（农产品加工及贮藏工程专业论文）酶解罗非鱼碎肉制备生化试剂蛋白胨的工艺研究.pdf

中文摘要 本文以冷冻罗非鱼片力l - r - 过程的碎鱼肉为原料，采用a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、木瓜 蛋白酶、复合蛋白酶、x l , j 球蛋白酶、肤蛋白酶对罗非鱼碎肉进行酶解，对5 利一不同蛋 j 聃水j 8 j l ：岁：小鱼碎i 勾制备! i 三化i j 剂m j 胍的工艺条件进行研究。结果袭叫： l 、采用单因素试验获得各种酶的条件参数和最佳使用区域，并筛选出a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶为水解效果较好的酶。对a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、复合蛋白酶进行单酶水解的正交试验，确定a s 1 3 9 8 中性蛋白酶酶解罗 非鱼下脚制备蛋白胨的最佳工艺条件为：温度5 5 ，p h 值为7 5 ，水解时间为4 h ， 加酶量为7 5 0 u g ；木瓜蛋白酶酶解罗非鱼下脚制备蛋白胨的最佳工艺条件为：温度 为6 5 c ，p h 值为6 5 ，水解时问为4 h ，加酶量为1 2 5 0 u g ：复合蛋白酶酶解罗非鱼 下脚制备蛋白胨的最佳工艺条件为：温度5 0 c ，p h 值为7 0 ，水解时间为4 5 h ，加 酶量为8 5 0 u g 。 2 、对a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶酶解罗非鱼碎肉制备蛋白 胨的效果进行比较，结果表明：罗非鱼碎肉分别经a s 1 3 9 8 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶 酶解，蛋白胨得率较高，分别为1 3 2 5 和1 2 6 3 ；并且冻干后的色泽良好。因此选 用a s 1 3 9 8 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双酶水解试验。 3 、选用a s 1 3 9 8 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同酶解罗非鱼碎肉制备蛋白胨，得 到罗非鱼碎肉酶解条件的优化数学回归方程为：y = 1 3 5 0 6 1 6 0 2 0 6 7 5 4 x 1 + 0 8 0 2 8 9 x 2 + 1 2 9 4 7 4 6 x 3 0 6 5 1 2 3 1 x l z - 0 8 1 2 5 x i x 2 0 0 2 7 5 x i x 3 0 1 2 6 2 0 4 ) ( - 0 3 5 2 5 x 2 x 3 - 0 3 1 0 0 5 2 x 3 z 。 此模型在实验范围内能较准确预测蛋白胨得率。通过贡献率法计算表明，在实验范围 内各因子对蛋白胨得率作用的大小依次为加酶量 酶解时间 酶解温度：利用岭嵴分 析可知，酶解罗非鱼碎肉制备蛋白胨的最适工艺条件为：温度为5 6 5 ，时间为4 7 h ， 加酶量为117 4 0 u g 。 4 、对a s 1 3 9 8 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的双酶水解液进行氨基酸组分的分析， 结果表明，水解液中的必需氨基酸种类齐全且含量高，必需氨基酸占氨基酸总量的 5 5 0 9 。罗非鱼碎肉双酶酶解后的游离氨基酸成分具有较高的营养价值。 关键词：罗非鱼碎肉；酶解；蛋白胨 福建农林人学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i s p a p e rs t u d i e dp r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fb i o c h e m i c a lr e a g e n t - p e p t o n eb y e n z y n o l y s i sf i s hs u r i m i ，w h i c hw a sp i c k e do u ti nt h ep r o c e s so fc h i l l e dt i l a p i as l i c e s e n z y m a t i ch y d r o l y s i s c o n d i t i o n so fa s 1 3 9 8n e u t r a l p r o t e a s e ，p a p a l n ，p r o t a m e x ， f l a v o u r z y m ea n dt r y p s i nw e r es t u d i e d t h er e s e a r c hc o n t e n t sa n d r e s u l t si nd e t a i l ss h o w e d a sf o l l o w s ： 1 s i n g l ef a c t o rt e s t sw e r ea d o p t e dt oo b t a i nc o n d i t o n a lp a r a m e t e r sa n do p t i m u n s c o p ef o ra p p l i c a t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a ta s 13 9 8n