（发酵工程专业论文）枯草芽孢杆菌的固定化及其净水效果的研究.pdf

华中农业人学2 0 0 8 届硕上学位论文 摘要 本课题是探索枯草芽孢杆菌的固定化方法以及其对人工模拟污水净化效果的研 究。所取得的主要结果如下： 1 运用麦麸对枯草芽孢杆菌进行固体培养，得到枯草芽孢杆菌固体菌剂，活菌数 为3 x 1 0 1 0c f u g 。使用聚丙烯纤维无纺布对固体菌剂进行包埋，得到包埋菌剂。 2 对包埋菌剂中枯草芽孢杆菌的释放规律进行试验。枯草芽孢杆菌起始菌数为8 0 亿，经过6 8h 后水体中总菌数与布包中留有菌的总和菌量达到最大，约3 6 0 亿， 为起始菌量的4 5 倍。随后布包与水体中的菌数缓慢减少，在4 8h 后逐渐趋于稳 定，整个系统中总菌量维持在1 4 0 亿左右，然后缓慢下降，5 天以后，系统总菌 数为8 0 亿，相当于起始添加的菌量。包埋菌剂具有很好的缓释菌体的效果，延 长菌体的作用时间。 3 通过人工模拟污水试验对包埋菌剂与非包埋菌剂进行了净水效果的对比研究， 结果表明：增氧条件下，对低浓度模拟污水进行实验，发现各个不同投菌浓度 间没有很大的差异，包埋菌剂与非包埋菌剂间的差别也不大；高浓度模拟污水 实验发现，7 5 x 1 0 5c f u m l 的投菌浓度的净水效果相对较好，且包埋菌剂的水 体c o d m 。的去除效果较非包埋菌剂有优势；连续补充有机质的水体实验表明， 包埋菌剂较非包埋菌剂可以更持久地发挥净水作用，降解有机质的速度也较 快；静置条件下，包埋菌剂的净水效果明显好于非包埋菌剂。包埋菌剂4 8h 后 c o d m n 去除率可达7 5 2 2 ，而直接投放非包埋菌剂受到溶氧较大限制，4 8h 后 c o d m 。去除率仅为4 0 2 1 。 4 为了给枯草芽孢杆菌挂膜实验提供依据，对其发酵产多糖进行了优化实验。实 验表明，3 蔗糖，1 硫酸铵，0 5 的牛肉膏配比产多糖量最多，产多糖可达2 m g l 以上，枯草芽孢杆菌o d 6 0 0 可达3 1 6 。 关键词：枯草芽孢杆菌；固定化；人工模拟污水；净水；胞外多糖 枯草芽孢杆菌的固定化及其净水效果的研究 a bs t r a c t t h ea i mo ft h i sr e s e a r c hw a st of i n ds o m eg o o di m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so fb a c i l l u s s u b t i l i sa n da l s ot og e ts o m er e s u l t so fi t sa p p l i c a t i o ni ns y n t h e t i cw a s t e w a t e rt r e a t m e n t f o l l o w i n gr e s u l t sw e r eo b t a i n e d ： 1 1 1 1 ee f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o no fb s u b t i l i sc u l t i v a t e db vb r a nc o u l da r r i v ea t3 x1 0 1 0 c f u g t h e np a c k e db yp o l y p r o p y l e n en o n w o v e n ，i m m o b i l i z e db s u b t i l i sc a nb eg e t 2 s o m ee x p e r i m e n t so nt h er e l e a s er u l eo fe m b e d d e db s u b t i l i sh a sb e e nd o n e i th a s b e e np r o v e dt h a tt h es u m m a t i o nn u m b e ro fb s u b t i l i sd i f f u s e di nt h ee x p e r i m e n t e d w a t e ra n dk e p ti nt h en o v w o v e np a c kc o u l dg e tt h el a r g e s tn u m b e ro f3 6b i l l i o na f t e r 6 - 8h o u r st h ee m b e d d e db s u b t i l i sa d d e d 4 5t i m e so ft h eo r i g i n a ll e v e lo f8b i l l i o n a f t e rt h a t ，t h en u m b e ro fb s u b t i l i si nt h ew a t e ro rt h ep a c kb e g a nt od e c r e a s e s l o w l y i tg r a d u a l l yl e v e lo f fa f t e r4 8h o u r s t h a tt h es u m m a t i o nn u m b e rs