（材料学专业论文）酶催化羟乙基淀粉的接枝改性.pdf

摘要 摘要 羟乙基淀粉( h y d r o x y e t h y ls t a r c h ，l i e s ) 是将羟乙基引入支链淀粉中。本论文首先研究 在有机溶剂d m s o 中利用猪胰脂肪酶催化羟乙基淀粉接枝己内酯，己内酯先开环聚合 再接枝，即己内酯是以长链端接枝的。利用傅里叶转换红外光谱仪和核磁共振仪对接枝 共聚物的结构进行了表征。通过核磁共振谱图和p h 滴定法计算法计算反应接枝质量比， 发现其结果相符。系统研究了反应温度、p h 值、己内酯与羟乙基淀粉的摩尔比以及体 系水活度对接枝质量比的影响。最高的接枝质量比可达到6 6 5 。 本论文还研究了在有机溶剂d m s o 中利用诺维信4 3 5 酶催化羟乙基淀粉接枝丙交 酯。并且丙交酯和己内酯一样，均是先开环聚合再接枝，丙交酯也是以长链端接枝的。 利用傅里叶转换红外光谱仪和核磁共振仪对其结构进行了表征。同样研究了反应条件对 接枝质量比的影响。最高的接枝质量比可达到5 2 。 本论文利用荧光光谱，动态激光光散射及透射电镜研究了这些接枝物在水中的形 态，发现由于疏水改性接枝物具有双亲性，在水中易形成流体动力学半径为3 0 0 8 0 0 n m 左右胶束。而其热性能的研究发现接枝物出现了t g ，其加工性能得到了改善。 关键词：羟乙基淀粉；己内酯；丙交酯；疏水改性；酶催化 a b s t r a c t a b s t r a c t h y d r o x y e t h y ls t a r c h ( h e s ) i sap r o d u c tw i t hi n d u c i n gh y d r o x y e t h y lo n t os t a r c h i nt h i s p a p e r ，h y d r o x y e t h y ls t a r c h e - c a p r o l a c t o n eg r a f t e dc o p o l y m e rw a ss y n t h e s i z e db yu s i n g p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s ea sc a t a l y z ei nd m s os o l u t i o n i nt h i sr e a c t i o n ，e - c a p r o l a c t o n e o c c u r r e d o p e n - c y c l ep o l y m e r i z a t i o nf i r s t l y a n dt h e n g r a f t e d o nt h eh e s ，i e p o l y ( e - c a p r o l a c t o n e ) i n s t e a do fe - c a p r o l a c t o n eg r a f t e do nt h eh e s t h es t r u c t u r eo ft h e c o p o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db yf t i ra n d1 h n m r t h eg r a f t e dr a t eo fc o p o l y m e rw a s m e a s u r e db y 1h - n m r a n dp hv a l u et i t r a t i o n t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，i n i t i a lw a t e ra c t i v i t y ， p ha n dt h e r a t i oo fc lt oh e so nt h eg r a f t e dc o p o l y m e r i z a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h e m a x i m u mg r a f t e dr a t ew a sa b o u t6 6 5 h y d r o x y e t h y l s t a r c h l - l a c t i d e g r a f t e dc o p o l y m e rw a sa l s os y n t h e s i z e db yu s i n g n o v o z y m e 4 3 5a sc a t a l y z ei nd m s os o l u t i o n t h er e a c t i o nm e c h a n i s mi ss a m e 、析1t h a to f h e s - c a p r o l a c t o n eg r a f t e dc o p o l y m e r t h es t r u c t u r eo ft h ec o p o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db y f t i ra n d 1h - n m r t h ee f f e c to fr e a c t i o nc o n d i t i o n so nt h eg r a f t e dr a t ew a ss t u d i e d t h e m a x i m u mg r a f t e dr a t ew a sa b o u t 5 2 f u r t h e r , t h ea g g r e g a t i o no ft h e s ec o p o l y m e r si nw a t e rw a si n v e s t i g a t e db yu s i n g f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n ga n dt e m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e h y d r o p h o b i cm o d i f i e dh e sc o u l da s s e m b l yt om i c e l l e sw i t l lh y d r o d y n a m i cr a d i u si nt h e r a n g eo f3 0 0 8 0 0 n m k e y w o r d s ：h y d r o x y e t h y ls t a r c h ；e - c a p r o l a c t o n e ；l - l a c t i d e ；h y d r o p h o b i cm o d i f i c a t i o n ； e n z y m a t i cc a t a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学 或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：际风 日期： 沙缝移冈肜田 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南 大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： 拯篓垒丝彦 蹬豳迦 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 淀粉是一种可再生和可生物降解的水溶性天然高分子材料。它的价格比较低廉，来 源也特别广，广泛存在于许多植物的种子、茎或块根中。它降解的产物无毒无害，在自 然界中可形成良性循环，因此常用淀粉来做能缓解环境污染的可降解材料【l 】。由于它的 粘合、凝胶、成膜等性能比较好，常用于食品、医药、化工、造纸、纺织等行业中【2 】。 从化学结构角度而言，淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉通常称为链淀粉，它是 由d 葡萄糖单元间经q 1 ，4 糖苷键连接而成的；而支链淀粉则是由d 葡萄糖单元间经q 1 ，6 糖苷键和q 1 ，4 糖苷键连接，其支叉位置在q 1 ，6 糖苷键( 如图1 所示) 吲。 图1 淀粉的化学结构( a ：直链淀粉；b ：支链淀粉) f i g u r elt h e 姗c t i 】r eo fs t a r c h ( a ：a m y l o s e ；b ：a m y l o p e c t i n ) 但由于天然淀粉在实际应用中有易霉变、老化、加热糊化后增稠、力学性能不佳、 加工困难等缺点，因此须对淀粉进行改性处理，改善某些机能【4 5 1 。其中接枝共聚改性有 很多研究，由于接枝产物具有卓越的性能得到了广泛的应用，以前淀粉的接枝改性主要是 采用烯类单体如丙烯酸酯类、丙烯酰胺、丙烯腈、醋酸乙烯酯等进行接枝改性【6 】。然而 烯类单体为支链的接枝共聚物其生物可降解性差。因此，生物可降解材料的研究开始进 一步关可降解的并且可以作为直链的单体，所以可生物降解的脂肪族聚酯备受关注。淀 粉脂肪族聚酯接枝共聚物不仅可以作为增容剂，还可以单独作为可降解的生物相容性 材料在生物医药领域、缓释领域等广泛的应用【7 1 。 目前，淀粉与烯类单体接枝改性所用的催化剂主要是钛酸四丁酯、辛酸亚锡、铬酸 l 等化学催化剂，在此反应中存在很多缺点，例如说催化剂很难除尽而引入杂质、产物 的颜色发黄、反应的步骤也比较多等等，因此人们需要寻找新的合成方法。众所皆知， 酶在催化方面具有高效性，专业性，定向性等优点，所以人们利用酶作为催化剂，得到 了纯度比较高，色泽比较浅的产物，并且相比用化学催化剂而言，此反应的温度比较低 【l 引。现在酶催化已在很多领域应用，例如有机化学、食品、医学等等【l3 1 。 羟乙基淀粉( i - i e s ) 由高分支支链淀粉经酸水解、羟乙基化后制得。化学名称为：聚 ( o 2 羟乙基) 淀粉。羟乙基淀粉注射液是欧洲目前最常用的血浆代用品，为治疗和预 防低血容量和休克的首选药物。h e s 之所以能代替血浆主要是由于不必考虑血型相匹 配、它具有起效快而强的扩容作用，并且可避免由于输血造成的病毒感染。