（食品科学专业论文）促进植物乳杆菌STⅢ在脱脂乳中生长营养因子的研究.pdf

摘要 摘要 植物乳杆菌常存在于发酵的蔬菜和果汁中，大多数菌株可以从发酵的植物性产品和 青贮饲料中分离得到，也是人体肠道主要的微生物。在人体肠道中，植物乳杆菌通过与 病原菌竞争限制性营养素，抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏 障。同时，植物乳杆菌通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢以及双乙酰等代谢产物抑制 其它细菌，调节肠道微生物菌群的组成，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳 糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成。植物乳杆菌s t i ( c g m c cn o 0 8 4 7 ) 是一株具有降 低血清胆固醇能力的益生菌，前期研究结果表明，其在脱脂乳中生长缓慢、产酸能力弱。 为了揭示影响植物乳杆菌s t i i i 在脱脂牛乳中生长的机理，本文对其生长限制因子进行 了初步的探索。 首先，考察了多种碳源、氮源以及维生素等营养因子对其生长的影响。实验结果表 明，在脱脂乳中添加碳源、维生素、氨基酸对其生长及凝乳无显著影响；添加鱼蛋白胨 可显著促进植物乳杆菌s t - i l l 在脱脂乳中生长和凝乳，活菌数最高可达1 4 x 1 0 9 c f u m l ，最高滴定酸度为6 0o t 并使脱脂乳凝乳( 3 7 恒温培养1 7h ) 。因此，我们推 测鱼蛋白胨中可能存在促进植物乳杆菌s t i i i 在脱脂乳中生长的营养因子。 鱼蛋白胨经过分子截留极限为5 0 0 0d a 的膜超滤后，透过液保留促进植物乳杆菌 s t i i i 在脱脂乳中生长和凝乳的作用。该透过液经过s e p h a d e xg 2 5 和s e p h a d e xg 1 5 凝 胶柱分离后，检测洗脱液在2 2 0l l n l 处的光吸收，获得一个可以促进植物乳杆菌s t - i l l 在脱脂乳中生长和凝乳的组分b 3 3 。 将组分b 3 3 冷冻干燥处理后进行红外光谱扫描，组分b 3 3 在c o 键特征峰位表现 较弱吸收，初步判断组分b 3 3 为非多糖物质。谱图中n h ”的伸缩振动、c o o 。伸缩振动、 n h 伸缩振动与弯曲振动、n h 和o h 的伸缩振动等特征吸收具有显著的肽类物质的 特征，初步推断组分b 3 3 中促进植物乳杆菌s t 一i 在脱脂乳中凝乳的物质是肽类物质。 其次，l c m s 分析检测出八种多肽组成。 最后，选取一株凝乳性较好的植物乳杆菌c z2 11 2 作为参照，对植物乳杆菌s t i i i 蛋白酶活进行研究。植物乳杆菌s t i i i 蛋白酶活及蛋白水解能力比植物乳杆菌c z2 1 1 2 低，而氨肽酶和羧肽酶活性与之差异较少，因此我们可以推测植物乳杆菌s t i i i 在脱脂 乳中不能很好生长和凝乳的原因是该菌株蛋白酶活性较低，在生长初期时不能很好利用 外源蛋白质营养。而添加鱼蛋白胨等促进生长后，植物乳杆菌s t i i i 可以将蛋白质、多 肽水解成一系列的寡肽或氨基酸，从而满足菌体生长的氮素营养。 关键词：植物乳杆菌，生长限制因子，脱脂乳，蛋白酶 a b s t r a c t a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，ap r e d o m i n e n t l a c t o b a c i l l u s s p e c i e s i nt h eh u m a n g a s r o i n t e s t i n a lt r a c t ，c o u l da l s ob ei s o l a t e dw i t hh i g hf r e q u e n c yf r o mi t sn a t u r a lh a b i t a t ，i e f e r m e n t e dp l a n tp r o d u c t ss u c ha sp i c k l e sa n ds i l a g e a sac a n d i d a t ep r o b i o t i c s ，l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mc o u l da d j u s th o s ti n t e s t i n a lm i c r o b i a lb a l a n c eb yi n h i b i t i n gt h eg r o w t ho ft h e p a t h o g e nv i an u t r i t i o nc o m p e t i t i o na n dp r o d u c t i o no fa n t a g o n i s t i cm e t a b o l i t e ss u c ha so r g a n i c a c i d ，b a c t e r i o c i n s ，h y d r o g e np e r o x i d ea n