t a y e da t1 4 b i l l i o n t h e n ，t h en u m b e ro fb s u b t i l i sd r o p p e d t h e r ew e r e8b i l l i o nb s u b t i l i s a f t e r5d a y si nt h ew h o l es y s t e m , e q u a lt ot h eo r i g i n a ln u m b e r t h em i c r o o r g a n i s m c o u l dr e l e a s es l o w l yi nw a t e ri nt h i se m b e d d e dw a ya n dp r o l i f e r a t e da tt h es a l t l e t i m e 。s oal o n gw a t e rp u r i f i c a t i o nt i m ec o u l db ep r o m i s e d 3 c o m p a r e dt h ew a t e rp u r i f i c a t i o ne f f e c to ft h ei m m o b i l i z e ds o l i d - s t a t eb s u b t i l i s w i t ht h ea m b u l a t o r yb s u b t i l i sp o w d e r , t h ef o l l o w i n gr e s u l t sh a v eb e e nf o u n d u n d e ra e r a t e dc o n d i t i o n ，t h e r ew a sn ob i gd i f f e r e n c eb e t w e e nt h r o w i n gd i f f e r e n t q u a n t i t a t i v eb s u b t i l i sw h e nt r e a t i n gs y n t h e t i cw a s t e w a t e ro fl o w c o n c e n t r a t i o n o r g a n i cm a t t e r t h e r e w a sn od i f f e r e n c eb e t w e e nt h ei m m o b i l i z e ds o l i d s t a t e b s u b t i l i sa n dt h ea m b u l a t o r yb s u b t i l i sp o w d e rt o o v v h e nt r e a t i n g s y n t h e t i c w a s t e w a t e ro fh i g h c o n c e n t r a t i o no r g a n i cm a t t e r ，t h ep u r i f i c a t i o ne f f e c tw a st h eb e s t a tt h ec o n c e n t r a t i o no f7 5 xl0 3c f u m l t h ec o d m nr e m o v i n ge f f e c to f i m m o b i l i z e ds o l i d s t a t eb s u b t i l i si sb e t t e rt h a nd i r e c t l ya d d i n gb s u b t i l i sp o w d e r t h ee x p e r i m e n to fc o n t i n u e l ys u p p l y i n go r g a n i cm a t t e rt ot h ew a t e rp u r i f i c a t i o n p r o c e s ss h o w e d t h a tt h ei m m o b i l i z e ds o l i d - s t a t eb s u b t i l i sc o u l dp l a yal o n g e r t i m e r o l ea n dd e c o m p o s et h eo r g a n i cm a t t e ri n t h ew a t e rf a s t e r u n d e rn oa e r a t i o n c o n d i t i o n ，t h i si m m o b i l i z e dw a yc o u l da l s op l a yw e l la tal o wd ol e v e lt h a tt h e c o dr e m o v i n gr a t ec o u l da r r i v ea t7 5 2 2 a f t e r4 8h ，c o m p a r e dw i t h4 0 21 o f u s i n gd i r e c td i s p o s a lw a y 4 t h r o u g ht