b r e c h e r me 、 刘叶民、徐桂芸等人研究了人体内淀粉酶分解羟乙基淀粉的速度与羟乙基在葡萄糖环上 江南大学硕士学位论文 的位置( c 3 、c 2 或c 一6 ) 和各位置上的取代量之间的关系。2 0 0 7 年a h m e db e s h e e r 等 研究了h e s 与十八酸、十六酸等的接枝反应，从而使得h e s 在药物的控制与释放领域 的应用成为可能【1 4 1 。本课题即开展了用酶催化合成羟乙基淀粉与聚酯的接枝共聚物的研 究。 1 2 淀粉改性的研究 上世纪发展最快的材料大多数来自不可再生资源石油。随着全球能源危机日益 严重，要求我们不得不寻找新的能源。来自农产品中的淀粉具有可再生性，并且产物具 有可降解性，对环境无污染等特点成为人们首选代替品，也成为众多研究对象。 淀粉是多羟基糖类，每个结构单元均含有3 个羟基，这使得分子内和分子间存在大 量的氢键，在加工过程中需要加入增塑剂来降低氢键。实际上由于淀粉分子中有大量的 氢键存在使得淀粉加工困难、力学性较差、且耐低温、耐湿性差，从而限制了淀粉的使 用，所以要求我们对淀粉进行改性。 1 2 1 氧化淀粉 目前工业上制备氧化淀粉最常用、也最经济的氧化剂是次氯酸钠，其次还有过氧化 氢和高锰酸钾等【l 孓1 6 1 。氧化淀粉反应原理为在反应过程中淀粉分子链端的醛基和c 6 上 的羟基被氧化成羧基，而c 2 、c 3 、c 4 上的羧基被氧化成酮基，由于c 2 、c 3 链具有q - 二酮结构很容易被切断生成两个醛基或两个羧基，使得淀粉在水中的溶解度增大。克奥、 张燕萍和王彦斌等人【r 7 。2 0 】对制备氧化淀粉时采用哪种氧化剂效果会比较好，研究结果表 明在制备粉状氧化淀粉时以滴加方式加入次氯酸钠效果比较好，其中王彦斌等人又分别 以次氯酸钠和过硫酸钾为氧化剂生产氧化淀粉，结果表明，且次氯酸钠淀粉中效果更好； 在酸性条件下制备涂料成膜物质时采用高锰酸钾氧化淀粉的效果会比较好。 1 2 2 酯化淀粉 酯化淀粉是指用无机酸或有机酸酯化淀粉的羟基而得到的产品，然而酯化淀粉存在 以下问题：酯化效率不高、酯化剂价格比较高，在酯化的过程中淀粉分子量的剧烈下降， 降低了淀粉的内聚能，这使得酯化淀粉不适合制备热塑性塑料。酯化淀粉的产品主要包 括醋酸酯淀粉、磷酸酯淀粉、尿素淀粉、黄原酸酯淀粉、烯基琥珀酸酯淀粉等。 1 2 2 1 醋酸酯淀粉 制备醋酸酯淀粉的方法有两种。一是“一步法即直接酯化，杨建洲等人曾用醋酸 酐和醋酸乙烯酯作为酰化剂来酯化玉米淀粉并且探讨了原料配比、p h 值、反应温度及 时间对反应的影响【2 1 1 。二是“两步法”即先预氧化再乙酰化的，用此法得到的产品粘度 比较低、热稳定性比较强。田培善等人先把淀粉氧化，再用醋酸酐和醋酸乙烯酯作为酰 化剂，制得醋酸酯淀粉。并且研究发现，用这种方法制得的醋酸乙烯酯在工业化生产过 程中p h 值更易控制2 2 1 。 2 第一章绪论 1 2 2 2 磷酸酯淀粉 磷酸酯的制备方法有两种：干法和湿法。干法是先将磷酸盐溶解在尽可能少的水中， 再把溶液和干淀粉中混合均匀，反应温度为1 4 0 - - 一1 6 0 。湿法在制备时要注意控制 p h 值，否则会影响产率，在使用湿法制备时可以加尿素作为催化剂。但目前磷酸酯淀 粉取代度比较低团】。p i e s c h e l 2 4 1 等人研究出当温度在9 0 - - 1 4 0 ，压力为1 0 0 帕的真 空容器中，原料配比n ( 淀粉) ：1 1 ( 磷酸化试剂) ：n ( 尿素) = l ：( o 1 - - 一0 5 ) ：( 0 3 - - 0 4 ) 时合成磷酸酯淀粉的取代度比较高，但此产物在常温下不水解。g - r a z l 2 5 j 等人现对淀粉进 行预处理，然后将不同比例的淀粉与尿素、磷酸钠，磷酸等混合均匀，用微波加热，并且 温度控制在1 0 5 1 2 5 之间，得到产物p i - i 呈中性。通过f t i r 、g p c 、s e m 和x r d 等 表征手段进行，发现利用微波制备酯化淀粉。m a h m o u d t 2 6 】等人以磷酸氢钠和磷酸氢二钠 与淀粉制备磷酸淀粉，并且发现随着磷酸盐与淀粉的摩尔比从0 5 上升到3 5 ，获得磷 酸淀粉的酯化度由0 0 9 上升到0 2 5 。然后对酯化淀粉进行了生物降解实验，发现经过 磷酸化后的淀粉，随着取代度的提高降解速度下降。c h a n g 和l i i t 2 7 】也制备出了磷酸淀粉 酯，并且反应的酯化效率高。 1 2 2 3 氨基甲酸酯淀粉( 尿素淀粉) 目前尿素淀粉的制备同样有干法和湿法之分，但大多数采用干法。干法就是先将淀 粉加到含催化剂的尿素水溶液中，再脱水干燥、烘干，然后在1 1 0 温度下反应一段时 间，再烘干即可得到产品【2 引。在此反应中尿素起着交联剂和取代基的作用，反应结束后 由于交联作用，淀粉经分子量增加，此反应中还引进了氨基甲酸酯基团，其具有良好絮 凝性能的和很好的除色效果。 1 2 3 醚化淀粉 醚化淀粉是指淀粉分子中的羟基与反应活性物质在碱性条件下反应生成的淀粉取 代基醚。 1 2 3 1 羟烷基淀粉 羟烷基淀粉主要由是羟乙基淀粉和羟丙基淀粉两种。其中羟乙基淀粉是由支链淀粉 与环氧乙烷或氯乙醇在碱性条件下反应而制得的【2 9 1 。羟乙基淀粉中醚键的稳定性比较 高，在水解、氧化、交联、羧基化等化学反应中醚键不会断裂，并且受电p h 值的影响比 较小，所以能在比较宽p h 值范围内使用。 