（分析化学专业论文）高效亲和色谱柱填料dyep（gmaedma）的制备及其性能评价.pdf

浙江太学硕士学位论文 摘要 单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯甲基丙烯酸乙二醇酯p ( g m ae d m a ) 微 球的疏水性比交联聚苯乙烯弱且其表面含有丰富的环氧基，改性后会衍生出大量 的羟基，特别适合于生物大分子的分离纯化。8 微米左有的表面多孔p ( g m a e d m a ) 微球可作为高效液相色谱柱填料中的基质材料。亲和色谱是一种高效简便的蛋白 纯化分离技术，高效亲和色谱( h p a c ) 是在经典亲和色谱技术上结合高效液相色 谱( h p l c ) 特点发展起来的一个新技术，它具有分离速度快、分析检测简单、较 好的分离效果和较高的回收率等优点，适用于批量样品的分析和制备。本文将 p ( g m ae d m a ) 微球作为高效液相色谱的基质材料，三嗪染料作为拟生物亲和配 基，两者耦联成为一种新型的染料配基亲和色谱填料并将其用于对蛋白质纯化分 离，主要做了以下研究丁作： 1 ，以分散聚合法制备的2 微米聚苯乙烯微球为种子，g m a 、e d m a 为单体， 用步种子溶胀法制备了表面多孔的p ( g m ae d m a ) 微球。分别研究了制备种子和 微球的影响因素，并对微球进行了性能表征。实验结果表明，当溶胀倍数为3 0 z ：右，交联剂含量为4 5 ，荦体与致孔剂比为1 2 5 时所制备的微球在7 微米左 右，粒径单分散，表面多孔，刚性好，适合用做高效色谱柱填料。 2 ，以自制p ( g m a e d m a ) 微球为基球，共价耦联两种染料配基c bf 3 g a 和p b m x r ，制得r 两种高效亲和色谱填料p bm x r p ( g m a e d m a ) 和c b f 3 g ap ( g m a e d m a ) ，对其进行性能表征。研究了染料耦合的最佳反应条件，实验 表明制得的染料树脂性能稳定，在酸性碱性溶液中没有泄漏情况。 3 ，用匀浆法将所制的两种染料亲和色谱填料填装成高效亲和色谱柱，研究了 两种染料亲和色谱柱分离蚩f 勺样品的色谱条件、分离选择性、稳定性、色谱柱柱 压、柱子的样品负载量和样品回收率等。 在1 0 0 4 6c m 的p bm x r p ( g m a - e d m a ) 色谱柱上，探讨t p h 、流速、离子 强度和有机修饰剂对溶菌酶分离的影响，得出目标蛋白溶菌酶的最佳淋洗条件为 含1 0m o l 1 3 q a c l 、1 5 乙二醇，p h 7 8 的t r i s h c l 缓冲液为淋洗液，流速为0 5 m l m i n 。在最佳淋洗条件下对一i 同浓度溶菌酶进行测定，该高效亲和色谱柱具有 良好的线性、重现性、稳定性等色谱性能。实际应用中，它能将鸡蛋清样品中的 溶菌酶成功分离。 浙江太学硕士学位舟文 在2 5 x 0 4 6c m l 的c bf 3 g a p ( g m a 功m a l 色谱柱上，测得溶菌酶在1 0m l m i n 流速下的动态最大吸附量为4 5 3m g m l 。牛血清蛋白和溶菌酶蛋白混合标样在此 色谱柱上能很好分离，过氧化氢酶标样蛋白也能得到分离。在实际应用中，它能 将鸡蛋清样品中的溶菌酶成功分离，而且将油菜花粉初提物中的糖蛋白成功的分 成三个蛋白峰。 关键蒯：p ( g m a e d m a ) 微球， 一步种子溶胀法，二嗪染料，溶菌酶，过氧化氢酶 鸡蛋清，高效亲和色谱 v 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em o n o d i s p e r s ep o l y ( g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e - - c o - e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ) b e a d sa r e p a r t i c u l a r l yu s e df o rb i o p o l y m e rs e p a r a t i o n ，s i n c et h e i rh a v eg o o dh y d r o p h i l i c i t y , w h i c hw a sa b b r e v i a t e da s p ( g m a e d m a ) t h eh y d r o l i z a t i o n o ft h ee p o x i d e g r o u p se x i s t e do nt h es u r f a c eo fp ( g m a - e d m a ) c a nb r o u g h tal o t o fh y d r o x y l g r o u pw h i c hi sg o o df o rc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n b a s e do np o r o u sp a r t i c l e so f8 “mp ( g m a e d m a ) i sa p p l i c a b l ef o rt h ea n a l y s i sa n d m i e r o p r e p a r a t i v es e p a r a t i o no fp r o t e i n s t h er e s i nh a sa d v a n t a g e sf o rr a p i da n a l y s i s ， h i g hc o l u m ne f f i c i e n c y , l o wc o l u m nb a c k p r e s s u r e ，h i g hp r o t e i