e u t r a lp r o t e a s e ，p a p a i n ，p r o t a m e xw e r e r a t h e ra p p r o p r i a t e o p t i m i z a t i o nh y d r o l y s i sc r a f tc o n d i t i o no fa s 1 3 9 8n e u t r a lp r o t e a s ew a s a sf o l l o w i n g ：t e m p e r a t u r ew a s5 5 c ，p hv a l u ew a s7 5 ，t i m eo fh y d r o l y s i sw a s4 h ，i n p u t a m o u to fe n z y m ew a s7 5 0 u g o p t i m i z a t i o nh y d r o l y s i sc r a f tc o n d i t i o no fp a p a l nw a sa s f o l l o w i n g ：t e m p e r a t u r ew a s6 5 c ，p hv a l u ew a s6 5 ，t i m eo fh y d r o l y s i sw a s4 h ，i n p u ta m o u t o fe n z y m ew a s12 5 0 u g o p t i m i z a t i o nh y d r o l y s i sc r a f tc o n d i t i o no fp r o t a m e xw a sa s f o l l o w i n g ：t e m p e r a t u r ew a s5 0 c ，p hv a l u ew a s7 0 ，t i m e o fh y d r o l y s i sw a s4 5 h ，i n p u t a m o u to fe n z y m ew a s8 50 u g 2 t h r o u g hc o m p a r i n gt h ee f f e c to ft h ep e p t o n eb yd i f f e r e n te n z y n o l y s i st i l a p i a s u r i m i ，r e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ep e p t o n ey i e l dw a sm o r eh i g h e rw h e nh y d r o l y z e db y a s 1 3 9 8n e u t r a lp r o t e a s ea n dp a p a i n ，w e r e1 2 6 3p e m e n ta n d1 3 2 5p e r e e m a n dt h ec o l o r o ff r e e z e - d r yp r o d u c tw a sb e t t e r 3 r e s u l t so fc e n t r a lc o m p o s i t eo r t h o g o n a ld e s i g no fd u a le n z y m a t i ch y d r o l y s i st e s t s s h o w e d ：t h eo p t i m i z e de q u a t i o ni s ：y = 1 3 5 0 6 1 6 0 2 0 6 7 5 4 x l + 0 8 0 2 8 9 x 2 + 1 2 9 4 7 4 6 x 3 0 6 5 1 2 3 1 x 1 2 - 0 8 1 2 5 x l x 2 0 0 2 7 5 x l x 3 0 1 2 6 2 0 4 x 2 2 - 0 3 5 2 5 x 2 x 3 0 3 1 0 0 5 2 ) ( 3 2 t l l i sm o d e l w a sa b l et op r e d i c tt h ey i e l do fp e p t o n ei nt h et h es c o p eo ft h ee x p e r i m e n t t h em e t h o do f c o n t r i b u t i o nr a t es h o w e dt h a t ：t h er o l eo ff a c t o r so nt h ey i e l do fp e p t o n ef o l l o w e db y ：i n p u t a m o u to fe n z y m e t i m eo fh y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e r i d g ea n a l y s i ss h o w e dt h a t o p t i m i z a t i o nh y d r o l y s i s c r a f tc o n d i t i o no fd u a le n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a sa sf o l l o w ： t e m p e r a t u r ew a s5 6 5 c ，t i m eo fh y d r o l y s i s 4 7 h ，i n p u ta m o u to