图1 1 所示。 图1 1 依赖a t p 的染色质改构复合物嘲 这些因子可被分成三个家族：f 1 ) s w i s n f 家族。其中酵母中包括了两类即s w i s n f 和r s c ，这些含有s w l 2 s n f 2a t p 酶亚基的复合体一般较大，由1 1 - 1 5 个不同的亚基 组成。而在人和果蝇中它的同源物均有9 1 0 个亚基。( 2 ) i s w i 家族。它们都有i s w i 亚基作为它们的a t p 酶亚基，这类复合体较小，一般由2 5 个亚单位组成。( 3 1 另外， 最近从人中分离得到了含有染色质改构和去乙酰化酶活性的n u r d 。 s w i s n f 能够以很低的亲和力( n a n o m o l a ra f f i n i t y ) 与d n a 和核小体结合，并利用 其水解a t p 产生的能量去减弱核小体中d n a - 组蛋白的结合力。这时，尽管核小体的整 体结构只发生了微小的变化，但却使核小体部位的d n a 同转录活化因子的亲和力增加 了3 0 倍以上【l0 。其次，发现这些改构复合物在增加d n a 对其他蛋白质的可接触性的 同时，似乎并不去除核心组蛋( c o r eh i s t o r i e s ) 。这暗示它们或是通过与八聚体f o c t a m e r ) 核心保持接触来破坏d n a 一组蛋白的结合，或是通过某种酶促反应减弱了核小体中 d n a 组蛋白的亲和力或改变了d n a 链在核小体上的缠绕途径来达到这一目的的i l “。 剥于这类复合物染色质改构的机制又是怎样的呢? 有关r s c 复合体的研究表明， r s c 复合体能催化组蛋白八聚体由核小体向裸d n a 转变。r s c 依赖于a t p 使单一核 小体内d n a 成环，并使一段d n a 上的顺式八聚体转移到另一段d n a 上。而含i s w i 的复合体可通过不同的机制行使其功能，c h r a c 和n u r f 都能促进核小体单体沿d n a 滑动，而不破坏核小体向活性d n a 的转变。这种滑动将核小体从特定的d n a 位点移 丌，使转录因子得以靠近。近期有人提出了解释依赖a t p 改构复合物作用的2 种方式： ( 1 ) 改构复合物水解a t p 产生能量使其在d n a 链上滑动的同时使d n a 与核小体产生 位移( t r a n s l o c a t i o n d e p e n d e n tr e m o d e l i n g ) 女l l 图1 2 ( a ) ；( 2 ) 改变组蛋白核心或d n a 或者 两者同时构像改变，从而改变d n a 组蛋白的接触方式( r e m o d e l i n go fo c t a m e r s t r u c t u r e ) 。如图1 1 2 ( b ) 所示。 图1 2 依赖a t p 的改构复合物作用方式1 9 ( 二) 组蛋白密码假说( h i s t o n ec o d eh y p o t h e s i s ) 核小体的存在阻碍了转录起始复合物的装配和r n a 聚合酶的移动。近些年来，染 色质重塑酶家族已被鉴定，它们的作用是改变组蚩白d n a 之间的相互作片j ，使转录变 得容易或抑制转录。然而，这些发现仍然使核小体处于一个被动的转录抑制者的角色。 最近，对于作用于染色质的其它酶的性质及其影响的研究使核小体变成一个令人兴奋的 生动角色。我们已知组蛋白n 末端尾部是暴露在核小体表而的，选择性的氨基酸残基 要经过多种酶的催化进行翻译后修饰。这包括赖氨酸的乙酰化，丝氨酸的磷酸化以及赖 氨酸和精氨酸的e p 旗化。组蛋白共价修饰和相互作用区的类型和方式如图1 | 3 所示【】。 这些修饰的功能，实际上是尾部本身的功能是目前关注的焦点。中心问题是对一种可能 性的探讨，即核小体以及它被修饰的尾部区域，不仅仅是一个微1 ；足道的d n a 包装工， 而且也是表观遗传信息的携带者。