dd i a c e t y le t c l a c t o b a c i l l ih a db e e np r o v e nt oe x e r t c r i t i c a lp h y s i o l o g i c a li m p a c t so nh o s th e a l t hi n c l u d i n gr e s i s t i n gp a t h o g e nc o l o n i z a t i o n ， a d j u s t i n gm i c r o e c o l o g yb a l a n c e ，a n t i - t u m o rf o r m i n g ，i m p r o v i n gh o s td e f e n s ea n di m m u n e s y s t e ma n dr e d u c i n gs e r u mc h o l e s t e r o ll e v e l sa sw e l l l b p l a n t a r u ms t - i h a dd e m o n s t r a t e d t h ea b i l i t yt or e m o v ec h o l e s t e r o li nv i t r oa n di nv i v o o u rp r e v i o u ss t u d yr e s u l t ss h o w e dt h a t l b p l a n t a r u ms t - i c o u l dh a r d l yg r o wi ns k i mm i l k a sar e s u l t ，i ts h o w e dp o o ra b i l i t yt o c l o tm i l kp r o t e i nv i al a c t i ca c i dp r o d u c t i o n i nt h i sp a p e r , t h ei m p a c t so fav a r i e t yo fn u t r i e n t f a c t o r sw h i c hm i g h tr e s t r i c tt h eg r o w t ho fl b p l a n t a r u ms t - i i ii ns k i mm i l kw e r e i n v e s t i g a t e da n di tw a sp r o s p e c u l a t e dt h a tt h ep o o ra b i l i t yo fl b p l a n t a r u ms t it og r o wa n d c l o tt h es k i mm i l kc o u l db ea t t r i b u t e dt oi t sl a c ko fc e l lw a l l b o u n de x t r o c e l l a rp r o t e i n a s e a c t i v i t y f i r s to fa l l ，t h ei n f l u e n c e s o fm i c r o e l e m e n t ，v i t a m i n ，c a r b o ns o u r c e sa n dn i t r o g e n s o u r c e so ng r o w t ho fl b p l a n t a r u ms t - w e r es t u d i e dr e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tn o s i g n i f i c a n tg r o w t h p r o m o t i n ge f f e c t sw e r eo b s e r v e db ya d d i t i o no fv i t a m i n s ，c a r b o ns o u r c e s a n da m i n oa c i d s o nt h ec o n t r a r y , s u p p l e m e n to f1 ( w w ) p e p t o n ep r e p a r e df r o mf i s ht i s s u e s ( p f ) c o u l ds i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t et h eg r o w t ho fl b p l a n t a r u ms t - f f ii ns k i mm i l ka n d f a c i l i t a t em i l kc u r db ya c i d i f i c a t i o n a n da f t e rc u l t i v a t i o nt h en u m b e ro fv i a b l eb a c t e r i u mi n t h ef e r m e n t e dm i l kc o u l dr e a c h1 4x10 9c f u m la n dt h et i t r a t i o na c i d i t yw a su pt o6 0 。