（预防兽医学专业论文）鸡白细胞介素18成熟蛋白基因克隆与表达的研究.pdf

关于学位论文嚣创性鞫使用授权的声明 本人鹰墨交的学位论文，怒在譬师报导下，独立进行科学研巍所 取褥的成粱。对在论文研究斓闷给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人躐集体，均在文中明确说瞬。本声明酶法律贲经由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使堵学穰论文的烧定，同 意学校保留耱按要求囱图家有关部门或棍构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被餐阅氍储阕。本人授裰由东农浊大学可蔽将本学位谂 文静全部或都分海容编入有关数据麾进行梭索，丽潋采用影霹、翁露 或英链复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后废遵守此燕定。 论文棒蠹签名；盔跫羝。銮! 导艨签名： 蠢 期：耋垒壁垒笙蠢基量耋蠢 山东农业大学博士学位论文 英文缩写英文全称 a a a m p a p b p c h c e f d n a c d n a c t l d e p c d n t p e b e c o l i e d t a g h i c e i f a i f n y i g i f i l m t g k b k d a l b m g m l n m l m m o l 几 m o l l m r n a n c n g o d o r f p b s p c r p h a r n a 缩略词表 a i t n n oa c i d a m p i c i l l i n a l k a l i n ep h o s p h a t a s e b a s ep a i r c h i c k e n c h i c k e ne m b r y of i b r o b l a s t s d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd n a c y t o t o x j ctl y m p o c y t e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i b a c t e r e r e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d g r a m h o u r t l 一11 3 一c o n v e r t i n ge n z y m e i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y i n t e r f e r o n g a m m a i n t e r f e r o ng a m m a i n d u c i n g f a c t o r i n t e r l e u k i n i s o p r o p y lb - d t h i o g a l a c t o s i d e k i l o b a s ep a i r 虹l o d a l t o n s l a u r i ab r o t h m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m i l l i m o l e l i t e r m o l e l i t e r m e s s e n g e r r i b o n u c l e i ca c i d n i t r o c e l l u l o s e n a n o g a a r n o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h y t o h e m a g g l u t i n i n r i b o s o m en u c l e o t i d e 中文全称 氨基酸 氨苄青霉素 碱性磷酸酶 碱基对 鸡 鸡胚成纤维细胞 脱氧核糖核酸 互补d n a 细胞毒性t 细胞 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷三磷酸 溴化乙锭 大肠埃希氏杆菌 乙二胺四乙酸 克 小时 i l 1b 转化酶 间接免疫荧光试验 y 干扰素 y 干扰素诱导因子 白细胞介素 异丙基硫代b d 半乳糖苷 千碱基对 千道尔顿 l b 肉汤 毫克 分钟 毫升 毫摩尔升 摩尔升 信使核糖核酸 硝酸纤维素 纳克 光密度 开放阅读框架 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 植物血凝素 核糖核酸 鸡白细胞介萘18 成熟蛋白撼园克隆与表达的研究 r k a s e r t ，p c r r p m s d s s d s p a g e s t a e t h 礴s 疆 肛g u l u m x g a l r i b o n u c l e a s e r e v e r s et r a n s c r i d t a