1 2 3 2 羧甲基淀粉 羧甲基淀粉是一种阴离子淀粉醚，是由淀粉在碱性条件下，与一氯乙酸或其钠盐起 醚化反应而制得的羧甲基钠盐，习惯上称为羧甲基淀粉。魏文珑等【3 0 1 报道了用玉米淀 粉来制得羧甲基淀粉的工艺。羧甲基淀粉能溶于冷水，并且粘度较高，具有增稠作用。 但羧甲基淀粉的水溶液耐盐能力比较差，一旦与金属离子接触即生成沉淀，化学性质也不 江南大学硕士学位论文 够稳定，而且很容易被空气中的细菌分解，贮存时间特别短，这使得其在应用上受到了很 大的限制。 1 2 4 阳离子淀粉 淀粉与胺类化合物反应生成含氨基和铵基的醚衍生物，因氮原子上带有正电荷而称 为阳离子淀粉。根据胺类化合物的结构，可将其分为四类：叔胺型、季铵型、伯或仲胺 型和杂醚。在实际应用中主要是前两种【3 1 1 。黄佩芳等用阳离子醚化剂和碱性催化剂的混 合物进行反应，合成了季铵型阳离子淀粉，探讨了此反应的最佳条件 3 2 j 。由于氮原子上 带有正电荷使得阳离子淀粉可以用在处理原水中带负电荷的胶体颗粒上。 1 2 5 接枝淀粉 淀粉的接枝共聚方法可分为三类：自由基引发法、离子相互作用法和缩合加成法。 现在目前第一种方法使用的比较多。而自由基引发法本身又分为物理引发和化学引发两 种。其中化学引发又称为氧化还原，与前面介绍的氧化淀粉的制备方法一样。与淀粉接 枝的单体主要有丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯酸、乙酸乙烯、苯乙烯等。接枝淀粉主要分为 以下两大类：( 1 ) 与烯烃类单体的接枝共聚；( 2 ) 与内酯类单体的接枝共聚。 ( 1 ) 与烯烃类单体的接枝共聚 淀粉通过自由基聚合与烯烃类单体进行的接枝共聚反应。虽然接枝后产物的加工性 能得到改善，但由于烯烃类单体单体都是非生物降解性的，所以制得的产品达不到环保 的要求，并且采用化学引发时催化剂难以除尽。所以越来越多的研究者们把目光投向于 第二类接枝反应。 ( 2 ) 与内酯类单体的接枝共聚 与淀粉烯烃类单体接枝共聚物相比，内酯类聚合物本身就可以完全生物降解的材料 【3 3 1 ，接枝后产物同样可以完全生物降解。对这类聚合物材料研究，有助于解决废弃塑料， 并且对治理自然环境的污染也有一定的作用。 淀粉与内酯类单体开环聚合反应的催化剂有以下三类：( 1 ) l e w i s 酸催化剂，如辛酸 亚锡 s n ( o e t h 、钛酸丁酯 t i ( o b u ) 4 、二月桂酸二丁基锡等；( 2 ) 烷氧基金属化合物如三 异丙醇铝；( 3 ) 烷基金属化合物如三乙基铝等【3 4 】。 现阶段对淀粉与内酯类单体的接枝共聚的研究主要是用化学催化剂，e u i j u nc h o i d 等人1 3 5 j 研究了辛酸亚锡催和合成己内酯开环聚合接枝淀粉，所得产物的产率比较高。但 这种方法存在催化剂难以除尽、颜色发黄等缺点。有些研究者又把目光投向新的催化体 系。酶作为催化剂时具有高效性、专业性等特点，所以有人试着把酶运用于淀粉与内酯 类单体开环聚合反应中。 1 3 聚己内酯的研究 聚己内酯由- 己内酯开环聚合制得结构为 c h 2 一( c h 2 ) 4 c o o n 的热塑性聚酯。它的 分子量较低，是一种无色结晶固体。玻璃化温度为6 0 c ，熔融温度6 3 。c ，2 5 0 c 开始分 4 第一章绪论 解。其重复的结构单元上有5 个非极性的亚甲基c h 2 和1 个极性的酯基c o o 。分子 链中的c c 键和c o 键能够自由旋转，这样的结构使得聚己内酯具有很好的柔性和加 工性。聚己内酯中酯基的存在，使得聚己内酯具有生物相容性【3 6 】。它的热稳定性、水解 稳定性和低温特性优良；与多种材料黏合力强。聚己内酯可用作许多聚合物改性剂，改 善其加工性、冲击性、透明性，纤维的染色性，橡胶和炭黑的掺和性。还可用作热熔胶 黏剂。 通常引发己内酯开环聚合的体系包括： ( a ) 活泼氢引发体系，( b ) 阳离子型催化剂， ( c ) 阴离子型催化剂，( d ) 配位聚合型催化剂。 ( a ) 活泼氢引发体系。s a ot o n e 3 7 】等认为这一体系反应的机理为：亲核原子进攻羰 基中的碳原子，酰氧键的断裂开环而引发增长。但是这类反应的反应速率慢，反应需要 较高的温度，聚合产物的分子的分子量分布较宽。 ( b ) 阳离子型催化剂。催化剂主要为l e w i s 酸化合物，甲基氟磺酸、乙基氟磺酸、甲 基硝基苯磺酸、甲基磺酸甲酯等【3 引。此类催化剂具有高活性等特点，但是高活性更容易 引起副反应。并且此类催化剂还易引起解聚，从而影响接枝质量比。 ( c ) 阴离子型催化剂。特丁基锂，特丁基氧锂【3 9 j 是阴离子型催化剂的典型代表。此 类催化剂开环聚合的机理为：负离子进攻羰基碳，然后发生酰氧键的断裂开环，进一步 形成链增长反应。此类催化剂制得的聚合物的分子量分布比较宽。 ( d ) 配位聚合型催化剂。最典型的是稀土化合物引发体系。其体系反应机理是己内 酯先与金属配位，然后有选择地使酰氧键断裂，己内酯插入到金属配体之间。稀土引发 剂具有活性聚合的特点，但稀土引发剂在空气中不稳定，合成和贮存均比较困难。刘建 飞等】报道了用能在空气中稳定存在的稀土乙酰丙酮盐作为催化剂来开环聚合己内酯， 但反应温度要求比较高，耗能也比较多。