t t h e r e f o r e ，i tw a si n f e r r e df i s hp e p t o n em i g h tc o n t a i ns o m en u t r i e n t sf a c t o r sw h i c hc o u l d p r o m o t et h eg r o w t ho fl b p l a n t a r u ms t i l li ns k i mm i l k t h e n , i tw a sf o u n dt h eu l t r a f i l t r a t i o np e r m e a t eo ff i s hp e p t o n eb ym e m b r a n eo f m o l e c u l a rw e i g h tc u t - o f fo f5 ，0 0 0d a l t o nc o u l da l s op r o m o t et h eg r o w t ho f l b p l a n t a r u ms t i i ns k i mm i l k t h ep e r m e a t e m e n tw a sf u r t h e ri s o l a t e ds t e pb ys t e pb yc h r o m a t o g r a p h i n g t h ep e r m e a t a t eo ns e p h a d e xg - 2 5a n ds e p h a d e xg - 15c o l u m n ，埘t ht h ee l u t i o nd e t e c t e db y m e a s u r i n gt h ea d s o r b a n c ea tt h ew a v e l e n t ho f2 5 4 n m af r a c t i o n ( b 3 3 1 谢t l ls i n g l ep e a ka t 2 2 0 n m ，w h i c hc o u l ds t r o n g l ys t i m u l a t et h eg r o w t ho fl b p l a n t a r u ms t - i l li ns k i mm i l k ，w a s c o l l e c t e da n dl y o p h i l i z e d t h ec o m p o n e n t so ft h el y o p h i l i z e db 33w e r ef u r t h e rc h a r a c t e r i z e db yi rs p e c t r a i tw a s s h o w nt h a tb 3 3d e m o n s t r a t e ds t r o n ga b s o r b a n t eo fc oi nt h er a n g eo f1 0 0 0t o1 2 0 0 c m t h e r e f o r e ，t h ep o s i b i l i t yo fp o l y s a c c h r i d ew a se x c l u d e df o rb 33 i na d d i t i o n ，i rs p e c t r ao f b 3 3d i s p l a y e dt h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko fn h 3 + ，t h ef l e xl i b r a t i o no fa s y m m e t r ya n ds y m m e t r y o fc 0 0 ，t h ef l e xl i b r a t i o no fn ha s y m m e t r yc u r ll i b r a t i o na n ds y m m e t r yc u r l l i b r a t i o n b e s i d e s ，t h ef l e xl i b r a t i o no f0 ha n dn h ，a n dt h ec = oa n dc 0w e r ea l s ov e r ys 仃o n g i i a b s t r a c t t h e r e f o r e ，i tc o u l di n f e rt h a tt h ep r e d o m i n e n tc o m p o n e n t so fb 3 3w e r ep e p t i d e s t h e c o m p o s i t i o no fb 3 3w a sf u r t h e ra s s a y e db yl c m s m sw h i c hg e t se i g h tp e p t i d e s t oi l l u s t r a t et h ei m p a c t so ft h ep r o t e o l y t i ca c t i v i t yo f l b p l a n t a r u ms t 