nm a s sr e c o v e r ya n d g o o dr e s o l u t i o nf o rp r o t e i n i nt h i sp a p e r ，w ep r e p a r e dd y e - a f f i n i t yr e s i ni nw h i c h p ( g m a - e d m a ) m i c r o s p h e r e sw e r eu s e da st h es u p p o r t ，a n dt w od y el i g a n d sw e r e i n c o r p o r a t e di n t ot h e s em i c r o b e a d sf o rt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fp r o t e i n s t h e m a i nw o r kf o l l o w s ： 1 p o r o u sp a r t i c l e s ，p ( g m a e d m a ) m i c r o p h e r e sw i t h d i a m e t e ro f 饥mw e r e p r e p a r e db yas i n g l e - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o nm e t h o d ，u s i n gp o l y s t y r e n e m i c r o p h e r e sp r e p a r e db yd i s p e r s i o np o l y m a t i o n a ss e e dp a r t i c l e sa n dg m a 、e d m aa s m o n o m e r s t h ee f f e c tf a c t o r so fp r e p a r a t i o nw e r es t u d i e di nd e t a i l ，a n dt h ef a v o r a b l e o p e r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ef o u n da t ：t h es w e l l i n gm u l t i p l ei s3 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o n so f c r o s s l i n k i n gr e a g e n ti nm o n o m e r si s4 5 ，t h er a t i o so fm o n o m e rt op o r o g e ni s 1 2 5 t h es y n t h e s i z e dm o n o d i s p e r s ep ( g m a - e d m a ) r e s i np o s s e s s e sm a c r o p o r o u sa n d h i g hm e c h a n i ci n t e n s i t y 2 p r o o o nb l u em x - ra n dc i b a c r o nb l u ef 3 g aw e r ec o v a l e n t l yc o u p l e dw i t h p ( g m a - e d m a )m i c r o p h e r e s ，t h u s t w on o v e l d y e a f f i n i t y r e s i n sp b m x - r - p ( g m a - e d m a ) a n dc bf 3 g a p ( g m a e d m a ) w e r ep r e p a r e d t h ee f f e c t f a c t o r so fp r e p a r a t i o nw e r es t u d i e d i tw a sf o u n dt h a tt h e s ed y e a t t a c h e dm i c r o p h e r e s w e r es t a b l ei na c i d i ca n da l k a l i n es o l u t i o nw h i l et h el i g a n dl e a k a g ew a sv e r yl o w 3 t h ed y e i m m o b i l i z e dp ( g m a - e d m a ) b e a d sw e r es l u r r yp a c k e di n t os t a i n l e s s s t e e lc o l u m n t h ea f f i n i t yc o l u m n sw e r ei n v e s t i g a t e di nc o l u m ne f f i c i e n c y ，s e l e c t i v i t y s t a b l i l i t y , c o l u m np r e s s u r e ，p r o t e i nl o a d i n gc a p a c i t y a n dr e c o v e r y e t a 1 ，u s i n g v i 浙江太学硕士学位论文 l y s o z y m ea ss t a n d a r dp r o t e i n o nt h ep bm x - r p ( g m a e d m a ) c o l u m n ( 1 0 o 4 6 c mi d ) ，l y s o z y m ew a sw e l l e l u t e