x ul i n a 等1 4 l 】在温和的反应条件下率先使用 s m ( p p h 2 ) 2 引发c l 开环聚合，与s m l 2 相比，该引发剂具有更高的活性，用其引发 c l 开环聚合可以得到更高分子量的p c l 。研究发现引发剂用量、反应时间对p c l 分 子量、聚合物多分散系数有较大的影响。 由于上述引发己内酯开环聚合的引发体系或多或少都存在着问题，所以人们把目光 转向活性及选择性都比较高、反应条件比较温和、催化剂可回收利用等优点的酶。g r o s s 等【4 2 j 对体外酶催化合成高分子的探讨表明利用酶催化剂可以合成聚酯。常用的酶主要为 猪胰脂肪酶，可应用的反应类型包括缩聚反应、开环聚合反应、酯交换和转酰化等反应。 f o r e s t i 等【4 3 】报道了使用p p 负载的猪胰脂肪酶催化己内酯的开环聚合反应，反应5h 后 单体转化率达到了9 7 ，而用游离的脂肪酶作催化剂在同样的条件下单体的转化率仅 为7 5 。所以在本论文中己内酯与羟乙基淀粉的接枝改性采用猪胰脂肪酶进行催化。 目前国内外对聚己内酯的应用研究主要集中在药物控释载体方面。早在2 0 世纪7 0 年代p i t t 和s c h i n d l e r 就提出p c l 可用作药物控释载体，并对其药物通过性和生物降解 性进行了系统研究。宋存先】等研究了p c l 在大鼠体内的降解情况，发现p c l 的降解 分两个阶段进行：第一个阶段为分子量不断下降但不发生形变和失重，起始分子量6 6 万的p c l 在体内可以完整保存两年；第二阶段是低分子量的p c l 开始变为碎片并发生 江南大学硕士学位论文 失重，最终降解物逐渐被有机体吸收和排泄而不蓄积于体内，因此可以用作体内的药物 控制释放材料。因而本论文研究成果期望在药物控释载体方面得到应用。 1 4 聚丙交酯的研究 聚丙交酯是由乳酸在一定条件下脱水缩合而成的。常温上丙交酯为白色的固体。由 于乳酸分子中有一个不对称的手性碳原子，乳酸可以分为l 乳酸( 左旋乳酸) 、d 哥l 酸 ( 右旋乳酸) 和d ，l 乳酸( 外消旋乳酸) 。在研究丙交酯与淀粉接枝共聚时一般选用 外消旋乳酸，即d ，l 乳酸。 聚丙交酯和聚己内酯一样，具有良好的生物相容性，并且可以完全生物降解，因此 聚丙交酯作为一种环境友好型材料越来越得到人们的重视。聚丙交酯在医学上也有一定 的应用，现在国外正在把聚丙交酯应用在缓释领域，但由于聚丙交酯的玻璃化转变温度 比较低，是一种硬且脆的材料，使得聚丙交酯的应用受到了影响。 1 5 酶介绍 通常情况下，酶都是的水环境中进行催化聚合。但酶在疏水环境中也表现出较强的 活性。 1 5 1 酶在有机相中的催化作用 传统意义上，酶只有在水相体系中才具有催化活性，酶与有机溶剂都不互溶，怎么 样催化的? 这是人们在1 9 8 4 年之前常问的问题。1 9 8 4 年美国研究者k l i b a n o va m 在 s c i e n c e l 4 5 】上发表了一篇研究脂肪酶在有机介质中催化条件。在那篇文章中，介绍了他们 在含有微量水的有机介质中酶成功地催化合成了酯。他在文章中讲到，只要条件合适， 酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双层液相体系，甚 至在含有微量水或几乎不含水的有机溶剂中表现出催化活性。此篇文章报道之后，掀起 了一场研究酶在有机溶剂中催化活性，随后，蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、过氧化物酶、 过氧化氢酶、等十几种适宜的有机溶剂中具有催化活性酶应运而生。 与水相中的酶相比较，有机相中酶除了具有水相中酶一切的催化优点外，还具有以 下特点 4 6 4 7 】： i 使反应热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酯合成、肽合成、酯交换 反应等。 i i 酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用。 i i i 从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。 i v 酶的热稳定性比水中要高。 v 增加了非极性底物的溶解性，有利于高浓度底物连续生物转化。 们抑制与水有关的副产物。 v i i 没有微生物污染。 v j i i 有着广泛的底物专一性。 6 第一章绪论 1 5 2 影响酶催化活性的因素 1 5 2 1 水活度 水活度是指在一定的温度与压力下反应体系中水的蒸气压与纯水蒸气压的比值。非 水体系是指一种含微量水的有机介质体系，一般含水量小于l 。酶在水相中的催化作 用主要是由于酶在水溶液中，酶的蛋白质分子与水形成分子间和分子内的氢键，使其具 有良好的催化活性，因此，水是酶催化过程中不可或缺的一部分。然而维持酶活性的水 量究竟有多少比较好呢? 大量实验证明：不同酶维持活性的水量不同，有人把维持酶活 性的包裹在酶表面的吸附层水量称为必需水。 长期以来，人们一直认为只有在水中酶才具有催化活性。k l i b a n o va m 在文章中写 n - 酶的活性只取决于吸附在酶表面的水分多少而与溶剂含水量无关。