这种信息既决定了基因是怎样表达的，也决定了它们 的表达方式是怎样在一代细胞和下一代细胞之问保持的。 4 图1 3 组蛋白共价修饰和相互作用区的类型和方式【1 2 】。 ( a ) 修饰的类型：包括赖氨酸( k ) 的乙酰化，丝氨酸( s ) 的磷酸化，精氨酸和赖氨 酸( r 和k ) 的甲基化和赖氨酸( k ) 的泛素化。与特异修饰相互作用的两类区域是与 乙酰化的赖氨酸相互作用的溴区( b r d ) ，与甲基化的赖氨酸相互作用的染色质区 ( c h r d ) 。( b ) 修饰的方式。成对的修饰，改变的序列与转录激活或抑制有关。 1 表观遗传密码 转录活跃状态的染色质富含乙酰化的组蛋白，而转录沉默的组成型和兼性异染色质 则处于未乙酰化状态，这提示我们组蛋白尾部修饰是和染色质特异功能状态相关的。例 证之一是对果蝇多线染色体的研究。在哺乳动物中，为了使雌性和雄性x 染色体连锁 基因的表达量平衡，雌性细胞使两个x 染色体之一失活。而果蝇则使雄性的x 染色体 连锁基因表达量加倍。在高度活跃转录的雄性x 染色体中，组蛋白h 4 的1 6 位赖氨酸 残基是乙酰化的。另外，果蝇组蛋白h 4 的1 2 位赖氨酸在中心异染色质区保持乙酰化 状态，而第5 ，8 ，1 6 位的赖氨酸都是末乙酰化的【”】。这些观察提示我们组蛋白n 末端 尾部组成了核小体的表面标记，能以依赖修饰的方式被非组蛋白识别，从而改变染色质 的功能状态。 组蛋白尾部携带的表观遗传信息量是巨大的。例如，4 种核心组蛋白有5 0 种不同 的乙酰化异构体( h 2 b ，h 3 和h 4 各有1 6 种，h 2 a 有2 种) 。这些异构体能通过选择性 的赖氨酸和精氨酸( h 3 和h 4 ) 的甲基化和丝氨酸( h 3 ，h 4 ，h 2 b ) 的磷酸化被进一步修 饰。另外，甲基化可以涉及到一个，两个或三个甲皋基团的添加，还有其它修饰，如泛 素化和a d p 一核糖基化。可能的组蛋白异构体合计为几万甚至几十万，它们携带尾部修 饰的不同组合，能标记核小体表面。基于此最近s t r a h l 和a l l i s 提出了“组蛋白密码 ( h i s t o n ec o d e ) 假说”，即多种组蛋白修饰以组合的或先后发生的方式作用于一个或多 个组蛋白尾部，导致特异的下游功能【l4 j 。这些尾部修饰组成了一种组蛋白密码或表观遗 传密码，密码的建立和维持是通过尾部修饰和去修饰酶，而密码的阅读是通过非组蛋白。 e 组蛋白密码假说的一个重要提示是单独的增强子d n a 不足以部署基因表达的复杂 方式。增强子d n a 上接受的多种转录因子结合的信息介导了染色质修饰因子和其它转 录复合物的招募，产生了另外的调控信息。这种另外的信息以乙酰化，磷酸化和或甲 基化的特异方式被印在组蛋白的n 一末端，这样扩展了d n a 密码的信息。d n a 密码和 组蛋白密码的一个重要区别是前者是永久的而后者是暂时的。另外，d n a 密码包含所 有产生组蛋白密码的信息，也就是说，信息从增强子流到附近的核小体而不是相反的方 向。仅仅在这些修饰是特异的，并且仅仅在它们以一种特异的方式被翻译并产生不同的 生物功能时组蛋白密码才是有意义的。至少在酵母中，当移走修饰酶( 组蛋白乙酰转移 酶和去乙酰化酶) 干扰某一特定区域的组蛋白乙酰化平衡时，组蛋白乙酰化的方式迅速 地恢复到它们的稳定状态水平。 2 组蛋白修饰的动力学 染色质中组蛋白n 一末端尾部修饰的进行和维持是通过修饰酶和去修饰酶家族的 作用。例如，大多数组蛋白的乙酸基f 在经历一种持续的乙酰化和去乙酰化的循环，半 衰期从几分钟到几小时不等。这样，由于h a t s 和h d a c s 的作用，不同组蛋白中特定 赖氨酸的乙酰化水平可能处于一种稳定的状态。虽然这需要细胞不断提供能量，但是它 有利于那些需要迅速上下调控的基因的表达，例如那些应答激素信号或生长因子刺激的 基因。移走或抑制h a t s 或h d a c s 将产生乙酰化状态的迅速改变，从而改变转录或转 录潜能。