h ee x p e r i m e n to fo p t i m i z i n gt h ec o m p o n e n t so ft h ec u l t u r em e d i u m ，i t s h o w e dt h a tt h eo u t p u to ft h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dg e tm o r et h a n2m g lw i t h c o m b i n a t i o no f3 s a c c h a r o s e ，1 a m m o n i u ms u l f a t ea n d0 5 b e e fe x t r a c t a n d o d 6 0 0o fb s u b t i l i sc o u l dg e t3 1 6 i i 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ；i m m o b i l i z a t i o n ；s y n t h e t i cw a s t e w a t e r ；w a t e rp u r i f i c a t i o n ； e x o p o l y s a c c h a r i d e s i i i 枯争芽孢杆菌的同定化及其净水效果的研究 i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 吞 如需保密，解密时间年 月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：m 时间： 略年 6月缈 日 撇黼始m 锄签名劳多呼 签名日期： 口8 年6 月f o 日签名日期： 好年占月，b 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 l 枯草芽孢杆菌的同定化及其净水效果的研究 j - - - l 刖吾 1 1 研究背景 1 1 1 我国湖库、河流污染现状 随着近代工业的飞速发展，所带来的严重水污染问题，已经直接或潜在地威胁 着人类的生存和发展，水污染问题已引起了人类社会的广泛关注( 吴淑武等，2 0 0 2 ) 。 我国水污染严重，8 2 的河流受到不同程度的污染，有4 2 的城市饮用水源受到严 重污染，农村有7 0 的饮用水不符合卫生标准( 关亮炯，2 0 0 4 ) ，污染严重的地区水 域已威胁到人民的身体健康和工业生产。我国的废水排放量逐年增加，其污染根源 主要来自工业排放的废水，城镇生活污水以及农业化肥，农药流失等。以工业废水 和城市生活污水为例，近2 0 年来，虽然我国污水的处理率在不断提高，但污水的年 排放量仍在大幅度增加。 根据国家环保总局发布的 2 0 0 6 年中国环境状况公报：2 0 0 6 年，全国地表水 总体水质属中度污染。( 1 ) 七大水系的1 9 7 条河流4 0 8 个监测断面中，i 类， 、v 类和劣v 类水质的断面比例分别为4 6 、2 8 和2 6 。其中，珠江、长江水 质良好，松花江、黄河、淮河为中度污染，辽河、海河为重度污染。主要污染指标 为高锰酸盐指数、石油类和氨氮。( 2 ) 2 7 个国控重点湖( 库) 中，满足i i 类水质 的湖( 库) 2 个( 占7 ) ，类水质的湖( 库) 6 个( 占2 2 ) ，类水质的湖( 库) 1 个( 占4 ) ，v 类水质的湖( 库) 5 个( 占1 9 ) ，劣v 类水质的湖( 库) 1 3 个( 占 4 8 ) 。其中，巢湖水质为v 类，太湖和滇池为劣v 类。主要污染指标为总氮和总磷。 ( 3 ) 9 个重点国控大型淡水湖泊中，兴凯湖为i i 类水质；洱海为i i i 类水质；镜泊湖 为类水质；洞庭湖、鄱阳湖为v 类水质；洪泽湖、南四湖、达赉湖和白洋淀为劣 v 类水质。主要污染指标为总氮和总磷。与上年相比，南四湖和鄱阳湖水质略有下 降，其它大型淡水湖水质无明显变化。营养状态评价表明：洱海、鄱阳湖为中营养 状态；洞庭湖、洪泽湖、南四湖、镜泊湖为轻度富营养状态；达赉湖为中度富营养 状态；白洋淀为重度富营养状态。( 4 ) 5 个城市内湖中，昆明湖( 北京) 为类水 质，西湖( 杭州) 、东湖( 武汉) 、玄武湖( 南京) 、大明湖( 济南) 为劣v 类水质。 主要污染指标是总氮、总磷。与去年相比，昆明湖水质好转，玄武湖水质变差，其 余城市内湖水质无明显变化。昆明湖为中营养状态，玄武湖、西湖、大明湖为轻度 富营养状态，东湖为中度富营养状态。( 5 ) l o 个大型水库中，石门水库( 陕西) 为 i i 类水质；丹江口水库( 湖北) 、密云水库( 北京) 、董铺水库( 安徽) 、千岛湖( 浙 江) 为i i i 类水质；于桥水库( 天津) 、松花湖( 吉林) 为v 类水质；大伙房水库( 辽 宁) 、崂山水库( 山东) 和门楼水库( 山东) 为劣v 类水质。主要污染指标为总氮。 枯草芽孢杆菌的淘定化及其净水效果的研究 与上年相比，于桥水库水质由类变为v 类，水质变差；其它9 座大型水库水质无 明显变化。大伙房水库为中度富营养状态，密云水库为轻度富营养状态，其余7 座 大型水库均为中、贫营养状态。