fe n z y m ew a s117 4 o u g 2 福建农林火学硕士学位论文 4 a m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n a l y s i so fd u a le n z y m eh y d r o l y s a t ew a sh o l d r e s u l t s h o w e dt h a t ：t h e r ew e r ef u l lr a n g eo fe s s e n t i a la m i n oa c i d sa n dh i g hc o n t e n to fe s s e n t i a l a m i n oa c i d si nt h eh y d r o l y z a t e a n de s s e n t i a la m i n oa c i d sa c c o u n t e df o r5 5 0 9 o ft o t a l a m i n oa c i d s f r e ea m i n oa c i d so ft i l a p i ad u a le n z y m eh y d r o l y s a t eh a dah i g hn u t r i t i o n a l v a l u e k e yw o r d s ：t i l a p i as u r i m i ，h y d r o l y s i s ，p e p t o n e 3 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的 研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的 地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献 的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行 为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：1 ；咨饧日期：w 驴7 6 2 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有 权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。0 不保密，本论文属于不保密。 口 、 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 季够铴嘞 指导教师亲笔签名：落衙衙 日期： 6 乎 6 矿 嗲 7 咖 妒 福建农林大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论弟一早珀下匕 蛋白胨( p e p t o n e ) 是蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种示、胨、肽、氨基 酸组成的水溶性混合物。它是微生物培养基最主要的基础成分，是微生物赖以生存、 生长发育和繁衍后代的主要营养氮源。自n a e g e l i ( 1 8 8 0 年) 首先将其应用于细菌培 养获得良好培养效果之后，蛋白胨便成为许多微生物培养基的重要组分。今天它已是 医药生产、商品检验、卫生防疫、临床化验、环境检测、疫苗、毒素和其他生物制品 生产和微生物菌种培养、分离、鉴别等研究不可缺少的生化试剂。蛋白胨常用酸水解、 碱水解和酶水解等方法制备，其中酶水解因操作简便、成品质量稳定、品质优良而逐 渐取代了酸碱等化学法。生产蛋白胨的常用原料是畜骨，但是可供生产蛋白胨的原料 甚多：畜骨、牲畜血液、鱼类脏器、生化药厂提取脏器药物后的残渣、胶厂生产明胶 后的胶渣、骨粒生产厂的蒸骨水以及鱼粉等0 , 2 j 。 1 罗非鱼资源及其利用概况 罗非鱼( t i l a p i a ) ，俗称非洲鲫鱼，属于鲈形目、鲈形亚目、鲡鱼科、罗非鱼属。 罗非鱼是一群中小型鱼类，它的外形、个体大小有点类似鲫鱼，鳍条多棘似鳜鱼。由 于罗非鱼具有生长快、食性杂、病害少、抗病力强、适应性广等特点，适宜于淡水、 咸淡水、甚至纯海水中养殖，可以在一般池塘养殖，也可在网箱，高密度流水池以及 循环水工厂化养殖，使罗非鱼成为国际上被引种养殖最广泛的鱼种 3 1 。 罗非鱼是当前淡水养殖业的重要养殖品种之一，也是继三文鱼和对虾之后拥有国 际市场的养殖水产品，被视为“白色三文鱼”。根据f a o 统计，目前世界上有8 5 个国 家和地区养殖罗非鱼1 4 , 5 】，罗非鱼是继鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲤鱼之后单一品种养殖产 量超过百万吨的鱼类。在我国大陆除西藏、青海等个别省份外，其余省、市都己推广 养殖罗非鱼。目前已成为养殖数量最大的引进鱼类，中国同时成为全球最大的罗非鱼 生产国，约占全球总产量的4 9 。2 0 0 7 年中国的罗非鱼产量达1 2 1 万吨，南方的广 东、海南、广西、福建成为最主要的4 大养殖区【6 】。 除了鲜食外，我国罗非鱼的加工业近年来也得到了较快的发展，罗非鱼产品出口 迅速增长，2 0 0 5 年我国共出口罗非鱼及其加工产品1 0 7 万吨，其中冷冻罗非鱼的出 口增长最为强劲，2 0 0 5 年冷冻罗非鱼片出口量持续较大幅度增长。