相反，那些长时期稳定表达的基因，组蛋白修饰的方式是稳定的，这是通过移 走( 或抑制) 定位于特定基因组区域的h a t s 或h d a c s 而实现的。 3 组蛋白密码的建立 在多种尾部修饰中，组蛋白磷酸化的建立方式可能是相对简单的，因为只有几个残 基参与磷酸化。然而，同样的修饰会产生两种不同的功能。h 3 s 1 0 的磷酸化，精确地定 位于调控区，伴随着瞬时早期基因的激活，而整个基因组中同样位点的的磷酸化恰恰发 生在细胞有丝分裂之前。每个例子中都有不同的激酶参与。奇怪的是同样的修饰既与有 丝分裂过程( 染色质集缩和转录沉默的时期) 有关，又与基因诱导的过程有关。也许 h 3 s 1 0 磷酸化参与从有丝分裂到g 1 期的染色质去集缩和转录的重新起始过程【l5 ，。 理论上，特异乙酰化方式的建立能反映h a t s 或h d a c s 的特异性。h a t s 和h d a c s 都组成了大的酶家族，它们经常作为多蛋白质复合物的催化亚单位，这些复合物中的其 它成员具有基因组定位和其它的功能。体外分析表明，大多数h a t s 具有特异性或至少 是底物的优先选择性。最极端的例子是果蝇的m o f ，它特异地乙酰化雄蝇x 染色体h 4 的第1 6 位赖氨酸【1 ”。目前检测到的h d a c s 对于单个组蛋白或残基虽然有某种优先选 择性，但是具有较小的特异性。对于多肽，整个组蛋白或染色质，h a t s 和h d a c s 的 催化活性都不同。 组蛋白甲基转移酶( h m t s ) 对赖氨酸和精氨酸都是特异的，并且是最近的两篇极 好的综述的主题1 8 旧 。共有五种精氨酸h m t s 。所有的五种i - i m t s 都有相同的高度保二r 的催化区和s 腺苷甲硫氨酸结合区。到目前为止研究过的酶对于特异组蛋白精氨酸有 不同的特异性。所有五种精氨酸h m t s 都能转移一个或两个甲基基团到单个的精氨酸 上，但是它们不同的是这两个甲基基团是对称分布的还是不对称分布的。 赖氨酸h m t s 都包含一个s e t 区，虽然不是所有s e t 区蛋白都有h m t 活性。数 据库搜索表明人有7 3 个s e t 区蛋白，其中有三分之一被鉴定，并且根据序列同源性和 与酵母s e t 区蛋白的关系被分成四个家族。有几种有确定的h m t 活性，而且有一些是 高度特异的。例如，s u v 3 9 家族的四个成员只甲基化h 3 k 9 。重要的是，这种特异性与 一种特异的染色质状态相关，即异染色质的形成。 ( 三) 组蛋白乙酰转移酶 1 组蛋白乙酰化 人们很早就已经注意到乙酰化与基因活化有着密切的关系。h e b b e s 等人【2 0 】发现乙 酰化的组蛋白主要分布在对d n a s e l 敏感的染色质区。组蛋白的高乙酰化是活跃转录的 标志【2 1 。组蛋白的乙酰化过程是一个与基因活性诱导和抑制密切相关的动态过程，高乙 酰化标志活跃转录而低乙酰化则与转录抑制相关 2 1 , 2 2 】。研究表明组蛋白乙酰基转移酶及 其复合体除具有调控基因转录起始的功能外，还参与了细胞周期调控、d n a 复制、修 复以及染色体组装等许多重要的生理过程。组蛋白乙酰化参与基因的转录延伸过程。 2 组蛋白乙酰转移酶及其复合体 1 9 9 6 年，b r o w n e l l 等人【2 2 1 首次从四膜虫核内分离提取了组蛋白乙酰转移酶g c n 5 ， 随后，研究者们从酵母【2 ”，果蝇【24 1 ，玉米等生物体中分离得到了不同的乙酰转移酶。 根据组蛋白乙酰转移酶( h a t ) 的来源和功能将其分为两类：a 型和b 型h a t 。a 型 h a t 位于核内，其催化的乙酰化事件与转录相关【25 】；b 型h a t 位于细胞质内，催化的 乙酰化事件与新合成的组蛋白h 4 从胞质转运到核内，并沉积在新复制的d n a 上的过 程有关1 2 6 j 。