( 6 ) 2 0 0 6 年，全国废水排放总量为5 3 7 0 亿吨，比 上年增长2 4 ；化学需氧量排放量为1 4 2 8 2 ，万吨，比上年增长1 o 。( 国家环境 保护局，2 0 0 6 ) 。 我国每年用于环境污染投资约为8 3 0 亿元，约占当年g d p 的1 。尽管如此， 水环境污染趋势仍然没有得到有效控制，每年由于水质污染引起的损失共约为5 0 0 亿元，如何治理污水已成为当前社会发展急需解决的问题。 1 1 2 养殖水体环境污染状况 水产养殖作为我国农业结构调整的目标产业，近年来得到了飞速发展。养殖面 积、养殖品种和产量连续多年居世界第一，2 0 0 4 年我国水产养殖产量达3 2 0 9x 1 0 7 t ，分别占我国水产品总量的6 5 和世界水产养殖产量的7 0 1 目前我国水产养殖品 种已超过1 6 0 种，其中海、淡水种类分别有1 0 0 和6 0 多种。随着水产养殖业的不断发 展，养殖方式由半集约化向高度集约化和工厂化发展，目前我国由南至北沿海1 5m 等深线以内的水域、滩涂几乎均已开发，陆地工厂化水产养殖面积也已经超过1 0 x 1 0 8 m 2 ( 李秀辰等，2 0 0 7 ) 。2 0 0 5 年我国养殖总产量占水产品总产量的比重上升为6 6 5 ， 是世界上水产养殖产量超过捕捞产量的唯一国家( 李绪兴，2 0 0 7 ) 。 随着技术的进步，以牺牲自然环境和大量的物质消耗为主要特征的传统水产养 殖生产方式正逐步得到改善，人工控制程度和现代化程度较高的各种水产养殖方式 已得到较大发展，持续发展已越来越被重视。工厂化养鱼、网箱养鱼、流水养鱼等各 种高产养殖方式，立体利用水域、水陆复合生产的生态渔业以及能量充分利用等各 种高效利用模式得以较为广泛的应用，保持渔业资源和水域环境可持续利用的生产 技术已越来越被生产者接受和掌握。但是，随着水产养殖产业的蓬勃发展，水产养 殖对环境的负面影响也越来越引起人们的重视，主要是在养殖生产过程中产生的大 量有机和无机废物，对局部水体环境构成威胁。 在水产养殖生产过程中，由于向养殖水体( 藻类及贝类等不需投饵的养殖品种除 外) 中投入大量饵料、渔用药物等，加之生产操作缺乏严格规范，特别是过量施用或 不合理施用时，养殖水体中残饵、排泄物、生物尸体、渔用营养物质和渔药等大量 增加，造成氮、磷、渔药以及其他有机或无机物质在封闭或半封闭的养殖生态系统 中超过了水体的自然净化能力，从而导致对水体环境的污染，造成水质恶化。有些 地方的养殖业仍沿袭传统的养殖方式，向养殖水体投入有机肥，甚至是未发酵的有 机肥，这些有机肥在养殖水体中分解要消耗大量氧气，往往又产生一些氨氮、亚硝 酸盐、沼气等有害物质，并造成水体富营养化，使得水体营养盐升高，下层水体缺 氧。残饵及鱼类排泄物沉入水底后，还会造成沉积环境中硫化物、有机质和还原物 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 质含量升高。水体中残留药物积蓄，致使有害微生物或噬污生物繁衍，导致养殖生 态失衡，水体变老，影响鱼类健康。 水产养殖过程中产生的污染物主要有：悬浮物、总氮、总磷、高锰酸盐指数、 生化需氧量、硫化物、非离子氨、铜、锌、活性氯等。污染产生的方式包括：直 接投入：悬浮物、总氮、总磷实际上是由于饵料的投入，未被水生生物完全利用的 残饵分解造成的，因为饵料的配制之中含有一定数量的蛋白质( 含氮、硫的有机物) 、 饵料添加剂( 磷及一些铁、钙、铜等) ；水生生物的代谢和分解：养殖过程中投入 的饵料利用率不可能达到1 0 0 ，即使投喂饵料的量掌握得非常到位，全部被水生 生物吞吃，也会有部分的饵料无法吸收，经过水生生物的吸收代谢排入水中，使水 中的氮、磷含量增加；如果水中氮、磷含量剧增，就会使水中的浮游生物量增加迅 速，表现出水体变色，在淡水中形成被称为“水华 的现象；在海水中形成为“赤 潮；水产养殖密度过大：由于养殖密度大，势必增加投饵量，容易造成水中溶 解氧缺乏，水中的高锰酸盐指数、生化需氧量、硫化物、非离子氨明显增加；防 病治病：由于养殖密度高，水质不清洁，养殖的水生生物极易患各种疾病，为了防 病治病，细菌性疾病要投入一些抗菌素，如土霉素、呋喃唑酮( 已禁用) 、含氯制剂、 含碘制剂等，这些药物在起到防病治病的同时，也会对养殖环境造成污染，尤其对 水中的微生态系统造成损害，使水中的自然净化能力降低。渔药的滥用破坏了生态 平衡，进一步加剧水生动、植物病害，形成恶性循环；同时水生动、植物耐药性增 强，增加了疫病防治的难度，更为严重的是药物在水生动、植物体内积累残留量增 大，直接威胁消费者身体健康( 丁义，2 0 0 7 ) 。 近年来，由于养殖水体污染的不断加重，发生的污染死鱼事故不断增多。在一 些水产养殖区，虽然没有出现养殖鱼大量死亡的现象，然而随着养殖场使用年限的 增长，生产效率降低；生物病害日趋严重。据不完全统计，2 0 0 2 年我国共发生渔业 污染事故1 2 5 5 次，直接经济损失约3 1 8 8 亿元。其中海洋渔业污染事故6 3 次，污染事 故面积约2 8 万h m 2 ，造成直接经济损失约2 1 3 2 亿元，经济损失在1 0 0 0 万元以上的特 大渔业污染损害事故4 次，在1 0 0 万元以上的重大渔业污染事故1 0 次；内陆渔业水域 渔业污染事故1 1 9 2 次；污染面积约1 3 万h m 2 ，造成直接经济损失约1 1 5 6 亿元；超过 1 0 0 万元以上的重大渔业污染损害事故2 5 次。