（食品科学专业论文）硫酸软骨素和氨基葡萄糖制备及检测方法的研究.pdf

摘要 硫酸软骨素和氨基葡萄糖作为天然有机提取物，两者所具有的独特生物活性及功能，使其戍 用范围逐步扩大，经济效益和社会效益迅速提高。加之其原料资源丰富，价廉易得，适于火规模 制备，成为目前天然提取产物的研究热点之一。本文以牛软骨和壳聚糖为原料，分别研究了硫酸 软骨素和氨基葡萄糖的制备工艺及其检测方法。 试验建立了牛软骨中硫酸软骨素蛋白酶酶解提取_ l 艺。采用四因素三水平中心组合旋转设计 优化牛软骨中硫酸软骨素的酶法提取t 艺条什为：水解温度5 5 、p m l 、酶添加量2 5 m g 、1 4 倍液料比的条件下水解7 小时，硫酸软骨素得率为3 2 4 5 。 试验建立了温和条件降解壳聚糖制备氨基葡萄糖的工艺。通过正交试验优化确定了果胶酶 b e 3 l 降解壳聚糖的酶解作用条件为：料液比1 ：6 0 ，水解时间9 h ，温度5 0 ，酶添加量2 0 m l 。 在酶解壳聚糖基础上，调整酶解液酸浓度为6 m o l l ，7 0 加热水解制备氨基葡萄糖，建立了较为 温和的氨基葡萄糖制备工艺。 试验分别建立了硫酸软骨素和氨基葡萄糖的检测方法。硫酸软骨素定量检测条件为：在浓度 为8 m o l l 的盐酸下，沸水浴水解6 0 m i n ，显色1 5 m i n 。显色后在波长5 5 4 n m 处测定，结果表明： 硫酸软骨素浓度在0 2 0 - - 1 0 0 m g m l 范围内线性关系良好，其回归方程为：a = 0 6 3 1 c + 0 0 4 ，相 关系数r 2 = o 9 9 9 4 。氨基葡萄糖定量检测条件为：6 0 1 2 恒温水浴，氨基葡萄糖盐酸盐与盐酸吡哆 醛缩和反应3 0 m i n 后，加入z n 2 + 6 0 。c 水浴络合3 0 r a i n ，衍生后在e x 3 8 6 n m ，e m 4 7 5 n m 处测定荧 光强度，结果表明，氨基葡萄糖盐酸盐浓度在1 5 6 5 u g m l 范围内线性关系良好，其回归方程 为：c = 0 1 6 5 3 5 4 f + 1 5 7 5 6 8 6 ，拟合优度9 9 1 0 9 。氨基葡萄糖薄层定性展开条件为：正丙醇：水 ：氨水= 1 2 ：4 ：2 。 关键词：硫酸软骨素，氨基葡萄糖，制备工艺，定量检测 a b s t r a c t c h o n d r o i t i ns u l f a t ea n dg l u c o s a m i n ei n s t e a do fm e d i c i n eg r a d u a l l yi nm e d i c a lc a r ea r e a t h ea r e a o fa p p l i c a t i o ni sg r a d u a l l yl a r g e r , t h eb e n e f i t si ne c o n o m ya n ds o c i e t yi n c r e a s eq u i c k l y , f o rb o t ho ft h e m h a v es p e c i a lb i o l o g ya c t i v i t ya n df u n c t i o n c h o n d r o i t i ns u l f a t ea n dg l u c o s a m i n eh a v eb e e no n eo ft h e h o t s p o t si nt h er e s e a r c ho fn a t u r a lp r o d u c te x t r a c t i o na l s ob e c a u s eo fi t sa b u n d a n tm a t e r i a l ，i n e x p e n s i v e ， a d a p t t o p r e p a r a t i o nc o s m i c a l l y t h i sp a p e rs t u d i e dt h ep r e p a r a t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t ea n d g l u c o s a m i n es e p a r a t e l ya n di t sa i l a l y s i sm e t h o d su s i n gc a t t l ec a r t i l a g ea n dc h i t o s a n am e t h o d w a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ee n z y m eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so f c h o n d r o i t i ns u f f a t ei nc a t t l ec a r t i l a g e r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w a su s e dt oe v a l u a