dw i t hm o b i l ep h a s ew h i c hc o n t a i n i n g1 o m o l l n a c l ，1 5 e t h y l e n ea l c o h o li n 0 0 5m o l lt r i s h c lb u f f c r ( p h 7 8 1 ，f l o wa t0 5 m l m i n t h ec o l u m nh a sl o wc o l u m n b a c k p r e s s u r e ，g o o ds t a b i l i t y , h i 曲p r o t e i nm a s sr e c o v e r y ，a n dw a sf a c t u a lu s e df o rt h e p u r i f i c a t i o no fl y s o z y m ef r o me g gw h i t e o nt h ec bf 3 g a p ( g m a - e d m a ) c o l u m n ( 2 5 0 4 6 c mi d ) ，p r o t e i n s o f l y s o z y m ea n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w e r ew e l ls e p a r a t e da n dt h el y s o z y m e m a s sd y n a m i cl o a d i n gc a p a c i t yo fi tw a s4 5 3 m g m 1 i nf a c t u a lu s i n g , t h er e s i nw a s u s e df o r t h ep u r i f i c a t i o no fl y s o z y m ef r o me g gw h i t ea n dt h es e p a r a t i o n o f g l u c o p r o t e i na b s t r a c t e df r o mr a p ep o l l e n k e yw o r d s ：p ( g m a - e d m a ) m i c r o s p h e r e ，s i n g l e - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o n m e t h o d ，t r i a s i n ed y e s ，l y s o z y m e ，c a t a l a s e ，e g gw h i t e ，h i g hp r e s s u r e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( h p a c ) v i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：关翟羔 签字日期：工口d 年3 月8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝 江盘茔有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：累仁撩、导师签名 签字日期：2 - 一6 年3 月 g 日签字日期：乃- 6 年多月扩日 学位论文作者毕业后去向：南昌太学 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 浙住太雪罐t 季幢话盘 第一章文献综述 1 1 亲和色谱简介 1 1 1 蛋白分离 蛋白质的分离纯化是一项十分复杂的高技术工作，同时分离纯化的方法也很 多【1 l ，对于不同的目标产物，分离纯化的方法不同。选择合适的路线，取决于 目标产物的理化、生物特性。例如，目标产物和杂质的密度不一样，可采用离心 技术加以分离；目标产物和杂质在一定的溶液环境中溶解度不同，可采用沉淀技 术加以分离；目标产物和杂质在亲水性高分子两相溶液中分配不同。可采用双水 相萃取技术加以分离；若目标产物和杂质等电点不同，可采用离子交换层析和电 泳技术分离 2 。通常，为获得高纯度目标产物，往往需要综合利用目标产物的 理化特性，采用多种分离技术组合。 在众多的蛋白质分离纯化技术中，色谱是- f 关键的技术，它通常在分离工 序的后部，决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比。色谱技术具有以下 特点。 1 ) 分离效率高。离心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取粗产品，而 运用色谱技术，可得到纯度较高的生物产品 3 。2 ) 和电泳分离相比。色谱过程 易于放大，易于自动化。若采用电泳技术分离蛋白质，虽然产品纯度非常高，但其 过程却产生大量的热，不但有损于蛋白质的生物活性，而且过程难于放大。色谱过 程并不产生明显的热量，放大可采用加大柱径和高度的方法。3 ) 色谱技术适用性 广。差不多每一种蛋白质纯化过程都包括色谱技术，或者是离子交换色谱，或者是 分子筛色谱，或者是几种色谱技术的组合。针对蛋白质不同的生物特性，采用不同 的色谱技术，可获得纯度很高的蛋白质产品。在蛋白质分离纯化方法中。色谱技 术占有重要地位。 色谱分离原理是基于固定相对流动相中各组份阻滞能力的大小，各种色谱方 法，其阻滞机理不同。根据固定相对流动相组份阻滞机理的不同，色谱可分为分 子筛色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、反相作用色谱、亲和色谱等 4 ，详 见表l 。 并 i 太荤硪士雪幢艳盘 表1常用色谱及其特征 1 1 2 亲和色谱 亲和色谱是6 0 年代发展起来的一种高效、快速蛋白质分离纯化技术。