s e p c r r e v o l u t i o n sp e rm i n w e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s - p o l y a c r y l m n i d eg e le t e e t r o p h o r e s i s s e c o n d t r i s a c e t a t ee d t a h e l p e rt c e l l t r i s h y d r o x y l m e t h y l 】a m i n om e t h a n e u n i t m i c r o g r a m m i c r o l i t e r m i c r o n 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o 埂一1 3 - d g a l a c t o s i d e 2 孩糖孩酸酶 反转录聚合酶链式反应 镣分钟转数 十二烷基硫酸钠 s d s 一聚嚣烯酝胺凝胶电泳 移 t r i s - 乙酸电泳缓冲液 辅助性t 细胞 三羟甲基氨基甲烷 举霞 微克 微升 微米 5 一溴- 4 一氯一3 一霹| 豫w d 。拳乳糖萤 山东农业大学博士学位论文 摘要 自细腿介素1 8 ( i n t e r l e u k i n - 1 8 皿1 鼬是一萃孛新发现瀚黧要的细胞兔疫谪节困予，主 要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。起初由于它能诱导n k 细胞和t h l 细胞产生干扰 索j 嚣坡命名为干扰素诱生困予( i n t e r f e r o n y - i n d u c i n gf a c t o r , i g i f ) ，骧赞对i g i f 的潆入 研究，人们发现它有其自身的结构特点和多种萁它生物学活性，西诧予1 9 9 6 年被藏式 命稻为白细胞介豢1 8 。近年来有关人和备种动物i l 1 8 的基因克隆、表达及生物举活 搜莓礤究十分活跃。丑兹在分子水平上已经诞骥，人、噙孥l 动物秘菜些鸟类中都饔珏， 1 8 稃在。i l - 1 8 程结构上属予i l - 1 家族，裰功能上它与l l 。1 2 稆似，艇二者有协同效 应。i l - 1 8 具有多种生物学功能，它不仅可以增强t h l 型免疫反应，而且在t h 2 型免疫 及戏孛遣发挥一定熟 蕈焉。入类医学硬究 菠弱i l - 1 8 奁拶镞生物感烫、獍魏瘪免疫中其 裔威用潜力。鸡i l - 1 8 ( c h i c k e ni n t e r l e u k i n - 1 8 ，c 瑚t l - 1 8 ) 鏊黼是最近才被发现的，由予它 具脊与人和哺乳幼物相似的嫩物学功能，阏而鸡i l - 1 8 谯比较免疫学研究和禽病防制中 具蠢重要意义。猩集约让家禽券殖韭中，谯惩c h i l ，1 8 褒建豹缨照黢予，霾翦已投酱 遍瓣作是一种蒜肖广阔应嗣前景的新型兔液往剂和免疫治疗铷。 本研究根据已发表的c m l - 1 8 成熟蛋囱( m a t u r e c h i l 1 8 ，m c h l l 1 8 ) 的c d n a 纂因序 捌，设 亍一对特雾蛙弓l 麴，旋雳反转录聚仑酶链式反皮( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，r t w p c r ) 技术从膳多糖( l p s ) 索j 激l o 小时活他的马立克氏瘸成 淋融细胞样细胞系m d c c m s b l 的e d n a 中扩增出编码鸡i l 1 8 成熟活性蛋白的念长 蒸骥，对扩增片段逛毒亍t - a 克疆，经p c r 、黪甥鉴定及撼序验涯，戏功获褥c h l l ，1 8 成 熟鬣自完整基嗣的克隆。序列分析表骧，所克隆到的c h l l - t 8 成熟蛋白编码基因龟捂 终止密码子在内企长为5 1 0b p ，含有一个开放阅读框架( o p e n r e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，这与 s c h n e i d e r 等( 2 0 0 0 ) 擐遵豹臻暴竞全一致。 鸡与人和冀他11 种动物的i l - 1 8 成熟鬣白基因序列分析表明，i l 1 8 成熟蛋白基因 存猩种的多样性，亲缘关系趟j 压，同源性越高。 在壳隆到缡妈c h i l - t 8 成熟蛋白戆蓦缀嚣，菸藏萎瓣驻竞篷至嚣核表达载钵 p g e x - 6 p - l 中，构建重组质粒并进行确证憔序列测定。然后将重组质粒转化到大肠秆 菌b l 2 1 ( d e 3 ) 株中并用i p t g 予3 7 c 诱导培养获得表达，表达形式为包涵体。经过优 纯逡撵臻定了熏缌c h i l - t 8 ( r e c o m b i n a u t c h l l - 1 8 , r c h i l - 1 8 ) 蛋鸯裹效表达戆最遥参数， 鸡自细脆介嚣1 8 成熟蛋白赫圆克隆与表达的研究 即当i p t g 浓度为0 , 2 m m o t l ，诱导时间为4 h 时，表达水平最高，凝胶薄层灰度扫描 显示表达的融合蛋囱约占菌体鬣自的3 2 。