t et h e e f f e c to fa l lf a c t o r st ot h er e s u l t s ，a sw e l la su s i n gc e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l ed e s i g n ( c c r d ) t o o p t i m i z et h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a s ：t h eh y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e5 5 2 ，p i l l l ，a d d i n g2 5 m ge n z y m e ，i - ，s 1 4 ：1 ，t h er a t eo fo u t p u t3 2 4 5 a f t e r7 ha tt h e a b o v ec o n d i t i o n am e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fg l u c o s a m i n e o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a su s e dt oe v a l u a t et h ep e c t a s eb e 3 一lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fc h i t o s a n ：s l 1 ：6 0 ，h 3 ，d r o l y s i s t i m e9 h ，5 0 ，e n z y m ea d d i t i o n2 0 m l ，b a s e do nt h ea b o v e c o n d i t i o n 。t h e c o n c e n t r a t i o no f a c i d6 m o l la n d7 0 w e r ea d o p t e d i no r d e rt oe s t a b l i s hm i l d e rc o n d i t i o n so f p r e p a r a t i o no fg l u c o s a m i n e a tt h es a m et i m e ，t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dq u a n t i f yd e t e c t i o nm e t h o do fc h o n d r o i t i ns u l f a t ea n d g l u c o s a m i n e t h er e a c t i o nc o n d i t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t ew a s ：8 m o i lh c l ，h y d r o l y s i s6 0 m i ni n b o i l i n gw a t e r , c o l o r1 5 r a i n m e n s u r ew a st a k e na tt h ew a v e l e n g t ho f5 5 4 n ma f t e rc o l o r i n g ，t h er e s u l t s h o w e dg o o dl i n e a rc o r r e l a t i o n sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t ev a r i e df r o m0 2 0t o1 0 0 m g m kw i t hi t sr e g r e s se q u a t i o na = 0 6 3 1 c + 0 0 4 ，t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sr 2 = o ，9 9 9 4 t h e d e r i v a t i o nc o n d i t i o no fg l u c o s a m i n ew a s ：6 0 i 1 1w a t e rb a t h a f t e rt h er e a c t i o n o fg l u c o s a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( g a h ) a n dp y r i d o x a lh y d r o c h l o r i d e3 0 m i n ，a d dz n “，c o n t i n u er e a c t i o na tt h ec o n d i t i o n o f6 0 x 3i nw a t e rb a t h ，3 0 m i n t h e n ，t h ei n t e n s i o no f f l u o r e s c e n c e ( e x 3 8 