组蛋白乙酰转移酶按其结构特点可分为以下不同的家族：g n a t 超家族、 m y s t 家族、t f m c 、核受体共激活因子、t a f t t 2 5 0 和p 3 0 0 c b p 。在已经鉴定和分离的 组蛋白乙酰转移酶中，人们发现许多重组的组蛋白乙酰转移酶在体外实验中只能够乙酰 化游离的组蛋白，对组装在核小体中的组蛋白却没有乙酰化作用。这些现象表明在体内 还存在其他因子参与核小体组蛋白的乙酰化。它们通过与组蛋白乙酰转移酶的相互作 用，来调节酶与底物的特异性识别。组蛋白乙酰基转移酶及其复合物在真核基因的转录 调控中起着重要作用，它们参与了生物体内许多与基因转录调控相关的重要生理过程， 如：d n a 复制、修复，染色体组装以及细胞周期调控等1 2 ”。其外，乙酰化与肿瘤的形 成特别是白血病的形成有关，对基因错误的乙酰化是导致肿瘤形成的原因之一【2 。 表1 1h a t 家族及其转录相关的功能【2 9 体内的大多数乙酰化反应足大型多蛋白复合物共同作用的结果，通常这些大的复合 物在分子量上以兆计算。g n a t 相关的和m y s t 相关的组蛋白乙酰转移酶复合物的简 介见表1 2 ，表1 3 3 0 1 。 表1 2g n a t 相关的组蛋白乙酰转移酶复合物”o b r d ：溴区 表1 3m y s t 相关的组蛋白乙酰转移酶复合物【3 0 】 c h d ：染色区 e l o n g a t o r 复合物是与磷酸化的r n a 聚合酶i i 紧密结合的具有h a t 活性的六亚基 复合物，其催化亚基e l p 3 是g n a t 家族的一员，作为r n a 聚合酶全酶的一部分直 接参与转录的延伸过程。e l o n g a t o r 既能以结合形式存在于磷酸化的延伸形式的r n a p i i 中，又可以游离存在。这一性质暗示e l o n g a t o r 复合物可以被募集至延伸中的r n a p i i 上，以乙酰化被转录染色体中的组蛋白。需要特别指出的是，由于e l p 3 和核中存在的 自由h d a c 相互竞争，持续的转录进程对于保持组蛋白的乙酰化状态非常重要。从根 本上况，组蛋白是否维持乙酰化状态取决于结合于磷酸化的延伸形式的r n a p l l 上的 h a t 活性与游离的h d a c 活性之问的动力平衡关系如何。一旦由启动子决定的转录起 始信号减弱，导致在基因上通行的r n a p i i 减少，上述平衡将移向有利于h d a c 活性 的一边。随后组蛋白尾部的去乙酰化作用将导致染色质结构迅速地恢复成为阻遏构象。 近来的研究还发现n u a 3 复合体中的催化哑基s a s 3 可以介导n u a 3 和高度保守的 s p t l 6 蛋白的相互作用，而后者是酵母c d c 6 8 p o b 3 复合体和哺乳动物f a c t 复合体的成 员。体外实验结果表明f a c t 通过对组蛋白h 2 a 和h 2 b 的瞬间移动而有利于转录的延 伸，由此推测s a s 3 是在f a c t 与r n a 聚合酶i i 复合体在染色质上滑动的同时，对染 色质进行乙酰化的。 3 组蛋白乙酰转移酶及其复合物的生物学功能 虽然最初研究者发现组蛋白乙酰化与转录激活密切相关，但是最近的研究表明组蛋 白乙酰化以及组蛋白乙酰转移酶还有更加广泛的多种多样的功能。组蛋白乙酰转移酶复 合物参与转录激活、基因沉默、细胞周期调控、d n a 复制、修复以及染色体组装等许 多重要的生理过程 3 1 1 。 1 ) 参与基因的转录激活 多种基本转录元件的组分，如t a f i l 2 5 0 ，t f i i i c 9 0 11 0 2 2 0 等，本身就具有组蛋白 乙酰转移酶的特性，能通过溴区结构起到将t f i i d 复合体定位到靶基因肩动子上的作 用，有利于转录的起始和激活。p c a f 能在体外乙酰化组蛋白，也能乙酰化核小体内的 组蛋白，它的作用位点主要是组蛋白h 3 的1 4 位赖氨酸( k 1 4 ) ，而对组蛋白h 4 的k 8 作用较弱 3 “。