低于必需水的下 限，酶会因缺水构象剧烈变化而失活，然而酶也会因水份过多而活性降低。在研究过程 中，常用热力学水活度qw ( w a t e ra c t i v i t y ) 来描述有机溶剂中酶的活性与水量的关系。 现在有关控制水活度的方法报道很多。我们一般常用将酶及底物放置在盛有不同盐饱和 水溶液的密闭容器中，气相平衡，以使酶和底物的水活度与饱和盐溶液的水活度相同 4 8 1 。 1 5 2 2p h 值对酶活性的影响 酶在水相中的催化作用不仅仅是取决于水活度，还取决于此酶所处水环境的p h 值， 每一种酶都有自己催化活性达到最大值的p h 值。在有机溶剂中进行酶催化反应同样也 要依赖于酶中必需水的p h 值。酶分子活性中心周围的离子基团只有在特定的酸碱度条 件下才具有酶催化反应的最佳离子态，而且此必需水的最佳p h 与在水溶液中反应时的 最适p h 是一致的，即有机溶剂中的酶能够“记忆它冻干或丙酮沉淀前所在缓冲液中 的p h 值，z a k s 4 9 等称这种现象为“p h 记忆。z a k s 等人在研究脂肪酶催化三丁酸甘 油酯与正庚醇的转酯反应中发现，酶的反应速度与其冻干前水溶液的p h 密切相关，反 应的最适p h 接近于水溶液中的最适p h 。所以在本论文中所讨论的影响酶的p h 值均接 近7 。 1 5 2 3 热力学稳定性 众所周知，酶活性与热力学有很大的关系。脂肪酶在催化许多反应中表现出较水要 高的稳定性，如脂肪酶在苯中催化酯交换反应中，酶的活力在2 0 - - - 7 0 。c 温度范围内随温 度的升高而增加，7 0 条件下反应几次( 9 6 小时次) 后，仍保持了相当比例高的酶活 力。k l i b a n o v 5 0 】贝l j 是这样解释的，他认为酶稳定性的提高是由于缺少水，限制了由水引 起的酶分子中的天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用和天冬氨酸处肽键的水解以及二硫键 的破坏，使蛋白质失活全过程难以进行。水是酶失活的必须因素，酶的热失活需要其本 身具有高度的柔性。但在有机溶剂中酶的不溶性使酶分子构象的刚性大大增强。所以在 高温下酶在有机溶剂中也能保持适当的折叠，热稳定性大为提高的同时活性中心还类似 在水中。 7 江南大学硕士学位论文 1 6 淀粉接枝物的应用 1 6 1 在缓释领域的应用 杜锡光【5 l 】等人以淀粉为接枝骨架，己内酯和l 丙交酯为接枝单体，分别合成了 淀粉己内酯接枝共聚物( s t g p c l ) 和淀粉l - 丙交酯接枝共聚物( s t - g - p l a ) ，研究其作 为尿素缓释膜，研究发现在水的浸泡下涂膜尿素具有明显的缓释放性能，可以使5 秒内 就完全溶解的尿素释放时间达到2 4 小时以上，并且释放速度逐渐减慢。从三份样品的 比较中可以得出结论：对于s t g p l a 来说，接枝的p l a 段越长，包膜尿素的缓释放时 间越长，缓释放效果越好；s t g p c l 比s t g p l a 的缓释放效果要好。 目前药物缓释材料方面的研究热点是p l a 、p c l 5 2 j ，聚乳酸及其共聚物是无毒的生 物降解型聚合物【5 3 1 ，这类聚合物在人体内也没有积聚问题，其体内代谢是通过聚酯水解， 最终被完全降解为二氧化碳和水，故被广泛用于药物载体材料【5 4 1 。 1 6 2 表面活性剂领域的应用 表面活性剂工业在日化工业中占有相当大的比重，、与人民生切相关。传统的表面 活性剂所用的原料是石油。近年来，由于资源的短缺和环境污染的严重性，迫使人们去 寻求表面活性剂的新的原料来源，因此开发利用以天然可再生资源为原料，低毒或者无 毒及生物降解性好的的表面活性剂已经引起国内外的高度重视。天然有机高分子化合物 淀粉、纤维素和壳聚糖，在自然界中的含量十分丰富，而且价格低廉，来源广泛，可作 为新型表面活性剂的原料。l e iq i a o 等人【5 5 j 合成淀粉a k d 接枝共聚物时研究其流变性 指出，这种新型接枝聚合物具有较高的粘度和较强的疏水性能，可以用作乳化剂、涂料 增稠剂和乳液稳定剂等，为表面活性剂领域开拓新的产品提供了可能性。 1 6 3 在污水处理方面的应用 众所皆知，电镀工厂和铬盐工厂的废水中所含严重的污染物是重铬酸钾，以前用一 些还原剂还原出该废水中的铬元素，近年来，日本有报道说可以利用黄原酸酯淀粉有效 地去除重金属元素铬。 在刘千钧【5 6 1 等人发表的文章两性木素絮凝剂对生物活性污泥的絮凝脱水性能介 绍了评价污泥脱水性能好坏的依据。他们认为在一定时间内过滤滤液的体积是比较污泥 脱水效果的直观指标。滤液越多，则污泥的含水率越低，药剂的脱水效果越好。朱鲁华 【5 7 】等人在生活污泥的脱水实验中，研究发现产品s t s m a s 和p a m 的最佳投加量分别 为1 4 0 m g l 和1 0 9m g l 。加入s t s m a s 后的滤液体积比加入p a m 后的滤液体积大， 且淀粉来源广泛，成本远低于丙烯酰胺单体，此外甲基丙烯磺酸钠的市场价比p a m 低， 且来源广，因此s t s m a s 的性价比优于p a m ，s t s m a s 对生活污泥的脱水性能比p a m 好。 8 第一章绪论 1 7 立题依据和意义 目前，h e s 作为血浆代用品，用于需要全血、血浆治疗的病例。