诱导菌体裂解物经s d s - 聚两烯酰胺凝胶电 滚( s d s + p a g e ) 嚣，潮兔撬g s t 挽俸送行w e s t e r n b l o t t i n g 试验，缍巢确溪7 g s t - m c h l l l 8 融合蛋自的表达，表达的鸡i l - 1 8 融合蛋白分子鬣约为4 4 k d a ，并对其进行了 亲和纯化。 将表这产秘款凝胶孛霾浚，受疫4 躅翡小爨疑，三次受疫惹，采瘗分舞盘涛。惩 所得抗血清对s d s p a g e 后的诱导菌体裂解物进行w e s t e r n b l o t 检测，缩果表明制备 的多党隆抗体与c l l i l - 1 8 具有良好的反应性。 褥c h l l - i g 或熬虽每基因鹃宠整o r f 迸一旁囊隆入囊孩表运载俸p c d n a 3 ，i f v 5 h i s t o p o 中，重嘏质粒p c d n a 3 1 t o p o m c h i l l 8 在脂质体作用下转染鹏胚成纤维细 胞( c h i c k e n e m b r y o n i cf i b r o b l a s t ，c e f ) ，在转染瞒2 4 、4 8 、7 2 小时，用p g e x - m c h i l l 8 藩棱淡这产甥魏蚕熬爨鑫凑鼹p e d n a 3 。1 t o p o - m c h i l l 8 转聚戆c e f 逶行阗接免疫荧 光试黢检测，结果檎测到了m c h i l 1 8 在c e f 中的表达，该试验也使m c h i l 1 8 基因在 原核和舆核系统中的表达得到了相互验证。 爨骞潋上实验缝祭秀下一除羧c h l l - 1 8 垒豹学特性及葵疲遴戆磷究豁下了鎏实蓥 础。 关键蛹；o h l l - 1 8 ；宪蹩；m o h l 卜1 8 原核表达；多克隆抗体：m c h l l _ 1 8 冀梭表达 出客农鼗走学麟圭学垃论文 a b s t r a c t t n t e r t e u k i n - 1 8 ( i l l 彩，an o v e ld i s c o v e r e dc y t o k i n e ，w a sf i r s td e s c r i b e da s 趋ni n t e r f e r o n g a m m a - i n d u c i n gf a c t o r ( i g i f ) p r i m a r i l yb yi t sa b i l i 母t oi n d u c oi f n yp r o d u c t i o ni nt c e l l s a n dn a t u r a lk i l l e r ( n k ) c e l l s ，h o w e v e r ，w i t hm o r ea n dm o r er e s e a r c ho fi g i f ，i tw a sf o u n d t h a ti g i fh a si t sc o n s t i t u t i o na n dm a n yb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s oi n1 9 9 6i tw a sn a m e da s i n t e r t e u k i n - 1 8 t l - 1 8i sm a i n l ys e c r e t e df r o mc e l l so f m o n o c y t e m a c r o p h a g e s y s t e m p r e v i o u s s t u d i e sw e r er e l a t e dt ot h ed e t e c t i o no fh u m a na n dv a r i o u so t h e r sm a m m a l si l 1 8b yg e n e c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n db i o l o g i c a la c t i v i t y i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a ti l - 1 8e x i s t si nc e l l s o fh u m a n , m a m m a la n ds o m ek i n d so f b i r d s ，a l t h o u g hi l - 1 8i ss t r u c t u r a l l yh o m o l o g o u st o i l - 1 ，i t sf i m c t i o ni sr e l a t e d 韬i l 一疆a n dt h e yh a v es y n e r g i s t i ca c t i o n s i l - 1 8n o to n l yc a l l e n h a n c et h l * m e d i a t e dr e s p o n s e s ，b u ta l s oh a st h e c a p a c i t y t os t i m u l a t et h 2 - m e d i a t e d r e s p o n s e s 。