环境污染造成可测算天然渔业资源经济 损失3 6 1 2 亿元；其中内陆水域天然渔业资源经济损失为8 1 7 亿元；海洋天然渔业资源 经济损失为2 7 1 5 亿元。 3 枯草芽孢杆菌的同定化及其净水效果的研究 1 2 微生物净水技术在水环境治理上应用 1 2 1 在湖泊景观水治理上的应用 近年来，在城市绿地、公园建设和居住小区的建设中，人工湖泊、景观池塘及 景观水池不断涌现。城市景观水体多为静止或流动性差的封闭缓流水体，一般具有 水域面积小、易污染、水环境容量小、水体自净能力低等特点，加上居民生活和水系 中鱼类的影响，极易造成水中悬浮物增多、浊度增大，有机物、细菌和大肠杆菌的 含量都增高。在温度较高时，富含n 、p 等营养元素的水体中还会滋长藻类，藻类的 异常繁殖会破坏环境的生态平衡，湖水呈现明显的绿色，水体色度较高，一般可达 几十度甚至上百度，并伴有明显的鱼腥味，有时甚至造成水体发黑发臭，丧失了景 观水体的功能，因此景观水体的处理有其必要性和迫切性( 郭迎庆，2 0 0 5 ) 。景观 水体的水质维护主要是控制水体中c o d 、b o d 5 、t n 、t p 等污染物的含量及藻类等 的生长( 使其不过度繁殖) ，保持水体的清澈、洁净，水处理的目的是为了保持整个 水域的水质( 邹平等，2 0 0 3 ) 。 微生物制剂技术应用于水体改善是选育高效菌株处理污染水体，其过程是以酶 促反应为基础，通过生物体内产生的具有催化作用的特殊蛋白质作为催化剂，净化 污水、分解淤泥、消除恶臭、降解氮磷、抑制藻类生长，达到控制水华的作用( 丁 凯，2 0 0 5 ) 。 庞金钊、杨宗政等人应用优势菌剂处理天津大学校园内富营养化较为严重的“敬 业湖”的试验结果表明，投加光合菌、硝化菌、复合菌的混合液对水中的浊度、叶 绿素a 有明显的去除效果，投菌后的第8 天对浊度的去除率就达到了8 8 ，c o d m n 、 氨氮、叶绿素a 等的含量均显著降低( 庞金钊等，2 0 0 3 ) 。盛彦清等人报道，应用 人工复氧技术并投加生物制剂及底质改良剂等，对严重富营养化的湖泊水和黑臭河 涌水进行了生物修复试验。模拟试验结果表明，在适度的人工复氧前提下，投加生 物制剂及底质改良剂等，能够使两种水体的化学需氧量( c o d c r ) 、总氮、总磷等污 染物的含量均降低8 0 以上。用同样的方法对广东省广州市天河区某公园内一个观 赏湖泊现场试验，发现c o d c r 、t n 和t p 等污染物含量的降幅也能达到7 0 左右( 盛 彦清等，2 0 0 5 ) ，并发现投加的生物制剂及底质改良剂等微生物群体能够壮大污染 环境中的土著微生物，对底泥中污染物的降解有一定的促进作用。本实验室运用枯 草芽孢杆菌、反硝化细菌以及光合细菌对武汉北湖进行了三个月左右治理，发现净 水效果显著。t p 从0 5 0 3 m g l 下降到0 0 8 5 m g l ，t n 从2 6 8 m g l 下降到1 3 2 m g l 。 对北京大观园治理一个半月的试验中，c o d m 。从最初的4 0 0 0m g l 下降至6 月5 号 的1 3 8 4m g l ，t n 含量从最初的9 8 6m g l 下降至1 9 8m g l ，去除率为7 9 9 2 ， t p 含量从最初的0 9 1 m g l 下降至0 7 4m g l ，去除率为1 8 6 8 ，试验场地严重污染 区的恶臭气味去除。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 2 2 在水产养殖环境控制上的应用 微生态制剂在水产养殖中的作用主要体现在营养特性、免疫特性和改善生态环 境三个方面。许多的微生态制剂其菌体本身就含有大量的营养物质，并在其生长代 谢过程中产生各种有机酸、合成多种维生素等营养物质。如p s b 富含蛋白质，还有 多种维生素、钙、磷和多种微量元素等，同时随着它们在动物消化道内的繁殖、代 谢，可产生动物生长所必需的营养物质( 崔竞进，1 9 9 7 ：张庆等，1 9 9 9 ) ，如氨基酸、 维生素等；产生生长素之类的生理活性物质，有助于食物的消化吸收；某些芽孢杆 菌，可以产生较强活性的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等消化酶类，协助动物消化饵料； 产生各种b 族维生素，加强营养代谢，从而提高饵料转化率。另外，微生态制剂中 的有益菌是良好的免疫激活剂，能有效提高干扰素和巨噬细胞的活性，通过产生非 特异性免疫调节因子等激发机体免疫功能，增强机体免疫力和抗病力。同时，有益 微生物还可以降解和转化有机物，分解残留饵料、动植物残体，减少或消除氨氮、 硫化氢、亚硝酸盐等有害物质，改善水质( 陈永青等，2 0 0 5 ) 。 目前，微生物修复技术在水产养殖水环境控制上已得到普遍接受和应用。某些 微生物( 如光合细菌、诺卡氏菌、绿藻、席藻、螺旋藻和小球藻等) 和微生物n n ( 如 光合细菌制剂、芽孢杆菌制剂、c l e a r f l 0 1 2 0 0 菌剂和高效复合微生物菌群等) 均具有 良好的净化水质的效果( 赵学伟，2 0 0 3 ) 。