3 n m ，e m 4 7 5 n m 、w a sd e t e c t e d t h er e s u l ts h o w e dg o o dl i n e a rc o r r e l a t i o n sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fg a hv a r i e df r o m1 5t o6 5 u g m l , w i t hi t sr e g r e s se q u a t i o nc = 0 1 6 5 3 5 4 f 4 1 5 7 5 6 8 6 ，h o m o g e n e i t y9 9 1 0 9 k e yw o r d s ：c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，g l u c o s a m i n e ，p r e p e r a t i o n ，d e t e r m i n a t i o n i l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取锝的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外。论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：址牟鲳 时问： 如。6 年孑月鼬日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：挠l 群缝 时间：玉。6 年f 月翻日 导师签名：1 也放 日寸问：沪彩年二月劲日 1 1 课题研究背景 1 1 1 硫酸软骨素研究背景 第一章绪论 中国是世界富禽肉产品消费第一大国，随着人民生活水平的不断提高，肉食需求量逐年递增。 在中国，畜禽养殖业正以超过世界平均水平的速度发展，保守的估计，中国全年的生猪出栏量已 达到6 亿头。根据中国肉品协会公布的数字，到2 0 0 3 年，我国肉类产量已达6 9 3 2 万吨，肉品品 种达3 0 0 多种，肉类生产占全世界总产量的2 7 ，居世界第一。 2 0 0 4 年全球肉品工业肉品生产估计为2 5 8 亿吨，比2 0 0 3 年增长2 ，全球肉晶生产自1 9 5 0 年以来已经增加了5 倍，自上个世纪7 0 年代以来已经增加了两倍多，目前世界各地畜禽养殖业 正以一种农业工厂化的手段迅速发展【l j 。 动物骨骼占动物胴体重1 0 1 5 2 1 ，资源极为丰富，伴随着肉品的消费，我国每年有大量 的各类禽崮骨头没能得到有效地利用。骨骼中不仅含有丰富的蛋白质、脂肪和矿物质，大量的镁、 钠、铁、钾、钙、磷盐等生物活性物质，而且含有大脑不可缺少的磷脂质、磷蛋白等，还有能加 强度层细胞代谢和防止衰老的骨胶原和酸性粘多糖( 硫酸软骨素) ，促进肝功能的蛋氨酸，必及 各种氨基酸，维生素a 、d 、b 2 、b 1 2 等，因而是一种名副其实的营养宝库例。因此利用畜禽骨进 行各种骨类食品的加上以及从骨中提取有效的生物活性物质进行再利用很有发展前景。对儿童生 长发育、老年人保健、国民体质增强都有良好的作用，同时还可以促进肉类上业人幅度增值，产 生显著的社会经济效益和生态环境效益。 1 9 9 1 - - 2 0 0 4 年，我国猪牛羊禽四种肉类的总产量年均递增速度为1 1 ，产量由2 7 0 3 万吨增 加到6 9 6 0 万吨，增长速度为世界第一。2 0 0 4 年世界肉类总产量为2 5 7 5 0 万吨，中国产量是7 2 6 0 万吨，占世界总产量的2 8 2 。居世界各国之首1 1j 。 但是，我国每年大量的禽畜骨头并未能得到有效利用，特别是猪、牛、羊等主要产区的生鲜 肉品加丁企业对畜骨的利用技术水平并不高，多数墨守静哥的传统加工利用方法，如被用于加工 骨油、骨粉、骨胶、骨质t 艺品等低端产品，技术附加值低，经济效益差。 运用生物化学的方法从动物骨头中提取有效生物活性物质进行再利用，不仅可以拓宽传统畜 禽骨的利用方法，而且可以促进肉类_ _ l 业人幅度增值和人民膳食营养健康，产生显著的生态环境 效益和社会经济效益，在我国市场潜力巨大。 硫酸软骨索( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，c s ) 是一类大分子天然氨基多糖化合物，主要存在于动物的 气管、鼻中隔等软骨组织中，具有多种药理作用和生物功能，广泛应用于药品和保健食品领域。 动物实验及人体实验研究证明 4 - 8 ：硫酸软骨素除具有抗凝血、抗血栓、调节血脂、调节免疫功能、 抗感染、抗肿瘤等功效外，还可与氨基葡萄糖复合使用作为老年人的膳食补充剂，疗效显著，可 有效缓解芙节疼痛。因此，这类天然物质不但可以作为生化药物应用于临床，还可以作为膳食补 充剂用来改善人体相关机能，动物软骨中天然氨基多糖硫酸软骨素的提取及其应用已成为目前功 能食品的研究新热点。 1 1 2 氨基葡萄糖研究背景 甲壳素是许多低等动物，特别是节肢动物、虾蟹与昆虫等外壳的主要成分，同时也存在于低 等植物如菌、藻类的细胞壁中，自然界中甲壳素贮量极大，年贮量仅次于纤维索。