i ts h o w s t h a t t l - i 8 翻a y s a l li m p o r t a n tr o l ei nh o s td e f e n c ea g a i n s tv a r i o u sm i c r o o r g a n i s m si n f e e t i o n a n dt u m o r c y t o k i n e s i n c l u d i n g i l * 18 ，a sn a t u r a lm e d i a t o r so ft h e i m m u n er e s p o n s e ，o f f e r e x c i t i n g a l t e r n a t i v e st oc o n v e n t i o n a l t h e r a p e u t i e s i nc o n t r o l o f d i s e a s e si ni n t e n s i v el i v e s t o c ka n d p o u l t r y i n d u s t r i e s 。n l ed i s c o v e r yo f c h i c k e ni n t e r l e u l d n - 1 8 g e m e i sv e r ym e a n i n g f u lf o rb o t ht h es t u d yo nc o m p a r a t i v ei m m u n o l o g ya n dt h e t h e r a p e u t i c s f o r p o u l t r y d i s e a s e s i nt h i ss t u d y ，o n ep a i ro f s p e c i f i cp r i m e rf o rm a t u r ec h i c k e ni n t e r l e u k i n - 1 8 ( c h i l - 1 8 ) e d n aw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h ep r e v i o u s l yp u b l i s h e dg e n es e q u e n c eo f e 矗l bl8 t h ef u l l l e n g t hc d n ag e n e o fc h i l - i8 e n c o d i n gm a t u r e a c t i v e p r o t e i n w a s a m p l i f i e df r o ml p s - s f i r n u l a t e dm d c c m s b lc e l l sb yr e v e r s et r a n s c f i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) t h e ni tw a sc l o n e di n t op m d l 8 - t v e c t o r 。s e q u e n c i n ga n a l y s i s s h o w e dt h a tt h en u c l e o f i d es e q u e n c eo f t h i sc b l l - 1 8m a t u r e p r o t e i ng e n e w a s5 1 0 b pi n c l u d i n g t h es t o pc o d e na n dt h es o n i ca st h ep u b l i s h e dc 抵- 1 8e d n a s e q u e n c eb y s c h n e i d e rk t oh i g h l ye x p r e s sc h i c k e ni n t e r l e u k i n - 18i ne c o t ia n dp u r i f yt h ef u s i o np r o t e i n ，e d n a f r a g m e n te n c o d i n gt h em a t u r ec m l - 1 8w 舔s u b c l o n e di m ot h ed o w n s t r e a mo fg s tg e n e a c c o r d i n g t ot h er i g h to p e nr e a d i n gf r a m e ( o r 娜i nt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 6 p 1 飘r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o bb l 2 1 0 ) e 3 ) s 缸a i 丸a n dt h e n