h e s 代替血浆的 优点是不必考虑血型相匹配，并且可避免由于输血造成的病毒感染。b r e c h e rme 、刘叶 民、徐桂芸等人研究了人体内淀粉酶分解羟乙基淀粉的速度与羟乙基在葡萄糖环上的位 置( c - 3 、c - 2 或c 一6 ) 和各位置上的取代量之间的关系。 国内，也开展了一些两亲性淀粉的制备与应用性能研究工作。徐家业等通过淀粉和 3 - 氯- 2 一羟基丙基三甲基氯化铵以及苄基氯反应，制备了季铵基苄基淀粉醚，据称与常规的 原油破乳剂复配使用具有良好的破乳效果；孙云明等将羧甲基淀粉用酰氯酯化制备了羧 甲基淀粉脂肪酸酯，产品可作海上溢油凝油剂等，但研究报道不多。 本课题的意义由于淀粉本身的亲水性比较好，使得h e s 只具单一的亲水性。疏水改 性后的h e s 是变性淀粉研究的一个新领域，在淀粉分子中引入疏水基团，可突破传统变性 淀粉亲水的单一性质，不仅可用作各种用途的可降解材料，还可使其具有抗温、耐盐、抗 剪切、表面活性等新的性能和功能，从而使其应用拓展到新的领域。 立题依据： 目前，h e s 与乙烯基单体接枝改性是重要方法，但在降解过程中，接枝链无法迅速 降解，从而失去环保意义，而h e s 与脂肪族聚酯的接枝产物是一类可以完全降解的高 分子材料。另外，合成方法上主要采用化学催化，合成时易引入杂质，色泽偏黄等，因 此本实验采用脂肪酶作催化剂。 9 江南大学硕士学位论文 第二章酶催化合成羟乙基淀粉己内酯接枝共聚物 2 1 引言 羟乙基淀粉与烯烃基单体的接枝共聚物只有羟乙基淀粉部分可以生物降解，但是羟 乙基淀粉与脂肪族聚酯接枝共聚物则是可以完全生物降解的。一旦这类聚合物材料的合 成并应用于实际，将有助于缓解环境污染的压力，有利于改善环境。聚己内酯( p c l ) 属于脂肪族聚酯的一种，由于它具有容易水解的酯键而具有生物降解性能。p c l 的机械 性能和聚烯烃相似主要是由于重复单元中5 个非极性的亚甲基基团。其重复的结构单元 上的5 个非极性的亚甲基c h 2 和1 个极性的酯基c o o ，分子链中的c c 键和c o 键能够自由旋转，这使得p c l 具有很好的柔性和加工性，可以挤出、注塑、拉丝、吹膜 笙【5 8 】 可。 本章以猪胰脂肪酶为催化剂，己内酯开环聚合成聚己内酯并接枝到羟乙基淀粉 基上，合成了淀粉己内酯接枝共聚物并研究了影响接枝质量比的因素，以及在水中 的形态等。 2 2 实验部分 2 2 1 实验试剂 羟乙基淀粉( h e s ，取代度：o 5 ) ：百灵威公司，乙醇中二次沉淀； 己内酯( c l ，纯度：9 9 ) ：百灵威公司，直接使用； 猪胰脂肪酶：s i g m a - a l d r i c h 公司，直接使用； 芘( p y r e n e ) ：百灵威公司，直接使用； 二甲亚砜( d m s 0 ) ：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 氯化钠( n a c l ) ：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 氯化镁( m g c l 2 ) ：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 溴化钠( n a b r ) - 分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 锂化钠( l i c l ) ：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 硝酸钠( n a n 0 3 ) ：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 甲苯：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，直接使用； 氮气：工业用高纯氮，中国华晶电子集团公司动力工厂，直接使用； 去离子水：江南大学饮品公司，直接使用； 超纯水：江南大学测试中心，直接使用。 2 2 2 实验仪器及设备 往复式水浴恒温振荡器：s h z 8 8 a 型，江苏太仓市实验设备厂； 磁力加热搅拌器：d f 1 0 1 b 集热式，江苏省金坛市医疗仪器厂； 1 0 第二章酶催化合成羟乙基淀粉一己内酯接枝共聚物 脂肪抽出器：上海玻璃仪器公司； 电热鼓风干燥箱：n c l 0 1 1 ，南京干燥设备厂； 真空干燥箱：z k - 8 2 a 型，上海实验仪器厂； 电子天平：j a 2 0 0 3 ，上海衡平仪器厂； 实验室精密p h 计：p h s j 3 f 型，上海精密科学仪器有限公司； 傅立叶红外光谱仪( f t 瓜) ：f t l a 2 0 0 0 1 0 4 型，加拿大a b b 公司； 差示扫描量热仪：瑞士m e t t l e r 公司d s c 8 2 2 e 型热分析系统； 核磁共振仪：g s x 4 0 0 型，日本j e o l 公司； 透射电镜：x l 3 0 环境扫描电子显微镜，p h i l i p s 公司； 荧光分光光度计：r f 5 3 0 1 p c ，日本岛津； 激光光散射仪( l l s ) ：a l v 5 0 0 0 e ，德国a l v 公司。 