甲壳素及其衍 生物具有许多独特的生理活性和功能性质，已被广泛应用于与人类生产、生活息息相关的众多领 域。但由于甲壳素及壳聚糖分子量很大，不能直接溶于水，实际应用范围受到限制。若被降解成 具有生物活性的低分子量壳聚糖和氨基葡萄糖应用于医疗保健方面和药物研究方面则可显著提 高产品质量和经济附加值。 我国拥有漫鹾= 的海岸线，甲壳素原料丰富，充分利用这一宝贵的自然资源，变废为宝，加快 甲壳素及其衍生物研究开发利用，将为我国国民经济的发展发挥重要作用。国内从二十世纪五十 年代就已经对甲壳素的制各和应用进行了一定的研究，特别是近年来更是研究成果显著，但研究 方向较为单一，侧重于甲壳素及其衍生产物的性能和制备t 艺研究，与国外一些经济发达国家， 如美国、曰本等相比，在新产品的开发利用方面，存在较大差距。 氨基葡萄糖( g l u c o s a m i n e ，g a ) 一种天然葡萄糖胺，多以脱乙酰甲壳索为原料在浓盐酸作 用下完全降解为氨基葡萄糖盐酸盐( g l u c o s a m i n eh y d r o c h l o r i d e ，g a h ) 继而中和制得。 g a 是甲壳素最基本最重要的衍生物之一，是合成关节内蛋白多糖的必需物质，可以刺激软 骨细胞产生正常多聚体结构的蛋向多糖，具有多种生理活性功能【9 。1 。在医药上多用于治疗风湿 性关节炎症和胃溃疡疾病；若与抗生素配伍使用，则可促进抗生素在血液中的吸收，降低抗生素 副反应作用；同时也可以抑制癌细胞的生k 。在食品工业中，g a 既可以单独或与硫酸软骨素复 配作为膳食补充剂使用，还可以添加在婴儿配方乳中的作为一种重要微量糖类成分，又是合成 v 6 和核黄素中间体的起始原料，而且还可应用于化妆品和饲料添加剂等。 近年来国外已将g a 的盐类成功引入到骨关节炎的治疗和预防领域，研究g a 的制各利应用 也成为当代甲壳素：i ：业的研究热点之一。 1 1 3 硫酸软骨素和氨基葡萄糖协同复配研究背景 骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s ，o a ) 是一种常见的风湿病，是指关节的症状和体征与关节软骨的完 整性受损，软骨下骨板及关节边缘骨病变有关的一组异质性疾病，即关节软骨的退变和继发性骨 质增生的一种慢性关节病，是关节软骨蛋白多糖生物合成异常而呈现退行性变的结果【1 5 】。其病理 基础为各种原因所引起的关节软骨蛋白合成异常而导致关节退行性变化，目前医疗手段无法治 愈，治疗仅可起到减轻疼痛、缓解症状及保护关节功能等作用。 o a 发病人群以老年人、女性居多，在美国7 5 岁以上的老年人中大约8 5 都受到不同程度关 节炎的困扰，而我国骨关节炎的发生率在农村为9 6 ，在城市退休人群中为4 9 ，6 0 岁以上者 达7 8 ，5 t 1 “。 g a 及c s 是天然的含氨基糖类化合物，易溶于水，9 0 9 8 的成分易被肠黏膜吸收，较小 的分子形状可通过血液一滑膜屏障，覆盖并分散至关节软骨内，能够被软骨细胞吸收。单独或联合 应用这两种药物治疗均在临床及实验中取得较好治疗效果，且毒副作用小”7 - 2 2 。因而，软骨保护 剂的开发和利用正是目前骨性关节炎药物治疗的一个新的发展方向。 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 文献综述 1 2 1 硫酸软骨素研究概况 1 2 1 1 硫酸软骨素的分布状况、化学结构及性质 c s 属酸性粘多糖，酸性粘多糖的概念，最早是由m e y e r 于1 9 3 8 年提出，他把来源于动物组 织的含有氨基己糖( 己糖胺) 的多糖称为粘多糖( m u c o p o l y s a c c h a r i d e ) 。近来，所谓粘多糖多指 含有糖醛酸和氨基糖残基的多聚糖，因为含有糖醛酸及硫酸基团而具有酸性，故称为酸性粘多糖 ( a c i d i cm u c o p o l y s c c h a r i d e ) 。由于酸性粘多糖广泛分布于结缔组织中，且分子中含有氢基，故 有人也将酸性粘多糖称为结缔组织多糖( c o n n e c t i v et i s s u ep o l y s a c c h a r i d e ) 或氨基多糖 ( g l y c o s a m i n o g l y c a n ) 。 在自然界中，c s 与特定的核心蛋白共价结合，形成蛋白多糖( p r o t e o g l y c a n ) 复合物后，和 胶原蛋白、粘蛋白等结合在一起，主要存在于动物的气管、鼻中膈等软骨组织中，含量最高可达 软骨干燥物4 0 左右口”。 c s 是以葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖通过b 1 ，3 糖苷键相结合的双糖为基本单位，聚合而 成的一类火分子杂多糖，在它的长链分子上分布着组成、数量上不同的酸性阴离子基团，多为硫 酸基团。按其化学组成和结构的差异，又可分a 、c 、d 、e 、f 、h 等多种，其中以c s - a 、c s c 结构含量居多，结构式如图1 - 1 ，1 - 2 所示： 图卜1 硫酸软骨票a 图1 - 2 硫酸软骨素c f i g - 1 1c s - a f i g 1 2c s - c c s 一般约含有5 0 7 0 个双糖基本结构，天然状态的硫酸软骨素分子量为2 6 0 0 0 0 ，由于制备 方法不同，一般分子最约为5 0 0 0 - 5 0 0 0 0 【2 ”。