肌生成过程巾p c a f 能以h a t 依赖的形式发挥其辅激活作用 3 3 1 ，刺激转 录的进行p 。p 3 0 0 和c b p 是一类具有乙酰化酶活性的辅激活因子。c b p p 3 0 0 能通过 9 直接( 或间接) 与转录因子，如c r e b ，核激素受体，c f o s ，c j u n 和c m y b 等结合诱 导特异的转录口”。 除了被转录因子招募到特异基因上发挥转录辅激活作用以外，p c a f 和c b e r ，3 0 0 还可以通过对特异转录因子或基本转录元件的乙酰化作用来调控它们的活性，影响基因 的转录过程m j ”。 2 ) 参与基因的转录延伸 e l p 3 是g n a t 家族的一员，也是r n a 聚合酶l i 紧密结合的三个转录延伸复合物中 的亚单位，作为r n a 聚合酶i i 全酶的一部分直接参与转录的延伸过程 3 8 。重组的e l p 3 能乙酰化所有四种核心组蛋白，说明乙酰化对基因的转录延伸起到重要的作用 3 9 】。n u a 3 复合物中的催化亚基s a s 3 能与s p t l 6 蛋白相互作用，s p t l 6 是酵母c d c 6 8 p o b 3 复合物和 哺乳动物f a c t 复合物的成员，体外实验的结果表明f a c t 能通过对组蛋白h 2 a 和h 2 b 的瞬间移动而有利于转录的延伸，暗示s a s 3 是在f a c t 与r n a 聚合酶i i 复合物在染 色质上滑动的同时，对染色质进行乙酰化的 4 “。 3 ) 参与细胞周期进程 哺乳动物细胞中，t a f i l 2 5 0 是t f i i d 的最大的亚基，近来的研究表明t a f i l 2 5 0 的 h a t 活性与细胞周期调控有关。温度敏感型突变小鼠细胞系t s l 3 在限定温度条件下， 细胞生长停滞在g 1 期并出现细胞凋亡的现象，基因芯片技术分析结果表明t a f i l 2 5 0 的h a t 活性参与了细胞周期调控和d n a 合成相关基因的表达【4 ”。转录复合物起始模型 认为组蛋白尾部能阻碍t b p 与t a t a b o x 的结合，t a f i l 2 5 0 能乙酰化t a t ab o x 处的组 蛋白，使t b p 易于结合t a t ab o x ，从而促进转录起始复合物的形成 4 。 e s a l 也是细胞周期过程中必需的h a t 。体外重组的e s a l 能乙酰化组蛋白h 2 a 、h 3 和h 4 ，对h 4 的k 5 有较强的乙酰化活性【4 3 】。体内实验证实缺失e s a l 能使细胞周期停 滞在g 2 m 期】，但有关的机理尚不清楚。 4 1 参与染色体组装 参与染色体组装的乙酰化酶主要是b 型h a t 蛋白h a t l 4 ”。h a t l 参与的是新合成的 组蛋白的加工过程，在细胞质中进行。体外实验中h a t i 可以乙酰化组蛋白h 4 的k 1 2 1 4 6 j ， 这是新合成的组蛋白的主要乙酰化位点【4 7 1 。重组的h a t l 存在于一个多亚基复合物中。 其成员h a t 2 是r b a p 4 6 4 8 的同源物，与组蛋白 王4 紧密结合；c a f i 亚基参与染色质的组 装。近来发现h a t l 和h a t 2 也具有核内h a t 活性，可乙酰化游离的组蛋白h 4 ，推测h a t l 和h a t 2 可能以一种更直接的方式参与染色质的组装过程 48 1 。 5 1 参与基因沉默 在酵母中，s a s 2 和s a s 3 参与转录沉默的调控。s a s 3 是与沉默相关的酵母复合物 m y s t 的成员，与s a s 2 有很高的同源性。在体外实验中s a s 3 能强乙酰化游离组蛋白 h 3 、h 4 和h 2 a 4 9 j ，是h 3 乙酰化复合物n u a 3 的催化亚基。s a s 2 的乙酰化活性仍未证 实，这可能是由于其催化活性需要其他的亚基的作用或需体内修饰才能发挥其催化活 性。