经研究表明，光合细菌是水体中c 、n 、 s 循环的主要参与者( 王德芝，1 9 9 7 ) ，能降低水体中氨氮、亚硝酸盐、硫化物、 b o d 以及c o d 的含量，增加d o ，降解有毒物质、有机物，减少有害微生物的数 量，提高水中浮游动、植物的数量，提高幼体出苗率和变态率( 吴伟，1 9 9 7 ) ，减轻 养殖动物疾病发生率，促进养殖动物健康生长，提高成活率和产量，可减少养殖池 塘的换水量和换水次数，对改善养殖环境有明显效果( 倪纯治，1 9 9 7 ) 。t h o m p s o n 等报道，硝化细菌应用于试验池中会形成生物膜，去除氨氮的效率很高( t h o m p s o n f l ，e t a l 2 0 0 2 ) 。蛭弧菌应用于养殖环境中，能稳定d o 、p h ，有效控制c o d 、硫化物 和氨氮的含量，减少细菌总数，提高鱼类成活率，鱼类的增重效果显著( 陈家长， 2 0 0 3 ) 。吴伟等利用假丝酵母处理水体中的亚硝酸盐时，其降解速率达0 0 3 6m g l h ， 并发现水体中的亚硝酸盐含量、c o d 和c a 2 + 与m g 的比例对其降解速率有影响( 吴 伟等，2 0 0 1 ) 。此外，芽孢杆菌也能降解养殖池中的有机物，包括残饵、排泄物、 浮游藻类的尸体和池底的有机淤泥，使之生成硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等无机盐类， 避免有机物在养殖池的沉积，维持了良好的生态环境。任保振( 任保振，2 0 0 2 ) 等、 王广军( 王广军，2 0 0 2 ) 等向温室养鳖池中投喂含有蜡质芽孢杆菌的有益微生物后， 水体中有机污染物、c o d 、氨氮、亚硝酸氮的含量降低，池水和底沙中的异养细菌 数量明显增加( 丁义，2 0 0 7 ) 。本实验室在海南英州江洋养殖场进行了斑节对虾精 养高位养殖池应用实验，在施用枯草芽孢杆菌后，养殖池中有害物质如亚硝酸盐、 5 枯草芽孢杆菌的固定化及其净水效果的研究 硫化氢显著减少，c o d 较对照池大幅度下降。在欧美、日本、印度尼西亚以及泰国 等国家的水产养殖业中，微生态制剂得到广泛的应用，创造了巨大的经济效益。 1 2 3 微生物净水技术特点和优势 净水微生物主要是人为选定的特效降解菌的优势菌种，应满足以下3 个基本条 件：投加的菌体活性高；菌体可快速降解目标污染物；在系统中不仅能竞争 生存，而且可维持相当数量。与物理、化学方法相比，微生物处理法具有一系列特 点和优势：( 1 ) 污染物的转化过程不需要高温、高压，在温和的条件下经过酶催化 即可高效并相对彻底完成，处理费用低廉( 王梦亮，2 0 0 1 ) ；( 2 ) 微生物具有来源广、 易培养、繁殖快，对环境适应性强和易实现变异等特性，适当地对其加以培养繁殖， 特别是在一定条件下加以驯化，就能使之很好地适应各种有毒的工业废水、生活污 水等环境，通过有针对性地对菌种进行筛选、培养和驯化，可以使大多数的有机物 实现生物降解处理，应用面宽；( 3 ) 微生物处理不仅能去除有机物、病原体、有毒 物质，还能去除臭味、提高透明度、降低色度等，处理效果良好( 全学军等，2 0 0 3 ) 。 1 2 4 微生物净水技术在实际应用中存在问题 微生物净水技术在在湖泊、景观水处理以及养殖水体处理中取得了良好的应用 效果，并具有广泛的应用前景，但在实际应用中还有许多问题有待解决。微生物 净水技术一般在好氧条件下效果良好，在厌氧条件下效果往往不甚理想，有效微生 物菌群在厌氧条件下对c o d 的去除不起促进作用( 孟范平等，1 9 9 9 ) ；微生物净 水技术采用直接投放的形式，一般需要每隔一周或者更短时间投菌一次( 孙德文， 2 0 0 2 ) ，而且微生物制剂进入水体后容易被鱼类和浮游水生生物吞食影响净水效果。 实际应用中茵剂使用量大，消耗人力物力财力；微生物由于一次性投放到水体环 境，容易与水体中的土著微生物竞争，微生物在水体中存活状态、作用状态不稳定， 发挥净水作用的时间受到影响。 因此，研究如何克服微生物净水技术在净水过程中受到溶氧限制问题，如何节 约微生物净水制剂使用量，延长微生物净水作用时间等将有助于完善微生物净水技 术，并促使其在湖泊、景观水及养殖水体治理上得到推广应用。而微生物的固定化 技术正是基于这种需要成为研究的热点。 1 3 微生物固定化技术 微生物固定化技术是2 0 世纪6 0 年代由生物化工中的固定化酶技术发展起来的生 物技术( 吴菌见等，2 0 0 3 ) 。所谓固定化技术是用化学或物理的方法将游离细胞定 位于材料的限定空间中，并使其保持生物活性且可反复利用的生物技术( 杨柳燕等， 2 0 0 3 ) 。该技术最初主要用于工业发酵，2 0 世纪7 0 年代以后，由于水污染严重，迫 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 切需要一种高效、快速且能连续处理的废水处理技术，从而微生物固定化技术应用 于污水处理的研究逐渐得到重视。 这种技术应用于废水处理有利于提高生物反应器内的微生物浓度，利于反应后 的固液分离，缩短处理的时间。此外，还可有效地实现除氮、去除重金属离子及难 于生物降解物质的功能，是一项高效节能、运行操作和管理方便的废水处理新技术 ( 吕绿洲等，2 0 0 6 ) 。 