c s 为白色粉末，无臭，无味，吸水性强，易溶于水 而成粘度大的溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中。 游离c s 的水溶液，遇较高温度不稳定，主要是乙酰基被水解而脱落，其盐类对热较稳定， 受热8 0 。c 亦不分解。c s 在较低温度及中、碱性条件f 有较高的稳定性，温度超过6 0 则降解， 产生。组低分子量碎片及一些脱硫酸产物，酸性条件f 导致糖昔键断裂，水解成单糖或分子鼍较 小的多糖。 1 2 1 2 硫酸软骨素的功能及其应用 c s ，聚阴离子高分子化台物，具有多种药理作用和生物功能，能够与机体内一些生物高分子 结合。这种结合既可以发生在细胞间质，也可以发生在细胞表面及细胞内，因此在调节体内阳离 子浓度，防御细菌或病毒感染，抗凝血，脂质净化及调节骨胶质纤维的生成和增强血管壁弹性方 面发挥重要作用删，广泛应用于药品和保健食品领域。 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 目前硫酸软骨素的临床应用和再开发主要有以下六个方面： ( 1 ) 治疗疼痛、听觉障碍、肝肾疾病陋捌 国内镇江、常州等生化药厂把c s 与中草药( 芍药、附子、甘草) 等制成复方制剂用于治疗 关节炎、神经痛、老年肩痫等，临床应用1 0 0 0 余例，取得了较为满意的疗效。c s 对预防和治疗 链霉素引起的听觉障碍患者以及各种职业性的造成的听觉困难、耳鸣症效果显著，比v a ，v t 的 治疗效果更佳。另，c s 用于治疗慢性肾炎及肾硬化也有良好的疗效，对于急慢性肝炎、肝硬化、 血清肝炎、梅毒性肝炎可使自觉症状和肝功能好转。 ( 2 ) 防治心血管疾病1 2 7 - 2 8 】 c s 是人或动物血管壁结缔组织的重要成分，能与脂蛋白分子相互作用发生空间排斥和离子 结合，在动脉粥样硬化的发生和发展过程中的作用，受到了一些学者的重视。目前，关于c s 与 动脉粥样硬化关系的研究很多，不少结果也很矛盾，增加或减少酸性粘多糖的含量可以导致动脉 粥样硬化的结论都有报道。 目前，美国、日本、欧洲、南美、波兰和比利时等国都在广泛地将c s 试用于防治冠状动脉 硬化性心脏病，l 临床实验结果十分显著。有报告指出c s - a 对主动脉和冠状动脉粥样硬化有抑制 作用，认为其是预防和治疗冠心病的有效药物。 ( 3 ) 治疗眼疾、消肿接骨 2 9 - 3 0 1 c s 对某些眼科疾病如角膜炎、老视均有治疗效果。如：把硫酸软骨素与其它一些药物( 生 理盐水、羟基水杨酸已基汞钠等) 制成复方眼药水可治疗角膜炎、角膜溃损伤等眼病。国内山东 正大福瑞达有生产类似药剂( 如，润尔乐角膜宁滴眼液) 。另有相应的c s 药剂用于治疗促进外 伤、手术后伤口的愈合，如，复方脑氨肽片、麝香虎骨膏、消肿接骨冲剂等。 ( 4 ) 抗凝血作用 3 1 - 3 2 1 酸性粘多糖的抗凝缸作用，肝素发现和应用最早，以后相继从动物器官提取的酸性粘多糖大 多也具有抗凝血作用，c s 也在此列。 ( 5 ) 保胶性和保水性的特性应用【3 3 1 c s 具有保水性、保胶性和高粘性，可与某些物质调制成添加剂和化妆品。如我国出口到德 国汉姆公司的c s 主要用于护肤化妆品，而出口到日本、韩国的硫酸软骨素都被用作食品添加剂。 ( 6 ) 硫酸软骨素衍生物开发 3 4 1 c s 与利多每因、马卡冈或苯甲脂作用制成的衍生物可用于开发使用局部麻醉剂，其作用效 果不仅比单一麻醉剂稳定、持久，而且对正常的血液循环没有影响。 1 2 1 3 硫酸软骨素提取工艺研究进展 近十年来我国从动物软骨中提取c s 已取得很大发展，在全国各地建立了c s 工厂，初步形 成相应生产产业，但其优质提取工艺尚无定论。 4 目前，c s 的主要提取工艺有： ( 1 ) 碱提工艺 包括浓碱提取法，稀碱提取法，稀碱稀盐提取法，稀碱浓盐提取法。 碱提法提取c s 早在一百多年前已被应用，该法主要与蛋白多糖的糖苷键对碱的不稳定性有 关。通常碱处理时，是将动物软骨组织在4 。c y 用n a o h 溶液抽提，过夜，提取液用盐酸中和并 透析，以高蛉十或其他吸附剂去除杂蛋白后。以乙醇沉淀c s 成品中不含蛋白质，纯度高但 部分糖昔键可能因碱处理而断裂。 碱提法要引入些化学物质，且反应剧烈，反应操作时间长及后续处理困难，而且大量碱溶 液的使用对我们的生态环境也造成了污染。 ( 2 ) 碱一酶提取工艺 包括稀碱酶解提取法，中性盐稀碱酶解提取法。 奚俊等人嗍以及罗曼等人采用先高温蒸煮，后加稀碱与酶解相结合提取硫酸软骨素，t c a 沉淀蛋白质斤，高岭土吸附，再用氯仿连续反萃取，使产品质量达到优级纯，较其他方法缩短了 原j ：艺流程，提高了纯度，减轻了碱盐提取所带来的环境污染。 该法处理时，先将动物软骨组织高温蒸煮，后加稀碱与酶解相结合进行提取，t c a 沉淀蛋白 质后，高岭十吸附，再用氯仿连续反萃取，较其他方法缩短了原丁艺流程，提高了产品纯度，减 轻了碱一盐提取所带来的环境污染。 ( 3 ) 复合酶酶解提取工艺 华子义等ke ”1 采用双酶生产t 艺和中空纤维超滤等现代技术，使质量稳定和得率提高。