s a s 2 对于基因沉默同时具有两种相反的调控作用，在h m l 处促进沉默，而在h m r 处抑制沉默 5 0 1 ，其双突变导致交配型的缺失。s a s 3 的突变造成h m r 位点的部分缺失， 但不影响端粒的沉默。转录沉默通常被认为与乙酰化水平的降低有关，但这两种h a t 对转录沉默是正向调控的，有关的机制还需进一步的实验依据证实。 6 ) 参与信号转导过程 甾类受体辅激活物1 ( s r c 1 ) 的c 一术端具有h a t 活性，可以乙酰化游离的和核小 体中的组蛋白h 3 和h 4 【5 “。s r c l 可以激活核受体( 如黄体酮受体、糖皮质激素受体、 雌激素受体和甲状腺激素受体等) 的配体依赖活性 5 ，在信号转导过程中的作用十分重 要。s r c 一1 既可与c b p p 3 0 0 又可与p c a f 相互作用，这说明多个h a t 参与了激素信 号介导的基因转录调控口”。a c t r 也是一种乙酰转移酶，它的乙酰化结构域位于蛋白的 c 末端。除可与多个核激素受体相作用外，还具有反式激活作用，说明乙酰化酶可以直 接控制信号转导过程中的关键步骤。 7 ) 参与d n a 拼接、复制和损伤后修复 免疫球蛋白和t 细胞受体( t c r ) 的产生是由于免疫球蛋白基因和t c r 基因拼接 的结果。r a g l 和r a g 2 蛋白介导了基因片段的断裂与信号序列r s s ( r e c o m b i n a t i o ns i g n a l s e q u e n c e s ) 的重组。体外实验中r s s 处核小体的组装可以阻碍r a g 介导的基因片段的断 裂，组蛋白h 3 的乙酰化修饰参与了v ( d ) j 的蘑组过程【5 4 1 ，根据推测是通过破坏染色体 的高级结构来参与这一调控过程的。 h b 0 1 可乙酰化游离的组蛋白h 3 和h 4 ，能与o r c 复合物的亚基o r c l 发生相互 作用。o r c l 能结合d n a 复制原点并起始复制 5 “，h b 0 1 可能参与了这一生理过程。 t i p 6 0 ( t a t i n t e r a c t i v ep r o t e i n ，6 0 k d ) 是m y s t 蛋白家族的一员，可在体外乙酰化游离 的h 2 a 、h 3 和h 4 。有实验证实t i p 6 0 复合物具有3 5 d n a 解旋酶活性，缺失t i p 6 0h a t 活性的h e l a 细胞在v 射线辐射后不能进行双链d n a 的修复，目前这一调控过程的分 子机制还不十分清楚，据推测乙酰化修饰可能使d n a 修复系统更易接近修复位点，也 可能是t i p 6 0 对d n a 修复蛋白进行乙酰化修饰的结果【5 “。 8 ) 剂量补偿 果蝇的剂量补偿实验中m o f 位点的突变会导致雄性果蝇致死，死亡的果蝇组蛋白 h 4k 1 6 不能被乙酰化。体外实验证实重组的m o f 可强烈乙酰化h 4 ，说明果蝇的剂量 补偿与m o f 的乙酰化作用有直接的关系【5 ”。 9 ) 基因组整体水平的乙酰化 v o g e l a u e r 等人在酵母中利用免疫共沉淀技术发现，缺失某r 一特定的组蛋白乙酰转移 酶或去乙酰化酶都会影响基因组中任一检测位点的乙酰化水平 5 8 1 。他们认为酵母中存在 着基因组整体水平的乙酰化。b e r g e r 等人认为这种基因组整体水平的乙酰化可能基于以 下两个原因。一个是整体的乙酰化能使基因迅速的丌启和关闭，使生物体对外界环境的 刺激有快速而敏感的反应；第二是基因组整体水平的乙酰化可能与d n a 的复制与修复 有关。在进行d n a 复制时需要松散的染色体结构，而这一结构的形成与基因组的整体 乙酰化水平有关口。 二、e l o n g a t o r 复合物及e l p 3 的功能 早在1 9 9 2 年，t r a v e r s 就推测在r n a pi i 控制的以染色质为模板的转录延伸过程