但是，罗非鱼出 4 福建农林火学硕二l 二学位论文第一章绪论 口产品主要是生鲜冷藏切片、低温切片与冷冻切片，这些产品在生产过程中产生了大 量的下脚料【7 1 。这些下脚料主要包括鱼头、鱼排、鱼肚、鱼皮以及少量黏在鱼骨上的 鱼肉，这些下脚料占整条罗非鱼的5 4 ，其中鱼头占2 6 5 ，内脏占6 8 ，鱼骨占 1 6 5 ，鱼鳞占2 2 ，鱼皮占4 o ，下脚料中含有丰富的蛋白质、氨基酸和各种活 性矿物质，是人类可利用的蛋白源和营养源【引。 2水产加工下脚料综合利用的重要意义 我国是一个水产大国，自上世纪9 0 年代以来，我国水产品产量一直稳居世界首 位。然而，大量的水产品加工在“去粗取精”的过程造成原料的巨大浪费。我国每年淡 水鱼副产物产量在2 5 0 万吨以上，除了一部分加工做为饲料外，绝大部分未被利用。 而日本水产厅早在1 9 9 8 年就实施了“全鱼利用计划”，全鱼利用率已达到9 7 9 8 ， 无一点废弃物产生【9 j 。据报道，日本曾利用水产废弃物生产一种专用肥料，这种产品 能够控制土壤中不必要的微生物和昆虫的生长，特别适于高尔夫球场草地施肥。目前， 日本、美国的水产加工副产物已经能达到根据其化学组成和生化特性进行分类利用的 程度，其加工产值达鱼肉的几倍到几十倍i m 】。因此，如何运用生物技术对这些低值水 产品和水产加工过程中产生的副产物进行高值化利用，是目前生物技术领域急需开展 的研究课题。其中，运用微生物技术和酶技术对这些低值水产蛋白资源进行酶解利用， 是开发水产蛋白资源的重要途径。 然而，目前我国在水产蛋白资源的酶解利用方面的研究并不多，而且不够深入。 对富含蛋白质的低值水产品和水产加工副产物进行酶解综合利用，不仅可提高其附加 值，改善水产蛋白资源的营养及功能特性，同时还可减少对环境的污染，产生良好的 经济效益】。 由于鱼类资源的日益匮乏，对鱼类加工下脚料的综合利用愈来愈受到重视、在开 发鱼类加工的同时，如何科学地开发利用低值鱼和鱼类加工下脚料等鱼类资源，以挖 掘其经济价值和食用价值，是一个具有现实意义的研究课题，也是目前亟待解决的问 题。开展鱼类加工下脚料和废弃物的综合利用，可变废为宝，生产出各种农业、轻工、 医药、环保和食品行业所需的新产品，大大提高鱼类的附加值，降低主导产品的成本， 取得较高的经济、生态和社会效益。 福建农林人学坝i ：学位论文第一章绪论 3蛋白质酶解机理及蛋白胨的制备2 , 1 2 , 1 3 】 3 1 蛋白质酶解机理 蛋白质在蛋白酶的作用下，其中的肽键断裂，形成肽链长短不一的多肽及少量的 游离氨基酸，如图1 1 所示： i i l 胃 i i l 宵i i l 宫i i l 守 一b l c c n c c h c c h c c jiiiill h r t h 只2 h r ， hr e r i m e + h 2 0 一 l 一等一星一n 一罩一毫一。+ h 一菩n - - c 莩- - 胃c r + 军一善一 一n c c 一一q c o + h 一一n 一0 一c llilill1 h r hr 2h r 3 h r p k c h 1 峰h + 一卜h p k n l j ipr宫l i i 曰 l i l? 一! ；i 一宁一c i ；i p c o h 旷5 | 一宁一c 一铲一孚一c l lflii i i hr l hr z h r j h r 图1 - 1 蛋白质酶解示意图 f i g 1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i n 由图1 1 可以看出，蛋白质在水解过程中，随着其断裂为各种大小不等的多肽及 少量游离氨基酸，溶液中各种多肽和氨基酸的羧基和氨基逐渐显示出其效应，表现为 水解液p h 值随着水解的进行而下降；同时溶液中的可溶性蛋白质的含量随水解进行 逐渐增加。在酶解过程中，正确选择蛋白酶是生产上的关键。现有的蛋白酶种类很多， 蛋白酶按水解蛋白质的方式不同可分为以下几种： 3 1 1内切酶 切丌蛋白质分子内部肽键c o n h ，将蛋白质水解成分子量较小的多肽类。包括 动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦n o v o n o r d i s k 公司 生产的碱性蛋白酶a l c a l a s c 、复合蛋白酶p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 以及国产的 碱性蛋白酶地衣型芽孢杆菌2 7 0 9 、中性蛋白酶枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲 霉3 9 4 2 、酸性蛋白酶黑曲3 3 5 0 等。以上这些国产的微生物蛋白酶中，3 9 4 2 和1 3 9 8 蛋白酶多用于生产蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、水解蛋白等。 6 福建农林人学硕1 ：学位论文 第一章绪论 3 1 2 外切酶 切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸。其中又把作用 于氨基术端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。如丹麦n o v o n o r d i s k 公 司生产的f 脯就含彳j 外切酶。外切酶的一个m 要特陛就是能够把处于肽链米揣f l u i i 、j 疏水 性氨丛陂水解出米，降低多胍的一：咪。 3 2 蛋白胨的制备【l 1 4 】 3 2 1 蛋白胨的生产方法 蛋白胨是蛋白质的水解产物，蛋白质是由氨基酸的长链多聚体所构成的。