与传 统生产法比较。得率可提高i z ，产品无需脱色处理强d 色泽洁白，生产周期缩短1 3 生产 成本降低5 。 高华等f 3 8 】建立一种硫酸软骨素生产的新工艺，以牛鼻软骨为原料，采用增大碱浓度提取、复 合酶水解及浓缩后酒精沉淀的方法探讨了工艺条件。在最佳实验条件r ，得到硫酸软骨素为白色 粉末，其纯度达9 ：5 ，2 ，收率为3 2 、6 。 采用两种以上酶制剂以加强水解，所用酶类应选择作用肽键广泛的酶。文献报道”1 ：用胰蛋 白酶和木瓜蛋向酶可有效地提高c s 的产率，但目前使用过的蛋白酶均不能很好的断裂糖肽键， 因此成品仍可能保留较长的肽段。 1 2 2 氨基葡萄糖研究概况 1 2 ，2 1 氨基葡萄糖的分布状况、化学结构及性质 g a 与硫酸软骨素一样是一种氮基糖，难以用化学法合成，上业制备其主要以盐的形式存在， 通常由甲壳素脱乙酰化为壳聚糖再彻底降解制得。 氨基葡萄糖，又名葡糖胺，为2 氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖。工业制备常以氨基葡萄糖盐酸盐和 硫酸盐为主要制备形态，白色结晶体，味略甜。单糖在固体的结晶状态时，性质稳定，但若在较 高浓度酸液和受热情况下，会引起复杂的复台和分解反应，转化为低聚糖或非糖物质，溶液产生 5 褐色或黑色，颜色越深则副反应越重。 从甲壳素制备氨基葡萄糖的化学结构变化如下： 蓬。蟮。莲博 甲壳素 c h i t i n 艇f h 2 0 h 悟h n h 2 。谊( ；h 2 q h 图1 q 壳聚糖 f i g 1 - 4c h i t o s a n 彻1 底j 降l 解l ， 图1 51 3 - 氨基葡萄糖 f i g 1 5d - g l u c o s a m l n e 1 2 2 2 氨基葡萄糖的生物学功能及其应用 氨基葡萄糖是一种具有生理活性的天然小分子氨基单糖化台物，易溶丁水，9 0 - 9 8 的成分易 被肠黏膜吸收，可以通过人体的血液滑膜天然屏障，分散覆盖至关节软骨内，对受损的软骨细胞 具有一定的保护作用，并能够被软骨细胞吸收，起到保持关节腔润滑和缓冲压力的作用。氨基葡 萄糖及其衍生物( 包括盐类、金属螫合物等) ，在生物体内具有多种医学功能和医药作j = j ，可用 作抗癌剂、消炎抑菌剂、药物助剂、营养助剂等应用于医药、保健品、化妆品等领域，有着广阔 的应用前景。 6 盛链。 h啦。 1j一 叶j驯引寸 酊 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 量i i 曼曼量曾曼量矗置量舅墨皇曼量薯- 圈曼量墨皇曼置篁矗巴曼曼曼曼量瞳曼鲁蔓置量篁量毫墨墨量蔓墨墨岛墨 ( 1 ) 氨基葡萄糖的生物学功能 第一，修复和据护软骨及关节作用 氮基葡萄糖是形成所有结缔组织包括软骨基质葡聚糖胺的基本成分，是关节软骨生物合成和 刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，外源性的氨基葡萄糖可以刺激软骨细胞合成 正常多聚体结构的蛋白多糖，同时可抑制损伤软骨的酶如基质金属蛋白酶、胶原酶和磷脂a 2 的 酶活，还可以防止损伤细胞的超氧化物自由基产生i “】。 研究表明【4 “l ：随着年龄的增长，人体台成氨基葡聚糖的能力越来越差。最终会引发骨关节 炎、类风湿性关节炎等关节疾病，继而会影响膝、手、脊柱和髋关节的功能，而适当补充氨基葡 萄糖则能相应缓解骨关节炎等引起的关节肿胀、关节僵硬等症状，并大人改善骨关节炎患者的生 活质量。 因此，氨基葡萄糖可以通过阻断骨性关节炎的病理过程，补充软骨基质的丢失成分，促进软 骨修复，缓解关节疼痛，防【r 疾病的进一步进展。 第二，抗癌、抑菌等作用 氨基葡萄糖既有弪基又有氨基它对一些金属离子具有良好的蝥台能力，形成的金属配合物 性质稳定，具有抗癌、抗氧化；抗炎、抗菌等多种生物活性。 抗癌作用 在新陈代谢中，细胞在有氧呼吸时所消耗的0 2 ，约有1 0 可被还原成h 2 0 z ，其很容易发生 均裂分解，生成羟基自由基( h o ) 。h o 是一种破坏力极强的自由基，几乎可氧化与之接触的 所有细胞组分，使其d n a 键断裂、蛋白质解聚变性等，从而引发衰老、癌变及其他疾病。g a h 与c u 2 + 形成的配台物可以作为一种人t 模拟酶，成为烯类单体的聚合引发剂，能够有效催化 0 2 分解为h 2 0 和0 z ，在防止因h 2 0 2 积累而造成d n a 损伤及癌变等方面起着重要的作用。 抗苗防腐作用 氨基葡萄糖的s c h i f f 碱金属配合物，可阻断细菌、霉菌细胞膜成分的合成，从而起到杀菌抑 霉防腐的效果。s c h i f f 碱类化合物的抑菌效果与金属离子的配位作用有关，金属离子的抗菌活性 一般较强而配体较弱，结合的配合物能减弱金属离子的毒性，而提高配体的抗菌活性f * * - 4 s l 。如， 水杨醛氨基葡萄糖s c h i f f 碱( s g ) 与z n 2 + 配位后其抗菌活性增强；或者是抗菌活性低于原来的配 体和金属离子，如，s g 与c u 2 + 配位后其抗菌活性减弱。 ( 2 ) 氨基葡萄糖的应用 第一，医药领域 氨基葡萄糖可与抗生素配伍使用，促进抗生素在血液中的吸收，降低药物副作用也可作为 糖尿病患者的药物助剂，促进胰岛素药物抗体的产生；同时它也可以抑制人体癌细胞的生长而对 正常细胞仅有轻微影响，可作为抗癌药物使片j ：此外还有抗炎性，可用于治疗风湿性关节炎症和 胃溃疡疾病。 第二，食品领域 氨基葡萄糖为天然提取产物，可作为功能性食品添加剂用于保健食品的研制与开发，不仅可 以缓解骨关节炎患者症状，还可与人体所需的重要金属元素如锌、铁、镁、钙、锰等络合，促进 人体生理代谢，维持身体健康 4 7 - s 0 1 。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 第三，其他领域 如作为絮凝剂和发酵剂麻_ j 于化学工业领域 5 1 - 5 3 】。 1 2 2 3 氨基葡萄糖提取工艺研究进展 目前制备氨基葡萄糖的方法多为浓酸高温催化降解壳聚糖或甲壳素，反应温度不低于1 0 0 ， 反应用盐酸浓度不低于3 5 ，反应时问3 5 h 不等，反应完毕后经中和、脱盐、脱色等步骤得到 产品 5 4 - 5 9 i 。由于制各中使用浓酸和较高温度，生产过程不易控制，产品易炭化，收率不稳定，产 率从1 0 4 0 不等。 1 2 3 硫酸软骨素和氨基葡萄糖协同复配研究概况 近年来氨基葡萄糖作为一种治疗骨性关节炎的药物，因其疗效确切，不良反应少，价格低廉 已受到广泛关注。硫酸软骨素和氨基葡萄糖一样，也具有调节骨胶质纤维的生成，抗炎消痛等生 理活性，在抑制炎性介质的趋向性、吞噬细胞以及溶菌酶的活性等方面发挥作用，可以影响软骨 代谢。在关节炎的研究中发现，氨基葡萄糖和硫酸软骨素在体外及体内实验中均具有保护关节软 骨的特性，临床应用中也能够减轻骨性关节炎的症状，给骨性关节炎的药物治疗提供了不同的方 法，而且硫酸软骨素有明显的亲软骨性h ，可优先进入软骨组织，保护软骨。软骨保护类药物虽 然在治疗效果上稍低，但起效温和，k 期服用后副反应较小。 氨基葡聚糖及硫酸软骨素的软骨保护作用可能体现在能够提高滑膜产生透明质酸的能力、关 节腔内正常透明质酸水平，可以降低软骨面的退变，减轻骨性关节炎的症状。这类软骨保护剂运 用于体外培养的软骨细胞时，蛋白多糖的合成与聚集均升高，胶原酶的活性降低，氨基葡聚糖和 硫酸软骨素是蛋白多糖合成的基本物质，同时硫酸基团是保持软骨细胞外基质稳定的重要网络结 构。在动物模型中，氨基葡聚糖还具有抗炎潜能，尽管对炎症反应中的环氧化酶或蛋白水解酶的 活性影响不大，但由于增加了蛋白多糖的合成，发挥了稳定细胞膜的作用，并可填充细胞外基质， 间接起到抗炎的作用，合成的硫酸氨基葡聚糖还可控制症状发展，有利于软骨的修复。 在美国氨基葡聚糖和硫酸软骨素的合成制剂己添加至食品中，具有非常高的安全信度，口服 该类药物即可达至治疗目的，对于一些伴有循环系统疾病、肝肾功能差、肺部疾病、糖尿病的患 者，同样具有安全性。 1 3 研究目的和意义 硫酸软骨素和氨基葡萄糖作为大然有机化合物，正日益取代合成化学药物在治疗骨关节性疾 病中的地位，而且两者所具有的独特的生物活性及其功能，使其应用范围逐步扩大，经济效益和 社会效益迅速提高。加之原料资源丰富，价廉易得，适于火规模制备。 目前，我国生产的硫酸软骨素产品和氨基葡萄糖产品的主要是出口至发达国家，作为发达国 家生产相应精制品所需的粗品原料，产品技术含量低，经济附加值不高。受国际市场行情的变化 而波动，极大限制和制约了我国农产品加工工业的发展。因此，研究提取率高，易于工业化生产 的制备方法已成为硫酸软骨素和氨基葡萄糖应用的一个技术瓶颈。 找出一种简单合理，成本低廉的提取硫酸软骨素和氨基葡萄糖的方法，使之尽快应用于生产， 8 中国农业大学颈士学位论文 第一章绪论 为农产品生产企业对副产品进行综合利用提供一条出路，同时提高农产品附加值，这对发展我国 经济具有实际意义。 天然提取物的应用日益广泛，尤其在用丁医药和功能食品中时，保证其质量和安全就显得尤 为重要。但由于对天然提取物中功效成分的检测手段不完善，因此市场上出现了功效成分与标志 标签不符、标注的成份含量与实际测定值不符等问题。市场所售硫酸软骨素和氨基葡萄糖相应制 剂也存在上述问题，为了整顿与规范市场经济秩序，准确、快速地测定功效成分含量，对于加强 食鼎质量安全监督具有重要的意义。而且，硫酸软骨素和氨基葡萄糖同属氨基糖类，测定时两者 不仅相互干扰，还易受其他糖类的影响，因此建立专属性强，简捷快速有效的分析方法是很必要 的。 1 4 研究内容 由上述论述可知，硫酸软骨素和氨基葡萄糖已被广泛应用丁医疗和保健食品领域，因此研究 其简便有效的生产工艺和分析测定方法显得尤为重要。因此本文研究了以下内容： 1 硫酸软骨素蛋白酶酶解工艺的优化设计研究。 2 温和条件下制备氨基葡萄糖的工艺研究 3 硫酸软骨素定量检测分析方法 4 氨基葡萄糖定性定量检测分析方法 9 第二章试验分析方法 2 1 硫酸软骨素定量分析方法 硫酸软骨素的含量测定方法有很多，主要有：光度法，色谱法、电泳法、原子吸收法等 5 9 - 6 4 l 。 但由于硫酸软骨素分子量分布范围较宽，难以选择适当的标准晶及色谱分析柱等原因，导致色谱 法测定结果不够稳定，难以准确反应硫酸软骨素待测样的真实情况。而国内现行标准采用的可见 分光光度法，硫酸软骨素样品需先在沸水浴中酸化水解，之后用碱液中和，过滤，滤液分两步显 色，5 2 5 n m 处测定显色产物的吸光度【6 5 l 。