1 3 1 微生物固定化载体 固定化载体为微生物创造了更不易解体的生存环境，所以一个理想的固定化载 体的选择也很重要。适合于废水处理的固定化载体应具有以下性能：对微生物无 毒，生物滞留量高；传质性能好；性质稳定，不易被生物降解；机械强度高， 使用寿命长；固定化操作简单；对其他生物的吸附小；价格低廉( 任海波， 2 0 0 4 ) 。 目前所使用的微生物固定化材料非常广泛，但从根本上可以划分为两大类，即 无机类载体及有机类载体。 1 3 1 1 无机类载体 这种载体主要为无机材料构成，它们在微生物固定化技术发展的各个阶段都起 到了不可估量的作用。从最早的砂石到今天广为应用的活性炭均为无机类载体。在 当今微生物固定化技术发展中，常用的无机类载体通常有：砂子，碳酸盐类石，各 种玻璃材料，沸石类，陶瓷材料，碳纤维，矿渣，活性炭( 包括颗粒及粉状活性炭) ， 金属类( 如铝和不锈钢) ，等等。 大多数无机类载体机械强度相对较好，然而自身比重较大，不适宜做流化态运 行，在目前所使用的悬浮载体生物膜反应器中的应用受到限制。 1 3 1 2 有机类载体 有机类载体是目前在微生物固定化技术发展中最受人们关注的固定化材料。随 着聚合物加工技术的不断进步，具有不同功能的聚合物载体不断出现，这些载体在 强度、比重等各个方面都具有较为明显的特点，在实际应用中最为广泛。有机类载 体主要有：p v c ，p s ，p e ，p p ，各类树脂，塑料( 包括各类泡沫材料) ，纤维，明 胶等等。 有机类生物载体可以根据生物过程的需要，加工成各种形状，以便最好地满足 反应器物理、生物特性的需要，特别是聚合物类型有机载体在工业实践中已得到广 泛应用。在实际工作中，一方面可以根据特殊需要对生物膜载体表面性质进行改性， 另一方面也可以选用已经商品化的工业载体直接应用于生物膜反应器。目前国外市 场上商品化的生物膜载体主要有：美国的b i o r a d 公司生产的b i o c a r r i e r ，f l o wl a b s 7 枯草芽孢杆菌的同定化及其净水效果的研究 公司生产的s u p e r b e a d s ；丹麦n u n c 公司生产的b i o s i l o n ，瑞士p h o r o m a c i a 公司生 产的c y t o d e x l ；英国w h a t m e n 公司生产的d e 一5 2 。这些产品大多呈球状，比重在 1 0 3 1 0 5 左右，直径尺度为1 0 0 2 0 0i x m 附近，比表面积大约为5 0 0 0m 2 g ( 刘雨， 2 0 0 0 ) 。 1 3 2 微生物固定化方法 固定化微生物的制备方法多种多样，国内外没有统一的分类标准，根据微生物 固定机制不同将其分为表面吸附固定技术、键联固定技术、细胞间自交联固定技术、 多聚体包埋技术和孔网状载体截陷固定技术( 刘雨等，2 0 0 0 ) 。 1 3 2 1 表面吸附固定技术 吸附法是利用微生物所具有的可吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力， 将微生物吸附在附加剂表面的方法。它可分为自然吸附固定以及通过化学键作用产 生表明吸附的两种形式。物理吸附法是使用具有高度吸附能力的吸附剂将细胞吸附 到表面上使之固定化。这些载体带有多孔结构，靠吸附作用和电荷效应将微生物细 胞固定。载体的空隙为微生物生长和繁殖提供了空间，有利于增加细胞密度。 物理吸附技术在环境工程以及生物工程中的应用是极其普遍的。1 9 8 0 年 a n d e r s o n 等人( a n d e r s o nj ge ta 1 ，1 9 8 0 ) 利用p p 作为载体固定化黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 生产柠檬酸；1 9 8 1 年a n o n 利用棉纤维固定运动发酵单孢菌( z y m o m o n a s m o b i l i s ) 来进行乙醇生产( a n o n ，1 9 8 1 ) ；而g h o m m i d h 等人也曾利用孔隙玻璃固定卡 尔波斯酵母( s c a r l s b e r g e n s i s ) 生产乙醇( g h o m m i d hc e ta 1 ，1 9 8 2 ) ；h i m e s 以及n i l s s o n 等人也曾分别以离子交换树脂及交联明胶作为载体用来繁殖动物细胞( i - l i m e se t a 1 ，1 9 8 7 ；n i l s s o ne ta 1 ，1 9 8 2 ) ；m e s s i n g 利用活性炭固定活性污泥微生物处理污水 ( m e s s i n g ，1 9 8 2 ) 。 1 3 2 2 键联固定技术 键联固定技术是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价 键连接，从而固定微生物。这种固定方式要求生物膜载体表面具某种活性基团，通 常可对载体表面进行改性，达到携带活性基的目的。该方法固定化微生物稳定性好， 不易脱落，但限制了微生物的活性，同时反应激烈，操作与控制复杂，条件苛刻。 