一1 1 1o nt h eg r o w t h o fi t s e l f , t h ee x t r a c e l l u l a rp r o t e a s ea n di n t r a c e l l u l a rp e p t i d a s ea c t i v i t yo fl b p l a n t a r u ms t i l l w e r ec o m p a r e dw i t h 三6 p l a n t a r u mc z21 12 ，as t r a i n g r o w i n gw e l l i ns k i mm i l k s u p p l e m e n t e d 、析t hg l u c o s ea n dc l o t t i n gm i l kp r o t e i n sr a p i d l y c o m p a r e dw i t hl b p l a n t a r u m c z21 12 ，l b p l a n t a r u ms t - i i ih a dl o w e rp r o t e a s ea c t i v i t y ，w h e r e a st h e r ew a sn oo b v i o u s d i f f e r e n c ei nt h ea c t i v i t yo fa m i n o p e p t i d a s ea n dc a r b o x y p e p t i d a s ea c t i v i t i e sb e t w e e nt h et w o l a c t o b a c i l l u ss t r a i n s t h e r e f o r e ，i tw a sp r e s u m e dt h a td e f i c i e n c yi np r o t e a s ea c t i v i t yo fl b p l a n t a r u ms t i i i ，w h i c hw a sr e s p o n s i b l ef o rh y d r o l y z i n gl a r g em i l kp r o t e i n si n t os m a l l p e p t i d e sw h e nt h eb a c t e r i aw e r ec u l t i v a t e di ns k i mm i l k ，b ec o r r e l a t e dw i t ht h ep o o ra b i l i t yo f l b p l a n t a r u ms t 一t og r o wi na n dc l o tm i l k k e y w o r d s ：l b p l a n t a r u m f a c t o r sr e s t r i c t i n gg r o w t hs k i m e dm i l k p r o t e a s e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果；也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 叠至：璋 日 期： 蟹z ：u 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：4 扯导师签名：， e l 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 益生茵与机体健康 1 1 1 益生茵的定义 益生菌( p r o b i o t i c ) 源自希腊语，意思是有利于生命( f o rl i f e ) i i l 。益生菌的概念最 早起始于1 9 6 5 年，l i l l y 首先提出益生菌是指对动物肠道菌群平衡有益的物质或微生物 1 2 1 。1 9 8 9 年，f u l l e r 将其修改为：“一种或几种活的微生物，摄食后可通过改善肠道菌群 的平衡，对宿主健康产生促进作用1 3 j 。近年来，随着各种微生物对人体健康作用研究 的深入，越来越多的微生物种类被发现可以通过不同的方式影响机体的健康，对益生菌 的定义和概念也在不断被修订。目前，s c h a a s m a 关于益生菌的定义较为公认，他强调 益生菌指“摄入一定数量活的微生物，这些微生物除了原有的营养价值之外，还具有对 宿主明确的健康促进效应1 1 l ，。 1 1 2 益生菌的生理活性 由于益生菌对宿主健康有益，因而得到了广泛的应用，常见的益生菌有乳杆菌，双 歧杆菌、肠球菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌以及酵母菌等i l , 4 1 。迄今为止，益 生菌得到证实和广泛认可的生理活性如下1 2 7 1 ： 1 增加肠道内益生菌量，减少有害菌，防止腹泻； 2 提高机体免疫力、活化巨噬细胞以及产生肿瘤坏死因子、干扰素和i g a 等抗体； 3 吸附致癌物及减少粪便中致癌突变物的浓度和某些酶的活性，这些酶与突变物或 致癌物的激活有关； 4 降低血清胆固醇等。 