由于蛋 白质分子的形体大而复杂，所以蛋白质的水解是有条不紊地按步进行。其水解过程可 简要表示如下： 蛋白质_ 示_ 胨_ 多肽_ 较小的多肽( 低肽) 一氨基酸。 生产蛋白胨的关键是控制好水解条件，使其水解终止在“胨”的阶段。蛋白胨生产 的水解方法很多，常用的水解方法有以下三种： ( 1 ) 酸水解：采用盐酸、硫酸、磷酸等作为水解剂。 ( 2 ) 碱水解：采用稀n a o h 、氨水、( n h 4 ) 2 c 0 3 、石灰水作为水解剂。 ( 3 ) 酶水解：采用肤酶、胃酶、1 3 9 8 蛋白酶、2 7 0 9 蛋白酶、胰浆、胃粘膜作水 解剂。 水解方法的选用，水解剂的选择，可根据生产蛋白胨所用的原料来确定，就上述 三种水解方法而言，国内生产蛋白胨的厂家大多采用酶水解法。这是因为：生产蛋白 胨如果用酸或碱作水解剂进行水解，不仅需要具有耐酸或耐碱的设备条件，而且会使 某些氨基酸破坏导致蛋白胨质量下降。 若用酸水解，会使色氨酸、丝氨酸、酥氨酸等氨基酸破坏。其中色氨酸分解后生 成的吲哚核( 或哚吲基团) ，与水解物中的醣类物质在酸性环境中生成的生成的醛类 物质综合，而产生腐黑质，致使水解液变黑，故必须用活性炭脱色，如用盐酸水解， 其产品n a c l 含量很高，有的需要作脱盐处理，从而使工艺复杂，成本提高。 若用碱水解，固然可以避免色氨酸的破坏，但却会使精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、 丝氨酸、酥氨酸分解，并能使氨基酸失去化学活性，发生“外消旋作用”，但可避免色 7 福建农林火学硕- 上学位论文第一章绪论 氨酸的破坏。此法和酸水解法一样，产品灰分含量高，颜色亦较深，一般生产蛋白胨 不采用此法。另外，碱水解和酸水解若操作不慎易导致成品灰分大、杂质多，从而影 响蛋白胨成品的质量。所以用酸、碱两种方法水解蛋白质生产蛋白胨，均不适用于工 业生产。 酶水解法多采用胃蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶，或直接用新鲜的胃粘膜和胰 脏或胰脏捉取液，也有川微生物蛋白酶的。山于酶的作用温和，可以避免酸、碱水解 法的缺点，是生产蛋白胨最常用的方法。 3 2 2 蛋白胨的生产工艺路线 ( 1 ) 以畜骨为原料的生产工艺路线 【加压、分压】水【水解】胰浆 畜骨澄清液 【中和 h c l 一中和液 【精制】白陶土 0 5 k g m 2p h 8 5 ，4 0 ( 2p h 5 过滤、沉淀 【过滤、浓缩】帆布【十燥】 浓缩液一成品 利用新鲜畜骨制得的蛋白胨质量好，外观颜色浅。 ( 2 )以胶渣为原料的生产工艺路线 【水解】水、石灰水【中和】h 2 s 0 4 【压滤】【浓缩】 胶渣水解液 精制液 中和液一精制液一浓缩液 p h l lp h 6 【干燥】 一成品 胶渣是指生产明胶后的残渣。利用等外动物胶生产蛋白胨，可采用上述工艺路线， 但水解前需要增加“溶胶”这一工序。 ( 3 ) 以畜血为原料的生产工艺路线 【煮沸1 【水解1 水、胰浆 畜血啼血块啼水解液 p h 8 5 ，4 0 ( 2 【中和1 h 2 s 0 4 【煮沸、过滤1 一中和液 p h 5滤液一 【浓缩】 【千燥】 浓缩液一成品 畜血中含有丰富的蛋白质，国外有“液体肉”之称。畜血来源广，收集获取方便， 价格低廉。 福建农林人学硕：l ：学位论文 第一章绪论 ( 4 ) 以鱼粉为原料的生产工艺路线 f 水解】水、碱、胰浆【中和】h c l【压滤】【浓缩】 鱼粉 p h 8 5 ，4 0 c 水解液 中和液一精制液一浓缩液 【干燥】 一成品 鱼粉是利用食用价值低的鱼和食朋鱼的工业加工下脚料制得的产品，含蛋白质高 达6 4 4 7 5 3 ，可作为原料来生产蛋白胨。 ( 5 ) 以生产骨粒的蒸骨水为原料的生产工艺路线 【过滤、水解】胰浆【中和】i i c i【压滤】【浓缩】 蒸骨水水解液中和液精制液啼浓缩液 【干燥】 一成品 生产骨粒的蒸骨水中含有丰富的蛋白质，大多数骨粒生产厂将其弃去，既浪费资 源，又污染环境。利用蒸骨水生产蛋白胨，可降低生产成本，增加经济效益。 4水产l j n - r 下脚料的利用现状和酶解研究 4 1 水产加工下脚料的利用现状 我国是世界上主要的渔业生产国，小杂鱼和低值鱼占海洋捕捞产量的5 0 6 0 ，我国水产加工业虽然取得了很大的成就，但仍与渔业的迅速发展和人民生活水 平的逐步提高不相适应，水产加工品占总产量的比例仅为3 0 7 ，远远落后于发达国 家7 0 以上的水平，而且初级产品多，深加工、精加工产品少，尤其是大宗、低值水 产品，如淡水鱼、中上层鱼类和贝藻类的加工仍是薄弱环节f ”】。 我国海洋经济鱼类资源由于过度捕捞已在逐渐减少，而小杂鱼类的产量比重却不 断增加1 1 6 j 。渔获物中的小鱼、小虾及水产品加工下脚料一般占渔获物的2 8 。由于 缺乏综合加工利用技术的深入研究，目前低值鱼类及水产副产品主要用于生产鱼粉等 低附加值产品，甚至部分作为废物直接丢弃，不仅导致浪费、产品附加值低，而且造 成海洋、陆地环境的严重污染。 随着鱼类加工业的飞速发展，约占鱼体总质量4 0 - - 5 5 的下脚料( 包括鱼头、 内脏、鱼皮、鱼鳍、鱼鳞、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉) 的加工利用水平成了影响水产 9 祸建农林人学硕士学位论文第一章绪论 业经济效益的关键所在，而这些副产中除含有大量的蛋白质外，还含量有丰富的脑磷 脂、矿物质和其他生物活性成分 1 7 , 1 8 】。