i n d u c e db yi p t g 越3 7 ，及撼r e c o m b i n a n tc h i l - 18 ( r c h i l 一1 8 1w a se x p r e s s e de f f i c i e n t l yi n f o r m so fi n c l u s i o nb o d yw i t ht h ey i e l da c c o u n t i n gf o r3 2 t o l z lb a c t e r i ap r o t e i n o p t i m i z i n g s e l e c tt h ep a r a m e t e r so f e x p r e s s i o n ，t h el e v e lo f e x p r e s s i o no f r c m l - 1 8i sh i g h e s tw h e ni p t g r e a c h e s0 。2m m o l la n di n d u c e dt i m ei s4h o u r s s d s p a g ea n dw e s t e m - b l o t t i n gv a l i d a t e d 鸡白细胞介煮1 8 成热蛋岛拣因克龌与表达的研究 t h ee x p r e s s i o no f m c h i l 一1 8 ，a n ds h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nh a dam o l e c u l a r w e i g h ta p p r o x i m a t e l y4 4k d a e x p r e s s e dp r o d u c tt a g g e db yg s t w a s p u r i f i e dw i t ha f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ，t h ee x p r e s s e ds p e c i f i cb a n d w a se x c i s e df r o mt h eg e ta n d i n j e c t e d i n t om i c e o n c et w ow e e k sf o r3t i m e s ，t h e nw ec o l l e c t e dt h ea n t i s e r u mf r o mt h em i c e e x a m i n et h e e x p r e s s e dp r o t e i nb yw e s t e r n - b l o tw i t ht h ea n t i s e r u ma g a i n s tr c h i l 一1 8s h o w e d t h ei nv i t r o e x p r e s s e dp r o t e i no f m c h i l 一1 8h a si t si m m u n o l o g y a c t i v i t y a tl a s t ，w ec o n s t r u c t e d p c d n a 3 1 t o p o m c h i l l 8e u k a r y o t i ce x p r e s s i n g 譬a s m i d ， w h i c hc o n t a i n sm o b i l 18 g e n e t h ep l a s m i dw a st r a n s f e c t e d i n t oc h i c k e ne m b r y o n i c f i b r o b l a s t ( c e f ) b yl i p o f e e t a m i n er e a g e n t 2 4 、4 8 、7 2h o u r sl a t e r a f t e rt r a n s f e c t i o n w e t e s t i f i e dt h ee x p r e s s i o no fm c h l l - t 8b yi n d i r e c ti m r r m n o f l u o r e s e e n o ea s s a y ( i f a ) w i t ht h e a n t i s e r u m o f m c h i l 一1 8e x p r e s s e d i n e c o l l t h e t e s t s j u s t i f i e d t h ee x p r e s s i o no f m c h i l 一1 8 i n p r o k a r y o t i ca n de u k a r y o t i ce x p r e s s i n gs y s t e m s a sar e s u l t , w el a i das o l i df o u n d a t i o na n d p r e p a r e de x p e r i m e n t a lm a t e r i a lf o rt h ef u t u r e s t u d i e so r lt h eb i o a c t i v i t yo f c h i l - l8 k e yw o r d s ：c h i l - 1 8 ；d o n i n g ；m c h l l - 1 8p r o k a d , o t i ee x p r e s s i o n ；p o l y e l o n m 。