2 2 3 实验步骤 2 2 3 1 羟乙基淀粉接枝己内酯的制备 在5 0 m l 单口烧瓶中，加入1 0 2 9 ( 约5 m m 0 1 ) 脱脂后的羟乙基淀粉，通氮气5 m i n ， 再依次加入2 0 m l 二甲亚砜，一定量的e 己内酯，5 0 搅拌混合，直至羟乙基淀粉完全 溶解，冷却至室温后加入一定比例的、已处理过的猪胰脂肪酶。设定的温度为5 0 ，转 速为1 8 0 r m i n ，恒温水浴中反应2 4 h 。反应结束后透析五天，冷冻干燥得粗产物。将得 到的粗产物用甲苯抽提4 8 小时，得到产物。 2 2 3 2p h 记忆酶的制备 取适量酶浸泡在浓度为0 2 m o l l 不同p h 值的磷酸缓冲溶液中，搅匀，冷冻干燥。 2 2 3 3 反应初始水活度的控制 室温下将酶与底物放置在盛有不同饱和的盐的水溶液的密闭容器中，气相平衡4 8 h 以上，使酶和底物的水活度与饱和盐溶液的水活度相同，备用。实验中用到的饱和的盐 的水溶液。2 5 时水活度如表2 1 所示。 表2 1 饱和盐溶液相应水活度值( 2 5 ) t a b l e2 - 1w a t e ra c t i v i t yv a l u e so fs e l e c t e ds a l th y d r a t ep a i r sa t2 5 s a l t a w ( 2 5 * c ) l i c l m g c l 2 n a b r n a c l k n 0 3 0 1 l 0 3 3 0 5 7 0 7 5 0 9 4 2 2 4 聚合物的表征与测试 接枝质量比的测定：参考文献【5 9 1 ，采用质量，按下式计算： 江南大学硕十学位论文 g 似) ：墅墨1 0 0 ， 、。 o 式中：w 1 接枝共聚物的质量( g ) ；w o 一淀粉的质量( g ) 。 红外光谱( f t i r ) 结构表征：取适量充分干燥的样品，k b r 压片法，扫描范围： 5 0 0 4 0 0 0 c m 。 核磁共振( n m r ) 结构表征：以d m s o d 6 为溶剂，t m s 为内标，恒温7 0 测试。 荧光光谱的测定：将羟乙基淀粉和己内酯的接枝共聚物溶在芘的饱和溶液中，配成 浓度为1 0 m g m l 的溶液。再用容量瓶将样品的浓度稀释到所需浓度，置于常温下2 4 小时。 荧光的激发波长为3 3 9 n m ，激发和发射的狭缝均为3 n m ，扫描范围为3 5 0 5 0 0 n m 样品池 后为l c m 。 溶解性的测定：称5 m g 不同摩尔比的接枝产物溶解在5 m l 的水中，在常温下搅拌1 2 h 备用。 降解膜片的制备：称取一定量的接枝产物，加热溶在水中，待接枝物完全溶解后把 溶液倒入制模用的玻璃模板框内，烘干，控制膜的厚度在2 m m 左右，然后剪重约0 5 一1 0 9 的膜片。 酸的降解：把取几片膜片一起浸在0 5 m o l l 的h c l 溶液中，过一定的时间，从中取 二片膜片用去离子水冲洗干净，然后放在真空烘箱中烘干至恒重，称取降解后的膜片的 重量。 碱的降解：把取几片膜片一起浸在0 5 m o l l 的n a o h 溶液中，过一定的时间，从中 取一片膜片用去离子水冲洗干净，然后放在真空烘箱中烘干至恒重，称取降解后的膜片 的重量。 1 2 第二章酶催化合成羟乙基淀粉一己内酯接枝共聚物 2 3 结果与讨论 2 3 1 结构表征 2 3 1 1 红外光谱( f t i r ) 分析 4 0 0 03 5 0 03 0 2 5 0 02 0 0 0l5 0 01 0 0 05 0 0 w a v e n u m b e r s ( c m d ) 图2 1h e s 己内酯接枝共聚物( a ) 和h e s ( b ) 红外光谱图 f i g 2 1f t i rs p e c t r ao f ( a ) li e s - c lg r a f t e dc o p o l y m e ra n d ( b ) h e s 图2 1 为h e s 己内酯接枝共聚物( a ) 和h e s ( b ) 红外谱图。在a 、b 谱图中均 可以看到，在3 4 1 0 c m 1 处有一个很大羟乙基淀粉中o h 伸缩振动吸收峰，在8 5 8c m 1 、 7 6 2c m 1 、5 7 6c r n 。有羟乙基淀粉c h 2 摇摆振动吸收峰。b 谱图在1 6 4 0c m l 处只有一个 吸收峰。与b 图相比，a 谱图中，接枝共聚物在1 7 3 5c m 以处有明显的c = o 伸缩振动吸 收峰，证明的确有己内酯接枝到羟乙基淀粉分子上了。据文献报道 6 0 l 羟乙基淀粉在 1 6 4 0 c m 1 附近出现的较强的吸收峰是由于羟乙基淀粉中紧密结合的水引起的，改性后的 产物在此处的吸收峰变小，很有可能是反应过程中羟乙基淀粉晶区结构被破坏，使得与 晶区相结合的水减少，可以作为e 己内酯单体接枝到羟乙基淀粉内部的旁证。 2 3 1 21 h n m r 核磁共振分析 江南大学硕士学位论文 o qa , m 白ed , m 锄q蛳e 弧 r - h o c - c h 2 c h 2 c h 奎c h 2 c h 2 x p c c c h 2 c h 2 c h 2 c 磁o h