目前，国内外低值水产品及其j j n - r 废弃物的深 加工利用新技术主要应用于加工鱼油制品、鱼糜制品，以及模拟海味制品、海鲜调味 品、食用及饲用鱼蛋白以及鱼鳞胶的提取利用等【1 5 】。鱼品加工后剩下的鱼头、尾、碎 肉、胆、骨、鳞、内脏、皮等，含有大量蛋白质、氨基酸、微量元素和维生素等。利 用这一蛋白质资源，可制成各种精深加工产品，有可溶性食用蛋白粉、液体鱼蛋白饲 料、鱼鳞胶、鱼皮胶、鱼骨糊、鱼蛋白钙糖、胆色素钙盐和胆酸盐等【1 8 1 。 4 2 水产加工下脚料的酶解研究 近几年来，国内外不少研究者对鱼类加工下脚料的利用进行了探讨，主要是利用 酶法提取下脚料蛋白水解物，为下脚料的高值化利用积累有意义的基础数据。 4 2 1 利用组织蛋白酶发酵 利用从水产加工副产物甲壳类的肝胰腺和鱼类的消化道组织中提取的蛋白酶对 其他低值水产品或水产加工剐产物进行酶解，如m u k h i n t 内】利用从鲎肝胰腺中提取的 蛋白酶对冰岛扇贝加工副产物进行酶解；j e o n 等【2 0 1 利用金枪鱼幽门盲囊中提取蛋白酶 对鳕鱼鱼排进行酶解，都获得了很好的效果。 4 2 2 加入外源蛋白酶及曲 ( 1 ) 生产鱼露 鱼露本是由海水鱼类生产的，含有人体所必需的各种氨基酸，特别是含有丰富的 赖氨酸和谷氨酸，味道鲜美，营养丰富，在日本及东南亚很受欢迎。国内学者配合养 殖业的发展，对淡水鱼类发酵鱼露做了尝试。陈瑜珠等【2 1 】利用罗非鱼加工下脚料来发 酵鱼露，加入3 5 的海盐( m m ) 发酵1 8 0 d ，定期检测各项理化指标，并对鱼露成品进 行了感官评定。邵伟等【2 2 】以淡水鱼下脚料为原料，经过酶解与加曲速酿后，对鱼露进 行脱腥处理，并以鱼露的游离氨基酸、澄清度和腥味值为指标，比较了各脱腥处理方 式的效果。结果表明，低浓度脱腥剂复合处理效果较好。邓尚贵因】等人采用多酶法 对青鳞鱼下脚料蛋白质进行水解，确定了以多酶法生产鱼露的新工艺。并对采用新工 艺制取的鱼露的主要营养成分进行分析，结果表明，其氨基酸氮含量略高于国标的上 福迎农林人学硕i j 学位论义第一章绪论 限值，总氮比国标值上限高得多，而食盐的含量则比国标值上限略低。也就是说，采 用新工艺生产的鱼露质量略高于国标的要求。 ( 2 ) 水解鱼蛋白 水解鱼蛋白优于整鱼肉或鱼蛋白浓缩物，其水溶性好、低脂、低灰分、高蛋白。 当然不同品种的鱼和酶都将产生不同性质的水解鱼蛋白。国外对低值海水鱼及其副产 品的蛋白水解物也进行研究和利用。b e n j a k u l 2 4 1 研究了牙鳕( w l l i t i n g ) 的废弃物的利用， 选择最佳条件，从牙鳕固体废弃物中提取蛋白水解物，所得产物蛋白质含量高 ( 7 9 9 7 ) ，氨基酸组成与鱼肌肉十分相近。s t e i ni v a ra s p m o t 2 5 】等人分别用内源蛋白酶 和商业蛋白酶对鳕鱼内脏进行酶解实验，结果表明用内源蛋白酶水解鳕鱼所得到的水 解液的可溶性氮回收率达到7 5 ，加入商业蛋白酶之后可溶性氮回收率可达到9 5 。 国内对鱼下脚料中蛋白质的水解研究直到近几年才开始逐渐增加。这方面的报道 有周涛等1 2 6 】提出了用木瓜蛋白酶酶解鲐鱼加工废弃物制取水溶性鱼蛋白质水解物的 技术，确定其最佳水解条件，蛋白质水解物中粗蛋白含量为8 2 4 8 ，必需氨基酸含 量占氨基酸的3 9 8 ，富含镁，是理想的食物蛋白添加剂。杨萍等【2 7 】利用常规方法分 析比较了军营鱼鱼头、鱼皮、内脏的鱼油脂肪酸组成及其酶解蛋白粉的营养价值。结 果表明，军曹鱼鱼头、鱼皮、内脏的粗鱼油和精制鱼油脂肪酸组成主要由c 1 4 c 2 2 的1 7 种脂肪酸组成，不饱和脂肪酸含量均为1 5 左右；二十碳五稀酸( e p a ) 和二 十二碳六稀酸( d h a ) 总量均为1 1 左右；鱼头、鱼皮、内脏的酶解蛋白粉的粗蛋 白含量( 干基) 分别为8 5 4 6 、9 0 7 9 幂t i7 8 2 6 ，必需氨基酸含量分别为2 7 6 7 ， 3 4 5 1 ，2 9 1 5 ，必需氨基酸之间比例适宜，符合f a o w h o 推荐的理想蛋白质模 式。余杰【2 8 】在烤鳗下脚料鳗骨中加入蛋白酶，不仅可回收利用蛋白质，而且还可分离 得到优质鳗油。鳗油提取率可达到7 8 5 ，高于蒸煮法。酶法提取过程避免了强酸、 强碱和高温的作用，鳗油的p o v 明显低于蒸煮法，其e p a + d h a 含量比蒸煮法高， 色泽也令人满意。顾林等【2 9 】采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶 对废水鱼汁中蛋白质进行水解，以选择适于废水鱼汁水解的蛋白酶，并对适合废水鱼 汁水解的蛋白酶水解条件进行研究。结果表明：中性蛋白酶是最适合水解废鱼汁中蛋 白质的工具酶；中性蛋白酶水解鱼汁中蛋白质的最佳条件为：p h 7 5 ，温度5 5 0 ，酶 用量4 0 0 u g 1 ( 蛋白质) ，底物浓度1 0 0 r a g g ，水解时间6 h 。 ( 3 ) 胶原蛋白的回收 福建农林人学颂i 二学位论文第一章绪论 胶原蛋白及其水解产物在医疗、保健及美容方面具有良好的应用前景，可供食用， 可用作摄影材料，也可做香肠的肠衣及功能食品的添加剂等；在医药卫生方面，可溶 性胶原蛋白可用于整容、生产化妆品，用作外科医用辅料、酶及生物活性物质的载体 等。郭恒斌p o 】等人研究了酶法制备鱿鱼皮中胶原蛋白的方案，通过正交试验确定了最 佳的酶解工艺条件。得出结论，鱿鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，其含量为5 3 9 6 ( 干 基) ，占总蛋白质的7 1 6 1 。