a n t i b o a y ； m c h l l - 1 8 e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n 6 些查查些查堂缝! ：兰垡丝塞一 弓l言 一、缀麓因子麓奔 细胞因子( c y t o k i n e ，c k ) 是幽细胞分泌臼勺具有多种擞物活性的蛋白质。1 9 7 4 年， s t a n l e yc o h e n 酋次创立“细胞因子”的概念。此后为免疫学和生物暇学界所广泛承认 和傻蠲。缩魔因子透过鑫分泌( a u t o c r i n e ) 或势分泌( p a 疆c r i 锵) 方式发挥薮生物学佟焉。细 胞因子通过与其靶细胞表面的相应受体的相互作用，将生物信号传8 楚细胞内。撼于 这张作用方式与特点，细胞黩予、生长因子和激素之阅的区别并不爨藩。一般来说， 蜜臆因子和生长戳子是非露稠儆的，只不邀缨驻因子主豢作用于自纲臌，两生长因子 则作用于其它类测的体细胞。然而细胞因予与激素之间的一个明显聪别在于细胞因子 在局部发挥作用，两激素则有多器官豹远稷效应。 霹前利溺基戮工程技术黛产有活往酶缁脆因子用予痰瘸的治疗或预防是当前研究 的热门并已取得了很大的成绩。基因工程冀组的细胞因子正成为生物成答调节荆( b r m 、 中一装重要的治疗制翔。在翻内外，自细胞介素( i l ) - 2 、于扰素( i f n ) 、粒细胞单梭缒 斑- 熊藩辅激鬣子( g m - c s v ) 、辍鲡施一集落辎激因子( g l c s d 和红细稳熏残素( e p o ) 等缁 胞因子的基因工糨产品已经获准生产，用于感染性疾瘸、肿瘤、器常移植、血细胞减 少癜、超敏反应和自身免疫病簿的治疗。 氆得一提的怒，善医诼躐谯细胞困子方西的磷究裰对滞后，雷魏各稀善用襁燕细 胞因子产品大多滋处于研究和开发之中，将细胞因子作为疫苗佐剂的研究也刚刚起 步。 绷胞因子章孛灏繁多，具体龟括千挽素( i n t e r f e r o n ，i f n a 、v ) ，自继胞介素 ( i n t e r l e u k i n ，i l ) ，肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f c 1 、b ) ，集落刺激因子 ( c o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ，c s f ) 等四丈系列几十耱。这些缨魏因子有各囊戆生物学活拣， 它们在介导机体多转免疫反馥秘 箨瘩免疫、感染免疫、移植免疫、蠢囊免疫过程中发 挥糟黛要作用。程细胞因子这一概念提出之前，人们将幽活化淋巴细胞产生的除抗体 之辨豹免疫效应躐予称为港巴瑕子。t 9 7 9 零，在瑞士攀移戆第二雾鬟繇漤巴因子专蘧 讨论会上，将程趣细胞之闽发挥作用盼些淋巴因子统一命名为白细胞介豢 ( i n t e r l e u k i n ，i l ) ，并按发现的顺序以阿拉伯数学排列，如i l 。1 、i l 2 等，至今已有2 9 种 自介豢被发现莠命名。 鸡白细胜介豢1 8 成熟蛋白撩脚克隆与表达的研究 二、白细胞介素1 8 的研究进展 ( 一) i l 1 8 的发现 0 妇黼搬趣等( 1 9 8 2 ) 及萁缝实验寰( n a k a m u r ak e ta l ，1 9 8 9 ) 在鞠年代戡发怒痤疮覆簸 杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u ma c n e s ，p a c n e s ) 台用丝裂原能显著增加i f n y 的分泌水平，但零 用丝裂原则无此效威。l p s 合用熊裂原也具有此作用，鉴予不象是由l p s 直接作用所 致，德翻接测其中必蠢莱令中分颡予参与，毽一盏泰藐确定。 1 9 8 9 年，n a k a m u r a 等( 1 9 9 3 ) 从痤疮丙酸秆菌和l p s 致内毒素休克的小鼠血清中分 离出一种类似i l - 1 2 的因子，分予量约为7 5 k d a ，有诱导i f n 。y 产生的活性。 1 9 9 5 年，o k a m u r a 等发瑷翔p 。 i c n e $ 整璎瓣小鼠孬曩撬c d 3 蕈交嶷魏俸裁激，霹 释放高水平的i f n y 。随后从腹腔注射p a c l l e s 和l p s 致内毒素休克的小鼠肝脏中分 离出一魑多肽片段根据其中两个多肽片段的抵基酸序列合成寡核苷酸引物，以此引 魏竭r t p c r 从小鬣鼹整中提玫筑m r n a 扩港密令不突念装e d n a 片段，佟为搽 针，筛选小鼠肝细臌e d n a 文障，得到一全长的e d n a 克隰，并在大肠秆菌中表达。 