随着益生菌产品的逐渐受宠，人们对益生菌产品的安全性也越来越重视。目前，评 价益生菌安全性的方法很多1 8 i ，主要为研究益生菌的特性、益生菌的药物动力学以及益 生菌与宿主之间的相互作用等。到目前为止，应用于食品的益生菌( 主要是乳酸菌) 都 被证明是安全可靠的。益生菌最好来源于健康人群的肠道或者必需经过很长时间证明无 致病性且安全可靠的外界来源1 9 。 1 2 乳酸茵与营养因子 乳酸菌在生长、繁殖、发酵过程中需要不同的营养物质。如果乳酸菌自身不能提供 这些物质，就需要外界提供。这些营养物质一般包括：游离氨基酸、肽类和维生素等。 1 2 1 游离氨基酸 乳酸菌对营养的要求非常苛刻，氨基酸在其生长过程中起着十分重要的作用。当乳 酸菌自身不能提供足够氨基酸时，生物体就需要从外界获取氨基酸，以保证新陈代谢的 正常完成。 c o c a i g n b o u s q u e t 等1 1 0 j 研究了游离氨基酸的种类对许多乳酸乳球菌生长的影响，研 江南大学硕士学位论文 究结果表明，谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这6 种氨基酸对几 乎所有被研究过的乳酸乳球菌都是必需的。因此，在培养基中添加适量的这6 种氨基酸 能促进许多乳酸乳球菌的生长。 g o d o n 等1 1 1j 研究发现，从非牛奶环境分离得到的乳酸菌在生长过程中只需要缬氨酸 而不需要异亮氨酸和亮氨酸。这不是由于基因结构上的缺陷所导致的，是因为合成缬氨 酸的基因同时也能合成异亮氨酸和亮氨酸，这很有可能是由于基因的同等表达导致在合 成缬氨酸的同时抑制了异亮氨酸和亮氨酸的合成。 在进入细胞时，氨基酸的相对数量以及相对比例可能比他们的实际浓度还要重要。 p o o l m a n 和k o n i n g s i l 2 l 证明一些氨基酸进入细胞是通过同样的运输系统。特别在生物体 以较高的速度生长时，一些氨基酸的主动运输可能成为生长的限制因子。这是因为由于 一些氨基酸的积极的运输会抑制其他通过相同运输系统的氨基酸的运输。 1 2 2 肽类物质 通常由1 0 1 0 0 氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于 10 0 0 0 d a ( d a l t o n ，道尔顿) ，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献 把由2 1 0 个氨基酸组成的肽称为寡肽( 小分子肽) ；1 0 - 5 0 个氨基酸组成的肽称为多肽； 由5 0 个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。 肽类物质的来源十分广泛。如酵母提取物，胰蛋白胨，大豆蛋白胨，动物性饲料， 玉米浆，肝浸液( l i v e ri n f u s i o n ) 、乳清蛋白水解物等i l 引。 乳酸菌在对多肽的需求上存在一些争议。t a n a k a 等1 1 4 l 发现一些菌种的生长完全地依 赖于多肽。而s e l b y 等1 1 5 i 、l a w 等1 6 i 及j u i l l a r d 等1 1 7 j 均发现多肽不同程度地刺激生物体 的生长。而有些乳酸菌在没有提供多肽的情况下也会生长得很好。 多肽进入细胞可以通过两种方式，一种是直接进入不需要水解，另一种是进行水解 后再进入细胞内。前一种直接将其运输入细胞的优点是可以节省氨基酸合成所需的能量 1 1 8 1 。对许多不同的乳酸乳球菌多肽摄入过程的研究表明，其所涉及的胞外酶，运输系统 都是底物专一性较高，这是由肽的长度和氨基酸的序列所决定的l l 列。乳酸菌对二肽和三 肽的吸收也会涉及到运输系统的竞争，在提供它们时需要一种供给的平衡。 1 2 3 维生素 除了氨基酸外，一些b 族维生素对乳酸菌的生长也是必需的。研究者们对那些必需 的和有促进生长作用的维生素已作了大量的研究。c o c a i g n b o u s q u e t 等l l 州、l e d e s m a 等 【2 引、n i v e n1 2 1 1 、r e i t e r 和o r a m l 2 2 i 研究发现烟碱对于n a d ( p ) 的合成是必需的，泛酸盐 是辅酶a 的辅助因子。油酸和天冬氨酸的合成需要维生素h l 巧l 。 维生素b 6 是氨基酸合成中所需的。对于一些乳酸乳球菌维生素b l 和核黄素是必需 的或对生长有促进作用1 2 l - 2 2 i 。核黄素对于辅助因子f a d 是必需的。维生素b l 在一些脂 的氧化上也有一些作用。叶酸和维生素b 1 2 对生物体的生长是非必需的1 1 0 2 0 。2 1 i 。 2 第一章绪论 1 3 乳酸茵蛋白水解系统 乳酸菌蛋白水解系统是乳酸菌在乳中生长的基本条件，蛋白质水解系统包括将蛋白 质断裂为肽的蛋白酶，进一步断裂肽形成更小的肽和氨基酸的肽酶，小肽和氨基酸的细 胞承载运输系统。乳酸菌种属之间蛋白酶和肽酶的表达存在很大的差异。一般乳酸茵的 蛋白酶活性比较弱，主要分布于细胞质和细胞壁中。存在于细胞表面的蛋白酶把蛋白质 切断至肽，然后渗入细胞内，被胞内蛋白酶分解成氨基酸。一般来说乳杆菌蛋白酶的酶 活优于乳球菌1 2 4 1 ，乳杆菌呈现一种广泛的肽酶活性，这些肽酶具有广泛专一性。 