并分别得出影响胰蛋白酶和木瓜蛋白酶提取胶原蛋白的 因素及最佳工艺条件。胡建平1 3 1 1 等人用胃蛋白酶对鱼鳞胶原蛋白的提取，用提取液制 作饮料。得出最佳酶解条件和饮调配的最佳工艺配方。刘克海【3 2 】等人采用胃蛋白酶提 取胶原蛋白，再经盐析、透析纯化，冷冻干燥的胶原蛋白产品颜色较淡，符合化妆品 添加剂要求，可应用到化妆品中，具有良好产业化前景。s m o r i m u r a l 3 3 】等人对回收的 胶原蛋白进行水解，发现其产物中色氨酸，苏氨酸，亮氨酸，组氨酸等多种氨基酸的 含量甚至超过胶原蛋白标样；而且该产物还有降低血压等生理活性。 ( 4 ) 在鱼糜制品中的应用 在制作鱼糜制品时，低质的海洋鱼，以及水产品下脚料由于蛋白质结构较差，亲 水性弱，可使用蛋白酶将这些原料进行部分水解，再加入t g ，就能取得十分满意的 结果。孙京新f 3 4 】等人究了转谷氨酰胺酶制剂改善低值带鱼鱼糜制品质构特性的可行 性。结果表明，转谷氨酰胺酶制剂可有效改善低值鱼鱼糜制品质构特性( 硬度、弹性) 。 严菁f 3 5 1 研究了转谷氨酰胺酶( t g a s e ) 对淡水鱼糜凝胶强度的影响。结果表明，t g a s e 的用量、作用时间和作用温度对鱼糜凝胶强度有明显的影响。在自然p h 值下，用l o o g 蛋白质的t g a s e 于4 2 。c 处理2 h 。鱼糜的凝胶强度达到最大，比未加酶的凝胶强度增加 近1 倍。 ( 5 ) 生产鱼鳔胶 鱼鳔不仅是宴席的名菜，还有相当的滋补作用和药用价值，可补肾、润肺、滋肝、 止血。鱼鳔经酶法制成的鱼鳔胶，使鱼鳔的粘性蛋白变为易于吸收利用的多肽、短肽、 氨基酸、粘多糖，鱼鳔胶有抗疲劳作用，可作滋补品。任玉翠【3 6 】等人采用酶解技术将 鱼鳔加工成鱼鳔胶，该工艺将鱼鳔的主要成分粘性蛋白变为易于吸收的肽类，氨基酸， 粘多糖，并保留了多种维生素和矿物质，是冬令最佳滋补品。 ( 6 ) 制取角蛋白 魏民【3 7 】曾报道制取鱼鳞胶、鱼皮胶等的胶渣以及鱼品加工厂剩下的鱼鳞鱼鳍可用 1 2 福建农林人学硕：j ：学位论文第一章绪论 来制取角蛋白。可溶性角蛋白是一利- 表面活性物质，能用作洗涤剂的活性物，因其具 有良好的乳化性能，还能用作农药的乳化剂，轻微水解后则可用作泡沫灭火剂。 5国内外水产蛋白胨的研究现状 蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。它作为微生物培养基 的主要原料，在抗生素，医药工业，发酵工业，生化制品及微生物学科研等领域中的 用量均很大；在国际市场上，蛋自胨也属于货紧价昂的短线品种之一。我国生产蛋白 胨有三十多年的历史，其生产原理是根据蛋白质在强酸，强碱，高温或利用胃蛋白酶， 胰蛋白酶作水解剂的催化作用下，使其分子中的长肽链打开，从而生成不同长度的肽 键的蛋白质分子的“碎片”。蛋白胨主要以猪肉，鱼粉，肉骨作为生产的原料【3 8 1 。 水产蛋白资源被酶解后，酶解产物具有蛋白质含量高，水溶性好，其中多肽和游 离氨基酸丰富等特点，因此，水产蛋白酶解产物即水产蛋白胨可作为发酵工业和实验 室中微生物培养所用的蛋白胨。 2 0 0 1 年，m u k h i n 等【1 9 】将由从鲎肝胰腺中提取的蛋白酶酶解冰岛扇贝加工废弃物 得到的酶解产物应用于微生物培养，对其在微生物培养基中作为氮源的应用做了评 估，认为此蛋白胨可应用于微生物培养。g u 6r a r d 等【3 9 】将来自于金枪鱼、鳕鱼、鲑鱼 和杂鱼的蛋白胨应用于细菌、酵母和霉菌的培养，并与酪蛋白胨相比较，结果显示上 述鱼蛋白胨应用于微生物的培养效果显著。a s p m o 等【4 0 】将从大西洋鳕鱼内脏酶解获 得的产物应用于微生物培养，并与数种市售蛋白胨如胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提 取物等进行比较，结果显示，大西洋鳕鱼内脏蛋白胨作为一种混合氮源，可用于替代 市售蛋白胨；并且，对于培养一种对营养需求苛刻的乳酸菌( l a e t o b a c i l l u ss a k ei ) ， 其培养效果明显高于各种市售蛋白胨。 目前国内关于采用水产蛋白为原料制备试剂蛋白胨的研究报道非常少。卢珍华等 4 1 1 对枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶的产生条件及其培养液水解鱼蛋白质制备蛋白胨进行 了初步研究。结果表明，用枯草芽孢杆菌培养液为蛋白酶源水解蛋白质时，应控制反 应体系的温度为5 5 。c ，p h 9 0 ，加入低浓度的m 9 2 + 、c a 2 十并去除c u 2 + 、f e ”、p b 2 + 和 a 矿，对枯草芽孢杆菌产酶有促进作用；用枯草芽孢杆菌培养液分别水解鳕鱼粉和罗 非鱼，蛋白质制备蛋白胨的得率分别为1 3 9 5 和1 4 9 6 ，与目前的工业水平基本相 当。卢珍华等【4 2 】对米曲霉培养液水解鳕鱼粉制备蛋白胨进行了研究，结果表明，米曲 福建农林人学烦i ：学位论文 第一章绪论 霉培养液对鳕鱼粉具有明显的蛋白酶活性能将鳕鱼粉中的蛋白质水解；用米曲霉培 养液水解鳕鱼粉制备蛋白胨的得率为1 5 7 4 ；为进一步用米曲霉培养液为蛋白酶源， 改进鱼蛋白水解工艺提供了试验参考。刘锦琳等【4 3 】采用物理破壁技术从螺旋干粉中提 取蛋白，酶解制成蛋白胨，探讨螺旋藻蛋白胨在细菌培养方面的反应。结果表明，螺 旋藻蛋白胨产量占干重的5 1 5 ，并适合细菌生长的需要，优于日本蛋白胨、水解酪 蛋白和胰蛋白胨。