因其百丁诱导i f n v 产生，命名为v 一干扰紫诱导因子f i n t e r f e r o ng a m m ai n d u c i n g f a c t o r ，i g i f ) ( o k a m u r ah 髓a l ，1 9 9 5 ) 。 1 9 9 6 年，u s h i o 簿用鼠i g i fe d n a 作为探针，从正常人_ | j ：脏e d n a 文库中分离出 人的i g i fe d n a 。撩于i g i f 的氨罄酸序列与融知数据库中的任何蛋白质均不相同，并 虽隧豢磷究瓣深入，发疆它狳了缝诱导i f n 一￥产生羚，还蠢其它多耱鸯魏学凌髭，瑟 且i g i f 在结构上与i l - l 相似，在功能上接近i l - 1 2 ( k o h n ok e ta l ，1 9 9 8 ) ，因而被认为怒 白介索家族的新成员，便重新命名为白细胞介素1 8 ( i n t e r l e u k i n - 1 8 ，i l 1 8 ) f u s h i ose t a l ，1 9 9 6 ) 。 ( 二) i l 。1 8 的来源 人和小鼠的i l - 1 8 都主要是幽直噬细胞栉细胞产生，如单核巨噬细胞，肝中的 k u p f f e r 缍魏等。小鬣| l - 1 8 主要_ 袋滠子p 。a c n e s 处理枣蔑豹器捶蚕氏爨簇，瞧p ；a c 珏e s 诱导的腹腔贴壁细胞也有i l 一1 8m r n a 的表达。而l p s 不能刺激上述细胞产生i l 1 8 。 人i l 一1 8m r n a 在胰脏、肾脏、骨骼肌中存程丰富，肝、肺中也可检测到，未刺激过 魏p b m c 孛也毒，黧熬袭琢兹粼激不教变m l g n a 静表这蠹( o k a m u r ah e ta l ，1 9 9 5 ) 。久 的t 、b 细胞，巨噬细胞中都有i l l g 的m r n a 存在；小鼠单核细胞、巨噬细胞中则自 发表达m r n a ，而t 、b 细胞中则未检测到。假有人从t 细胞系e l 4 中捡测到i l 一1 8 巍i c e m r n a ，嚣羹程簪豢c d 4 + t 绥憨中 塾笈疆粒痰可结会摭琵1 s 撬镩，这表甓t 山东农业大学博士学位论文 缨稳霹能巽寿鑫发淘t h l 缀簸发弯懿藐力( o k a m u r a he ta l ，1 9 9 5 ；u s h i ose ta l ，1 9 9 6 ) 。潘 化后的b 细胞累a 2 0 中也能检测到i l 一1 8m r n a ( t o n em e ta l ，1 9 9 7 ) 。 t a k e u c h i 等( 1 9 9 7 ) 用免疫缜化及免疫咆镜的方法分析了i l 1 8 在照常生理情况下不 弱举羚丈，j 、戆夺鬣静缓绫分帮，发嚣i l - t 8 主要经予小肠上皮细胞静魏浆中，缓缓李凌疆 物的e l i s a 检测也证实了遮一点，并具有嫩物学活性。 s t o l l 等( 1 9 9 7 ) 用r t - p c r 及细胞剔除的方法证明小鼠角朊细胞或冀细胞系p a m 2 1 2 戆表达i l - 1 8m r n a ，嚣盈笈麓：l 童襞蘸髓裁激疆1 8m r n a 的表达及旌活健匏i l - 1 8 瓣 产擞。这一发现与表皮角朊细胞能影响t 细胞向t h l t h 2 偏轨相符，也与它们产嫩 i c e 相符。s a i n t - v i s 等( 1 9 9 8 ) 从人脐血c d 3 4 + 前体细胞扩增出的树突状细胞中检测到 露i l - 1 8 m r n a 袋迭。 与m - 1 8 相比，1 1 , - 1 2 p 4 0 m r n a 的表达范围则非常局限。 ( 三) i l - 1 8 的分子结构 小鼠静i l - 1 8 藏俸多黢囊1 9 2 个氨蒸黢残基组成，会脊一个3 5 个鬣基酸残蒸的；l 导序y l j ( o k a r n u r ah e ta l ，1 9 9 5 ) ，人的i l - 1 8 前体多肽由1 9 3 个氨基酸残基组成，含有一 个3 6 个氨基酸羧基的引导序别。它们的周源性为6 5 。有种属特异帔。它们的核萤酸 净捌翡长1 1 k b ，茏n 糖萋豫位点帮豌承僚号获。成熬懿i l 1 8 分予豢约1 8 3 k d ，等 电点为4 8 。以单体形式发挥作用( u s h i os 毗a l ，1 9 9 6 ) 。 i l - 1 8 前体匆i l 一18 前体相似，没肖生物学活性。但两者郝霄i l - 1b 转换酶 ( i n t e r l e u k i n - 1 - c o n v e r t i n ge n z y m e ，i c eo r 娆s p a s e - 1 ) 翡毅工瞧点天冬氨酸残基( a s p ) ， i c e 可选择性地在特异性的俄点切割，使之成为有活性的成熟蛋白。目前认为小鼠的 i o l 裂解证点憋3 5 a s p _ 3 6 a s h ，入的，1 裂解位点是3 6 a s p - 3 7 t y r 。实验证明，i c e 缺 陷静小鬣可敬垒成i l 1 8 蔫俸，僵不能将菸转换成有活靛的琵1 8 ，l p s 不l 在邀犟牵，j 、 鼠诱生i f n - y ( g h a y u rt e ta l ，19 9 7 ) 。