该法操作较为复杂费时，且测定结果偏低。 本章建立的硫酸软骨素含量测定方法，依据硫酸软骨素的化学结构特点：硫酸软骨素在酸性 条件下可发生分子内糖苷键断裂，分解成葡萄糖醛酸和氨基半乳糖。前者可发生分子内脱水生成 糠醛或其衍生物，并与间苯三酚试剂缩合生成有色物质，溶液颜色随水解、显色条件不同而不同。 溶液在5 5 4 n m 处有最大光吸收，a 5 h 与多糖含量的关系在一定范围内符合l a m b e r t b e e r 定律。在 已有研究【6 “的基础上进行了硫酸软骨素间苯三酚显色操作条件的优化，并与苯酚硫酸比色法测 定的硫酸软骨素含最进行了对比。试验表明：本章建立的间苯三酚比色法方法操作简便，结果准 确，重复性好，经回收试验证明，方法可行。 2 1 1 材料和仪器 2 1 1 1 材料 硫酸软骨素钠盐对照品，含量 9 9 ， 润尔乐角膜宁滴眼液( 含硫酸软骨素) 2 1 1 2 试剂 s i g m a ，批号1 2 4 k 1 2 1 6 山东正大福瑞达，批号2 0 0 5 0 3 0 7 浓硫酸，优级纯，北京化工厂；浓盐酸、冰醋酸、无水乙醇均为分析纯，北京化工厂；苯酚 分析纯，北京市旭东化丁厂：问苯二酚，化学纯，北京市两中化t 厂 2 1 1 3 仪器 t u 一1 9 0 1 双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用有限责任公司 7 5 2 一紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 电热干燥箱 上海沪南科学仪器厂 电热恒温水浴锅 北京市长风仪器有限公司 漩涡混合器 江苏海门市其林贝尔仪器制造公司 2 1 2 问苯三酚比色法 2 1 2 1 试验方法 1 0 ( 1 ) 试剂的配制 显色剂问苯三酚乙醇溶液的配制：问苯三酚5 0 乙醇= 5 0 m g m l ，配制于棕色瓶中，可在冰 箱内贮存一周。 硫酸软骨素标准溶液的配制：准确称取1 0 5 。c 干燥至恒重的硫酸软骨素钠盐标准样品0 2 5 9 ， 于2 5 m l 容量瓶中，振荡溶解，加水稀释至刻度，即得。吸取上述硫酸软骨素标准溶液，分别配 制浓度为o 2 0 、0 4 0 、o 6 0 、0 8 0 、1 0 0 m 咖l 系列标准溶液。 ( 2 ) 样品水解及显色 准确吸取硫酸软骨素标准溶液1 o m l ，置于5 m l 棕色容量瓶中，加入2 o m l ，8 m o l m l 盐酸 和1 0 m l 冰醋酸，沸水浴反应6 0 r a i n ，冰水浴立即冷却5 m i n 。 在上述水解液中加入显色剂间苯三酚乙醇溶液1 o m l ，盖塞，混匀，沸水浴中加热1 5 m i n 后 取出，冰水浴中冷却5 m i n 。用冰醋酸稀释至容量瓶刻度。以去离子水为参比，在5 5 4 n m 波长下 扫描，记录吸光度a 。 ( 3 ) 标准曲线的建立 准确吸取硫酸软骨索系列标准溶液1 o r a l ，经水解、显色后在波长5 5 4 n m 处测定吸光度a 。 以a 为纵坐标，浓度c ( m g m l ) 为横坐标建立标准曲线。结果表明，硫酸软骨素浓度在0 2 0 1 0 0 m m l 范围内线性关系良好其回归方程为：a = 0 6 3 1 c + 0 0 4 ，相关系数r z = 0 9 9 9 4 。 0 8 。0 ，6 掣0 4 昏 o 2 0 0 20 40 60 81 浓度c ( m g m l ) 图2 - 1 硫酸软骨素间苯三酚法测定标准曲线 f i g2 1t h ep h l o r o g l u c i ns t a n d a r dc u r v oo fc h o n d r o i t l ns u l f a t e 2 。1 2 。2 结果分析 ( 1 ) 硫酸软骨素最佳吸收波长的确定 取硫酸软骨素标准溶液，沸水浴水解6 0 m i n ，冰水浴冷却5 m i n 后显色。在4 0 0 8 0 0 n m 波长范 围内扫描，吸收光谱如图2 2 所示，可见显色产物在5 5 4 n m 处有最大吸收，故选择5 5 4 n m 作为测定 波长。 1 1 图2 - 2 硫酸软骨素反应吸收光谱圈 f i g 2 2t h eu v - s p e c t r u mo fc h o n d r o i t i ns u l f a t er e a c t i o n ( 2 ) 盐酸浓度对吸收光谱的影响 盐酸浓度的大小不仅关系到硫酸软骨素水解速度的快慢，同时也与显色反应的结果有关。试 验中随着盐酸浓度的增加，显色颜色由粉变成槠红再到紫红色最终可变为棕褐色。 选取盐酸浓度5 m o l l ，8 m o l l ，l o m o u l ，1 2 m o l l ，分别按2 ，1 2 1 试验方法中样品水解及显 色操作，吸收光谱如图2 3 所示。 图2 - 3 盐酸浓度对吸收光谱的影响 f i g 2 _ 3t h ee f f e c to fh c ic o n c e n t r a t i o no nt h eu v - - s p e c t r u m 1 5 m o 儿粉色；2 _ 8 n a o