一般认为，乳酸菌利用无机氮源合成氨基酸的能力非常弱，主要依赖于茵体的蛋白 水解酶来水解底物蛋白，释放出大小不同的肽和游离的氨基酸以满足自身生长的需要 1 2 5 , 2 6 i 。蛋白水解系统与乳酸菌在乳中生长和功能性肽的释放有着密切的关系；蛋白水解 能力与发酵乳中的肽浓度有着直接的关联l ”i 。不同乳酸菌的蛋白酶的特异性也存在着显 著的差异，因此会对它们在乳中发酵时所产生的肽的组成产生重大影响。 1 3 1 乳酸茵的蛋白酶 许多细菌分泌的蛋白酶被认为是一种细胞外“自由的酶”1 2 8 ，2 引，然而通过大量的研 究发现，对蛋白酶准确的位置还是不能得出结论。对于细胞外蛋白酶的定义还没有一个 统一标准，这些酶也可能是从细胞内泄漏出来的。尽管对蛋白酶本身特性的研究甚少， 但是对控制蛋白酶的合成、运输、黏附到细胞壁的因素进行了大量的研究。例如：研究 学者普遍都认为细胞壁上的胞外蛋白酶和细胞内的蛋白酶是由不同的d n a 表达出来 的。e x t e r k a t e i 加l 发现一株有蛋白酶缺陷的菌虽然失去了两种细胞壁蛋白酶，但是保持着 细胞内蛋白酶的活性。这些都表明胞外和细胞内的蛋白酶是由不同位子的基因表达出来 的。s t r e p t o c o c c u sc r e m o r i s 和s t r e p t o c o c c u sl a c t i s 悬浮在缓冲溶液中时添加c a 2 + 会起到抑 制作用，这表明酶在黏附的时候有c a 2 + 离子的参与。此外，e x t e r k a t e 对于c a 2 + 的作用得 到了不同的结论，即c a 2 + 稳定了酶分子使其处在相对活跃的空间结构1 3 。 1 3 2 乳酸茵的肽酶 蛋白水解酶可分为内肽酶( 肽链内切酶) 和端肽酶( 肽链端解酶) 两大类。端肽酶 又称为肽酶( e x o p e p t i d a s e ) ，从肽链的一端开始水解，将氨基酸一个一个地从多肽链上 切下来( 图1 1 ) 。肽酶根据其作用性质不同可分为氨肽酶、羧肽酶和二肽酶。氨肽酶 从肽链的氨基末端开始水解肽链；羧肽酶从肽链的羧基末端开始水解肽链；二肽酶的底 物为二肽，将二肽水解成单个氨基酸。 2l3 h 斟一x l 一恐一x 3 一x 4 一一x 6 一c o o h 图1 1 蛋白酶的分类内肽酶从多肽的内部断裂肽键( 1 ) 外肽酶从多肽的n 端断裂肽键( 2 氨肽酶) 或从c 端( 3 羧肽酶) 断裂肽键 f i g 1 1c l a s s i f i c a t i o no f p e p t i d a s e s e n d o p e p t i d a s e sc l e a v ep e p t i d i cb o u n d si n s i d ep o l y p e p t i d e s ( 1 ) 3 江南大学硕士学位论文 e x o p e p t i d s a e sc l e a v er e s i d u e sl o c a t e da tt h en - t e r m i n a lp o s i t i o n ( 2 a m i n o p e p t i d a s e s ) o rc 。t e r m i n a l p o s i t i o n ( 3 c a r b o x y p e p t i d a s e s ) o fp o l y p e p t i d e 1 3 2 1 氨肽酶 氨肽酶是一种外肽酶，可以从多肽的n 端水解，其作用范围一般都较为广泛，根据 最易反应的底物不同可分为亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨 肽酶、脯氨酸氨肽酶等。 氨肽酶有单体酶也有复合酶。复合酶一般为相同的单体构成，但也有不同单体的。 根据催化机制可分为金属氨肽酶、半胱氨酸氨肽酶及丝氨酸氨肽酶。三分之二的氨肽酶 都为金属酶，z n 2 + 是最常见的结合离子，其他的结合离子有c 0 2 + 及m n 2 + ，一般每个单体 结合1 个金属离子，但也有每个单体结合2 个的，如a e r o m o n a sp r o t e o l y t i c a 所产的亮氨 酸氨肽酶( 每个单体上结合两个距离很近的z n 2 + ) ，l a c t o c o c c u sl a c t i s 所产的丙氨酸氨肽 酶( 结合两个c 0 2 + ) 。金属离子不仅与金属氨肽酶的活性有关还与三级结构的稳定性有 关。半胱氨酸氨肽酶和丝氨酸氨肽酶在细菌中较为少见，各占2 0 不到。 氨肽酶活性测定方法有硝基苯胺( p n a ) 法及荧光底物法。荧光底物法以a a - a m c 为底物，反应一定时间，测定水解产物的荧光性，该法迅速灵敏，可用于在线的连续测 定，但成本较高。硝基苯胺是黄色物体，硝基苯胺是以不同的a a - 对硝基苯胺作为底物， 利用水解出的p n a 于4 0 5a m 显色进行测定，常用的底物为l e u p n a 。 1 3 2 2 羧肽酶 许多种微生物都能产生羧肽酶，如曲霉属的黑曲霉和米曲霉：硫代叶菌属和水生栖 热菌产生的耐热羧肽酶3 2 - a a l 。酪生青霉、酵母产生的丝氨酸羧肽酶1 3 4 l ，假单胞杆菌属等 【3 5 4 6 1 ，都能产生羧肽酶。其中应用于食品的主要是黑曲霉和米曲霉，因其使用安全而得 到广泛应用。 