而i c e 的抑制剂，如一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 则 可照止m 爷释放也1b 和i l 1 8 ( k i my m e ta l ，1 9 9 8 ) 。 掰叠谈鄹分裾袭暖，i l 1 8 的蛋鑫震络榆与i l 1 家族相似，箕蛋蠢质序歹i 与l l ，l # 有1 9 的同源性，与- lc i 谢1 2 的同源性。而且在器种系的i l 1 8 序列中都会肖 段i l - 1 家族的拣恚牲氮基鞭序刭，穗必i l ，1 特征撵序捌：f x ( 1 2 ) f - x s x f 6 ) ，f - l ( u s h i ose ta l ，1 9 9 6 ) ( 图1 ) 。i l 一1 8 的空闻缡梅是与i l - 1 桷似的三时苹登。该缩桷有 3 个“y ”型或“三叶草”状的单元构成，每个单元有4 袋1 3 折叠链，2 个发夹结构( 图 2 ) ，数整个结构焚有1 2 条反翻乎孳亍的8 童呼蹙键帮6 个发必结构。其中6 条b 折叠镰、3 鸡自细胞介索1 8 成熟蛋岛箍圈克琏与表达的研究 个发必结构形成一桶状结构，藏中央是一个臌大的疏水核心，而另6 祭b 折叠链和3 个发夹结构在桶底部作三角形摊列，形成一个“桶盖”( m u r z i na g e ta l ，1 9 9 2 ) ( 图2 ) 。 麦子t l - 1 8 与i l - t 褥覆多翅l 菇之怒，秀者哥戆袋源予穗溺翡翟宠，鼓毒久建浚将疆1 8 命名为i l - 1y ( b a z a nj f e ta l ，1 9 9 6 ) 。 h u m a ni l ，l r 器 h u m a nl 卜l e t h 圳豫ai g - 1 1 3 l a u g hl k 一撼 掘o u 鞴i l - 1 8 r s t ! 卜撼 r a ti ，l 繇 d o gi l 一1 8 p i gi l - 1 8 h o r s e l 1 8 b o v i n el 毛一l 霉 c h i c k e ni l ，t 巷 圈1i l - l 争玑一1 8 冲i l - i 特秘样痒列纳鼻匕较 1 0 山东农业大学博士学位论文 霉2i b l l l 时争三叶草型空同蛄抽和”j - 鐾单元培构 ( 四) i l 1 8 的基因结构和基因表达调控 人的i l 1 8 基因由6 个外显子、5 个内含子组成，长约1 9 5 k b ( k a l i n a ue ta l ，2 0 0 0 1 。 小鼠的i l 1 8 基因位于9 号染色体，由7 个外显子组成，长约2 6 k b 。外显子1 和2 是5 端非编码外显子，在这两个外显子上游分别是调节i l 1 8 基因表达的启动子p 1 、 p 2 。这两个启动子属于独特的少t a t a 型启动子( 但并非富含g + c ) ，这与其它细胞因 子的启动予多属t a l a 型不同，可能正是通过调节i l 1 8 的这两个启动子，才使得i l 鸡自细胞介素j8 成熟蛋白基鄹克隆与表逸的研究 1 8 基麓可在多释类燮静缅魏中表达( t o n em e t a l ，1 9 9 7 ) 。位于上游一3 9 一2 2 的 i c s b p ( i f nc o n s e n s u ss e q u e n c eb i n d i n gp r o t e i n ) 和一3 l - 1 3 的p u 1 可分别与外鼹予1 和 外显予2 的上游调控序捌结合，增加1 l * 1 8 的基因表达( k i my m e ta l ，1 9 9 9 ) 。弼有实验 诞明，i f n y 可能过t c s b p 靼位于11 2 0 1 0 8 3 鲍活亿蛋白一l ( a c t i v a t o rp r o t e i n 1 、a p 。 1 ) 2 个元件增强m ( p 表达i l 1 8 ( k i my m e ta l ，2 0 0 0 ) 。d n a 蛋白结合实骏证实，在启动 予上游区域与共毒序列特舅绥台斡是s t a t s ( s i g n a lg a n s d u e e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r - 5 ) ，丽非s t a t 3 。s t a t 5 共转染可增加i l 1 8 启动予的诱导( k a l i n a ue ta l ，2 0 0 0 ) 。瑟努发瑷，在多耱缓麓中i l 1 8 藻因静表选与i c em r n a s 的袭达相一 敞。i l 1 8m r n a 的广泛分布及淇与i c e 的特殊关系，提示i l 1 8 的表达可能与i c e 或 i c e 徉蛋囱酶褶关的细魏澜亡遥程有关( t o n em e ta l ，1 9 9 7 ) 。 ( 五) i l - 1 8 的处理机制 入鹋i l - 1 8e d n a 编码一种含1 9 3 个氨然酸的前体蛋囱( p r o l l 1 8 ) ( u s h i ose t a l ，1 9 9 8 ) ，它是条2 4 k d a 的多服，没鸯生物学浜蛙，被c a