因此，螺旋藻蛋白胨能提供细菌生长所需的氮源和碳源，具有价廉、 易大量制取的物理特点，可作为一种新的廉价的蛋白胨原料。 6本项目研究的目的、主要内容和意义 6 1 研究的目的 探讨出罗非鱼下脚料( 即冷冻罗非鱼片加工过程的碎鱼肉) 制备鱼蛋白胨的最佳 工艺，优化工艺参数，试制出相应的产品，以便于指导工业生产。 6 2主要的研究内容 本项目主要研究内容分为四个部分： 第一部分：对罗非鱼碎肉的蛋白质、脂肪含量、灰分等成分进行分析测定，评定 鱼碎肉的营养价值，并为充分利用鱼下脚料的蛋白质资源建立基础数据、提供基础理 论； 第二部分：以罗非鱼碎肉为原料，用单一酶解工艺生产生化试剂蛋白胨，以蛋白 胨得率为评价指标，确定最佳酶解条件( 酶的种类、酶解最适温度、最适p h 、最适 酶用量、最适固液比、最适水解时间) 。 第三部分：以罗非鱼碎肉为原料，比较不同蛋白酶的水解效果，筛选出水解效果 较好的两种酶组合，用复合酶解工艺生产生化试剂蛋白胨，采用二次正交旋转组合设 计方案，建立蛋白胨得率与酶解工艺参数之间的动态数学模型，实现生产中进行动态 控制和预测产品质量的目的，具有重要的实践应用价值；应用响应面分析方法进一步 优化酶解工艺参数，从而提高蛋白胨得率。 第四部分：采用氨基酸自动分析仪器对双酶水解液进行氨基酸组分的分析和评 价。 1 4 榀迎农林人学坝l ：学位沦义 第一章绪论 6 3 研究意义 本研究利用冷冻罗非鱼片加工过程的碎鱼肉通过酶解生产生化试剂蛋白胨，不仅 拓宽水产下脚料综合利用的范围，使水产加工业巨量下脚料的潜在利用价值得到充分 有效地丌发，使资源物尽其用，而且大大降低了生化试剂蛋白胨的原料成本，使水产 下脚料中潜在丰富的蛋白资源有效地丌发成为一种高附加值的产品，具有良好的丌发 与应用前景。 1 5 福建农林人学顾l ：学位论义第二章刁i l 川岱白酶对罗非鱼碎肉的酶解效果 第二章不同蛋白酶对罗非鱼碎肉的酶解效果 蛋白酶对水解的肽键具有专一性，不同蛋白酶对同种底物的作用结果不同，目前 用于水产蛋白资源酶解利用的蛋白酶种类很多，根据其来源可分为植物，动物和微生 物来源三类。来自植物的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木 瓜凝乳蛋白酶等，其中以木瓜蛋白酶在水产蛋白资源酶解中应用最为广泛。来源于动 物消化道的蛋白酶包括胰蛋白酶，胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。来源于微生物的酸性蛋 白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。生产中常采用胰酶、胃酶、3 9 4 2 和1 3 9 8 蛋白酶、 2 7 0 9 蛋白酶、胰浆、胃粘膜作为蛋白胨的酶水解剂【i ，2 1 。本实验选用具有代表性的 a s 1 3 9 8 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶对罗非鱼碎 肉进行酶解，从蛋白胨得率来筛选合适的蛋白酶。 1材料与方法 1 1 实验材料与仪器设备 1 1 1 原料 冷冻罗非鱼片加工过程的碎鱼肉，由福建福铭食品有限公司提供； a s 1 3 9 8 中性蛋白酶，无锡酶制剂公司： 木瓜蛋白酶，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司； 复合蛋白酶，广东拜奥生物化学厂； 风味蛋白酶，无锡酶制剂公司； 胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司。 1 1 2 试剂 硫酸( h 2 s 0 4 ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 盐酸( h c l ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 硫酸铜( c u s o 5 h 2 0 ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 1 6 福建农林人学颂l ：学位论文第二章不同蛋白酶对罗非鱼碎肉的酶解效果 硫酸钾( k 2 s 0 4 ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 氢氧化钠( n a 0 h ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ： 硼酸( h 3 8 0 3 ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 无水乙醚( c 4 h i o o ) ，国药集团化学试剂有限公司，分析纯( a r ) ； 硫酸锂( l i 2 s 0 4 h 2 0 ) ，两安化学试剂厂，化学纯； 钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) ，沈阳化学试剂厂，分析纯： 钼酸钠( n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ) ，天津市化学试剂四厂，分析纯； 酪氨酸，上海伯奥生物科技有限公司，生化试剂； 酪蛋白，上海伯奥生物科技有限公司，生化试剂； 蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂，生化试剂； 磷酸二氢钠( n a i l 2 p