丝氨酸羧肽酶广泛分布于真菌及高等动植物，丝状真菌含量尤其丰富。微生物羧肽 酶大多是丝氨酸羧肽酶，大多数酶在酸性p h 条件下从多肽和蛋白质的羧基端释放包括 脯氨酸在内的大多数疏水氨基酸残基，水解速度受占据羧基端次末位的氨基酸残基的影 响。丝氨酸羧肽酶水解多肽时除了能切除碳端氨基酸，在转肽酶反应时还能够取代碳端 氨基酸，而不破坏肽链的内部结构，所以羧肽酶在肽的合成和碳端测序的研究中受到人 们的重视。 测定羧肽酶活性时根据羧肽酶是一种可以从肽链氨基端降解多肽的外肽酶，在适宜 的条件下，从肽链的羧基端水解蛋白质或多肽，释放出游离的氨基酸。常用c b z - g l y - t y r 和c b z a l a - g l u 作为底物并在3 4 0n n l 处有强烈的吸收i 了。 1 4 立题依据和研究内容 1 4 1 立题依据和意义 益生菌是指当摄入一定数量，能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成， 发挥对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物1 3 引。目前，已经证实的 益生菌的益生作用主要有：抑制肠道致病菌，调节肠道免疫功能，防治多种类型腹泻； 刺激肠道蠕动、防止便秘和胃肠胀气；促进生长，控制感染与增加营养素的消化利 4 第一章绪论 用率；促进钙、镁、铁、锌和维生素d 的吸收；减轻乳糖不耐受症状等。 随着物质生活水平的提高，冠心病( c h d ) 和动脉粥样硬化等心血管疾病成为目前 危害人类健康，导致死亡的首要因素。研究结果表明，血清总胆固醇( t c ) 和冠心病 ( c h d ) 等心血管疾病发病率始终存在一种强阳性的、连续的、独立的等级性关系。虽 然，目前有许多用于降低胆固醇含量的药物，但是人们更希望通过非药物的途径达到降 低胆固醇含量的目的，国内外均有乳酸菌具有降低胆固醇的益生功能的报道。因此，益 生菌降低血清胆固醇水平和血脂浓度的作用成为近年来研究热点之一1 3 9 l 。发酵乳是益生 菌的有效载体1 4 们，筛选具有降低血清胆固醇水平功能的益生菌，应用于发酵乳制品中， 开发具有降低血清胆固醇水平功能乳制品具有广阔的市场前景和重要的社会意义。 植物乳杆菌s t - i i i 是一株降胆固醇性能较好的植物乳杆菌，但其不能在牛乳体系中 生长、产酸并凝乳，限制了其在乳制品领域的应用。本文探索限制植物乳杆菌s t - i l l 在 牛乳体系中生长的因子，并对营养因子的化学组成和分子量以及植物乳杆菌s t - i i i 蛋白 酶和肽酶进行活性分析，以期揭示其不能凝乳的机理，为拓展植物乳杆菌s t - i 在乳制 品领域的运用及其产业化奠定理论基础。 1 4 2 主要研究内容 1 不同外源添加物对促进植物乳杆菌s t - i f ! 在脱脂乳中生长情况的考察： 2 能促进植物乳杆菌s t - i i i 在脱脂乳中生长的有效外源添加物组分的解析； 3 植物乳杆菌s t - i 蛋白酶活性的分析比较 5 江南大学硕士学位论文 第二章外源添加物对促进植物乳杆菌s t - i l l 在脱脂乳中生长情况 的考察 2 1 前言 植物乳杆菌s t - i l l ( c g m c cn o 0 8 4 7 ) 是基于体外降胆固醇模型筛选出来的一株具 有降低血清胆固醇能力的益生菌【4 l 】，但前期研究结果表明，其在脱脂乳中生长缓慢、产 酸能力很弱、不能凝乳。为了阐明限制植物乳杆菌s t - i l l 在脱脂乳中生长的营养因子， 分别考察了外源添加物碳源、氮源( 蛋白胨、氨基酸) 和维生素对其生长的影响。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 植物乳杆菌s t - i l l 菌株由光明乳业技术中心实验室保藏，分离自传统食品泡菜。使 用前用m r s b r o t h 培养基活化，以1 的接种量接种，在3 7 培养2 4 h ，传代两次以 备实验使用。实验菌株在实验过程中4 冰箱保存。 2 2 2 培养基 m r s 液体、m r s 固体培养基( 德国m e r c k 公司，配方：酪蛋白胨、牛肉浸取物、 酵母提取液、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、 七水硫酸锰、碳酸钙、琼脂、蒸馏水、) ； 脱脂乳优化培养基：以脱脂乳培养基为基础添加不同营养物质。 葡萄糖、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨( 鱼蛋白胨) 、维生素和氨基酸等为分析纯或生 化试剂，从上海国药集团化学试剂有限公司购买。 