1 9 7 8 年k e n n e d y 曾利用氧化钛固定醋酸菌( a c e t o b a e t e rs p e c i e s ) 生产醋( k e n n e d y j e 1 9 7 8 ) ；1 9 7 6 年n e l s o n 利用聚合物固定黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 生产葡萄糖酸 ( n e l s o n ，1 9 7 6 ) ；j a c k 等人在1 9 7 7 年曾运用带有胶基的载体键联固定大肠杆菌( e c o l i ) 生产青霉素( j a c ke ta 1 ，1 9 7 7 ) 。 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 3 2 3 细胞间自交联固定技术 细胞间自交联是自然界普遍存在的一种现象，如活性污泥系统中菌胶团的形成 以及厌氧污泥床中颗粒污泥的产生均是通过细胞间自交联实现的。为了进一步强化 细胞间或酶间的这种自交联程度，可以人为的加入一些交联剂形成细胞间的稳固结 合。交联剂在活性污泥系统中也有应用，有时人为地向曝气池中投加一定量的交联 剂能得到更好的菌胶团，它有利于二沉池中泥水分离及有助于控制曝气池内微生物 浓度。 1 9 7 4 年l e e 等人f l e ee ta 1 ，1 9 7 4 ) 利用聚合性电解质固定黑曲霉( a s p e r g i u u s n i g e r ) ；1 9 7 9 年b u n g a r d 利用聚合性电解质固定节杆菌( a n t h r o b a c t e r s p e c i e s ) ( b u n g a r d ， 1 9 7 9 ) ；t s u m u r a 等人曾利用聚氨基葡糖固定l a c t o b a c i l l u s ( t s u m u r ae ta 1 ，1 9 7 6 ) 。 1 3 2 4 多聚体包埋技术 多聚体包埋技术是将微生物菌体包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，小分子的 底物和产物可以自由出入，而微生物却不会漏出。多聚体在包埋了微生物后，一般 其机械强度不够理想，加之微生物在包埋体中的增长，使得包埋体的破损率较高。 这些无疑在一定程度上限制了多聚体包埋技术在污水生物处理中的大规模应用。 1 3 2 5 孑l 网状载体截陷固定技术 孔网状载体截陷固定技术主要是利用孔网状载体的特殊结构截陷微生物，达到 使其固定的目的。这种方法主要是利用载体的特殊空间结构对固定微生物起到屏护 作用。目前，各国学者已开发出各种孔网状载体并广泛应用于工业实践中。聚氨酯 泡沫塑料，聚乙烯泡沫，中空纤维以及不锈钢网球都是很好的孔网状载体。 1 3 3 水体净化中常用的微生物固定化方法 虽然固定化微生物的制备方法多种多样，但各种固定化方法在实际应用中有较 强的针对性及各自不同的优缺点，都有其一定的适用范围。而报道的各种固定化方 法多应用于细胞增殖以及生产一些工业发酵产品，如乙醇、柠檬酸、葡萄糖酸以及 抗生素等等。 实际水体净化过程所选用的微生物固定化技术相比于工业生产有所不同。野外 水体环境复杂，不能人为地控制，所以适合于工业生产的固定化方法以及生物反应 器不一定适用于污水处理。另外水体处理面积大，必然要求固定化载体成本低廉， 固定化技术简单容易操作。 目前水体净化中应用较多的固定化方法主要有两种：一种是多聚体包埋方法； 另一种是利用物理吸附机理的挂膜法。 9 枯草芽孢杆菌的同定化及j 净水效果的研究 1 3 3 1 多聚体包埋方法 包埋法通常所用的包埋载体有琼脂、海藻酸钠、聚乙烯醇( p v a ) 和聚丙烯酰胺 ( p a c a m ) 、卡拉胶等有机载体，废水处理中应用较多的是p v a 。一般采用p v a 、海 藻酸钠与饱和硼酸发生交联作用制得小球，将微生物包埋在小球内部。但是，这种 方法酯化速度慢，颗粒常出现溶胀现象，容易黏连，此外，交联剂硼酸对微生物有 毒害作用，是导致细胞恬性低的主要原因。 1 3 3 2 挂膜法 由于包埋法存在的颗粒溶胀性问题以及所使用的化学剂容易对细胞活性造成影 响，因而目前各界学者研究最多的还是物理吸附法。该法操作简单，反应条件温和， 细胞酶活性不受影响而且细胞容易从载体上解吸。物理吸附法常用的载体强度大、 传质性好、对细胞无毒害、价格便宜且制备过程简单。一般选取一些多孔性载体， 创造合适的实验条件使微生物吸附在载体表面形成生物膜。常采用的载体有陶瓷、 砂石浮石、活性炭、硅藻土、多孔塑料填料以及纳米材料等等。最近还有很多研究 报道称无纺布作为一种工业材料，不仅价格低廉，而且比表面积大、表面粗糙、微 生物易于附着，在无纺布上可以生长高浓度的微生物。使用无纺布作为悬浮填料对 水体进行处理发现净水效果良好( 金冬霞等，2 0 0 2 ；高孟春等，2 0 0 5 ) 。 使具有代谢活性的微生物在处理系统中的滤料上固定生长的过程就是挂膜，也 即培养和驯化过程。微生物在载体表面的附着过程是生物膜形成的关键。影响挂膜 的因素较多，但主要可以归为三类：微生物的性质、载体表面性质以及环境特性。 生物膜挂膜方法有自然挂膜和人工( 接种) 挂膜挂膜两种。一般在夏季水温较高，污