2 2 3 试验仪器与设备 仪器名称 超低温冰箱 p h 计 隔水式电热恒温培养箱 厌氧培养箱 高速冷冻离心机 漩涡混合仪 超净工作台 立式压力蒸汽灭菌器 电热恒温水槽 微滤膜 规格型号 m d f u 5 2 v p h s - 2 5 g n p 9 2 7 0 b u g b o x d u a l a 、r a n t ij 3 0i w h 2 t h c b - 4 0 2 l s b 5 0 l d k 一8 d 0 2 2g m 6 生产厂家 s o n y o 公司 奥立龙公司 上海精宏实验设备公司 r u s k i nt e c h n o l o g y 公司 b e c k ，i anc o u l t e r 公司 上海沪西分析仪器厂 l a b c o n c o 公司 上海华线医用核子仪器有限公司 上海精宏试验设备有限公司 北京北化黎明膜分离技术有限责任公司 第二章外源添加物对促进植物乳杆菌s t i 在脱脂乳中生长情况的考察 2 3 实验方法 2 3 1 植物乳杆茵s t - i l l 茵种保存及活化 植物乳杆菌s t - i i i 原始菌种采用添加1 0 甘油的m r s b r o t h 于8 0 冰箱保存。原 始菌种使用前用m r s b r o t h 培养基活化两次后，按l 的接种量接种到添加不同营养因 子的1 2 脱脂乳培养基中。 2 3 2 生长曲线的测定 活化好的菌株以1 接种量分别接入脱脂乳培养基中，3 7 恒温培养2 4h ，每隔2 h 测定培养液的p h 值和活菌数；发酵液p h 值用p h 计测定，活菌数采用m r s 固体培 养基浇注平板计数法测定。 2 3 3 碳源对植物乳杆菌s t - i l l 生长的影响 以质量分数为1 2 的脱脂乳为基础培养基，分别添加2 的葡萄糖、半乳糖或果糖， 1 1 8 高压灭菌1 0m i n ，接入1 活化的植物乳杆菌s t - i l l ，3 7 恒温培养箱培养2 4h 并测定其生长曲线。 2 3 4 氮源对植物乳杆菌s t - i l l 生长的影响 ( 1 ) 不同蛋白胨对s t - i i i 生长的影响 以质量分数为1 2 的脱脂乳为基础培养基，分别添加1 o 的酵母浸膏、牛肉浸膏、 鱼蛋白胨、胰蛋白胨以及大豆蛋白胨，1 1 8 高压灭菌1 0m i n ，以1 的接种量接种活 化的植物乳杆菌s t - i ，3 7 恒温培养箱培养2 4h 并测定其生长曲线。 ( 2 ) 游离氨基酸对s t - i i i 生长的影响 分别称取一定量的丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨 酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸以0 0 2 的添加量添加至脱脂乳中，1 1 8 高压灭菌1 0m i n ，接入1 活化的植物乳杆菌s t - i i i ，3 7 恒温培养箱培养2 4h 并测 定其生长曲线1 4 2 1 。 2 3 5 维生素对植物乳杆菌s t - i i i 生长的影响 分别称取2m g 脂溶性维生素a 、d 添加至质量分数为1 2 的脱脂乳溶液( 1 0 0m l ) 中，1 1 8 高压灭菌1 0m i n 。水溶性维生素b 1 、b 2 、b 5 、b 6 、b 1 2 、v c 、k 、叶酸、 泛酸各2m g 溶于2 0m l 水中，混合维生素溶液过0 2 2g m 微滤膜后，以2 的添加量 加入到灭菌后的脱脂乳中1 4 3 1 。接入l 活化的植物乳杆菌s t - i i i ，3 7 恒温培养箱培养 2 4h 并测定其生长曲线。 2 4 结果与讨论 脱脂乳中除水分以外，可以作为乳酸菌生长的主要营养成分为乳糖、蛋白质和矿物 7 江南大学硕士学位论文 质，维生素d 的含量也比较丰富，而游离氮、尤其是小分子的肽和氨基酸含量比较低， 可能成为影响部分蛋白水解能力比较弱的乳酸菌在其中生长的主要因素。我们通过在脱 脂奶中分别添加碳源、氮源、维生素来探索可以促进物乳杆菌s t - i i i 在脱脂乳中生长的 营养因素。 2 4 1 碳源对植物乳杆菌s t - i l l 生长的影响 微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源 物质，但不同微生物对不同糖类物质的利用也有差别。一般而言，单糖优于双糖和多糖， 己糖优于戊糖，葡萄糖、果糖好于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显地优于纤维素 或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其他聚合物( 如木质素) 。本实验中 添加微生物利用性良好的葡萄糖、果糖、半乳糖至脱脂乳中，探讨不同碳源对对促进植 物乳杆菌s t - i i i 在脱脂乳中生长的影响。 3 薹 醚 聪 辇 琶 , - 1 o2l6l1 01 21 41 61 82 2钳 时阀厦 ( a ) 图 8 第二章外源添加物对促进植物乳杆菌s t - i i i 在脱脂乳中生长情况的考察 皆 酬 蠹 挺 2 t 2 2 2 0 1 8 1 6 1 4 1 2 图2 - l 不同碳源对植物乳杆菌s t - i n 在脱脂乳中生长情况( a ) 及产酸能力( b ) 的影响 f i g 2 - 1t h ee f f e c to ng r o w t hs i t u a t i o n ( a ) a n da c i d o g e n i ca b i l i t y ( b ) o fl b p l a n t a n u ns t - i l li ns k i m m e d m i l kw i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o