通常 的色谱方法都是利用蛋白质理化性质的差异来进行分离的，这种差异往往并不是 很大，所以分离精度不高。亲和色谱则利用蛋白质分子与某一分子专一可逆结合 的生物特性，来选择分离目标蛋白质。亲和色谱容量大，分离效率高，且对目标产 物的生物活性起到一定的保护作用。 亲和色谱的技术基础是某些生物活性物质之间具有可逆又专一性的相互作 用。它也属于吸附色谱，但它的吸附作用主要是靠生物分子对它的互补结合体的 生物识别能力，这种专一性是由生物活性分子中的相关作用基团的化学结构和空 间排布所决定的 5 ，在结合过程中涉及到疏水力，静电力，范德华力以及空间 构型的影响。 在亲和色谱中，与流动相中的目标物发生特异性相互作用的基团称为配基 ( l i g a n d ) 。配基一般采用共价耦联的方法结合到载体基质( m a t r i x ) 上，基质 通常为有机聚合物或膜，有时需要引入间隔臂，制成亲和色谱固定相，用于上柱 操作。分析操作时，含有目标物的稀溶液流过色谱柱，目标物由于与固定相上配 基发生亲和力作用被吸附下来，而杂质由于不具有亲和能力而直接流出柱外。然 后，通过改变淋洗液条件，比如p h ，离子强度，温度，或加入特殊溶剂等，改变 或破坏目标物与配基之间的作用力使目标物得以洗脱，从而达到分离或纯化的目 的。操作过程示意图如图1 1 所示 6 。 2 辨江土季辟t 擘但话t h ”b 喇 目州 鲁卜一卜。 p i n e a l p 由一- 出科懈 t m i r i 喇t , n m o o 札m 目州 图1 1 亲和色谱操作过程示意图 p r o 啦i d h t o a d 1 1 3 亲和色谱的应用与发展 亲和色谱是吸附色谱的最新发展。1 9 1 0 年s t a r k e n s t e i n 报导了淀粉酶在不可 溶性淀粉上的选择性吸附，这是亲和层析的最初应用用。但亲和层析作为一种 专门的分离技术，则应该是从c u a t r e c a s a s 等人于1 9 6 8 年第一次提出“亲和层析” 概念之后开始，他在配基和载体之间引入间隔臂，成功的解决了目标物和载体之 间的空间位阻效应【8 1 。 亲和色谱的研究和发展主要围绕三大部分内容：基质，配基以及亲和色谱分 离机理。关于生物大分子在亲和色谱中的保留机制中，传统的观念认为亲和色谱 实际上是一种只能起组分分离作用的选择性过滤法，这种看法不仅不能定量描述 色谱过程，而且也解决不了多元组分分离问题。亲和色谱法机制的探索归根到底 都有赖于固定相上的配基和目标分子之间的作用。早期的亲和色谱理论中的配基 一配体亲和作用的研究都是建立在均相反应和宏观平衡态热力学的基础上。实际 上，亲和色谱中涉及到的亲和作用都是非均相反应，并且常常是多元体系；另外， 生物大分子的空间取向及运动方式也对亲和作用有重要影响【9 ，1 0 】。 近几十年中，随着合适的载体基质和新配基的深入的研究，亲和色谱的应用 领域不断扩展。多种功能分子，包括酶，辅酶，抗体，氨基酸，多肽，核苷酸， 金属离子，染料等，都可以作为亲和色谱填料的配基。由配基的不同，亲和色谱 又可以分为生物专一性亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯和亲和色谱，染料亲和 色谱等越来越多的亲和色谱相关技术【1 1 】，详见图1 2 。调查表明，亲和色谱在生 物物质分离上的应用程度位居第二，仅次于离子交换法 1 2 1 ；关于生物物质纯化 的论文，6 0 涉及到亲和色谱及其相关技术，它正在逐渐取代传统的分离技术 0 口 e 9 + 口 孰纵豺纱 钎任土擘硪士雪侄话盘 【1 3 。 图1 2 亲和色谱相关技术 亲和色谱的应用广泛，既能用于简单分子的分离，又可应用于功能的生物分 子复合体及细胞的分离，例如血液学界普遍采用的分离造血干细胞的磁性亲和细 胞分选系统( m a c s ) 实质上也是亲和色谱法的演变【1 4 】。它既能用于许多微量 生物活性物质的分析中，例如应用于探针亲和质谱( p a m s ) 【1 5 1 ，又可用于大 规模的工业生产。随着亲和色谱技术的进一步发展，这种独特的分离技术在未来 蛋白质分离纯化中必将发挥出更加重要的作用。 1 2 染料亲和色谱 1 2 1 亲和配基 亲和色谱作为一种高效简便的分离技术，其关键因素之一就是亲和配基的选 4 韵任太晕踊t 雪佳话点 择。亲和配基按亲和力的大小可分为两类，一类即高亲和力亲和配基 ( h i g h a f f i n i t yl i g a n d s ) ，其结合强度而值为1 0 一1 0 1 5 ，如生物素、激素、抗 原等。另一类即组特异性亲和配基( g r o u p - s p e c i f i cl i g a n d s ) 或一般亲和力配基 ( g e n e r a l a f f i n i t yl i g a n d s ) ，尼值为1 0 。1 0 。亲和力越高，尼值越小，如 值小于1 0 1 ，则生产中需要的洗脱条件就非常苛刻，如单克隆抗体。尼如大于 1 0 。，则目标分子不能停留在色谱柱上，无法与杂质分开 1 6 。亲和配基的最佳 尼值为1 0 1 1 0 1 ，当局值位于此范围时，亲和配基与蛋白质分子的作用比较适 中，组特异性亲和配基由于分子较小、容量高、成本低，因而其实用性越来越受 到重视。常用的组特异性亲和配基有天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素 和螯合金属离子等。 天然配基包括碳水化合物结合配基和蛋白类配基。自然界糖缀合物包括糖、 多糖、糖脂、核苷和核苷酸、蛋白聚糖、糖蛋白、酶、抗体、受体、激素等形式， 其分子中都存在碳水化合物成分。植物凝集素和硼酸盐对目标分子中碳水化合物 有亲和力，因而可用于亲和纯化。如伴刀豆蛋白a ，由于可与a d 甘露糖和a d 葡萄糖残基结合，己被成功用于半乳糖转移酶同工酶、牛乳糖蛋白等的分离。此 外，单糖也可用于作亲和配基，固定于环氧琼脂糖的乳糖已成功用于相思子种子 中毒素和凝集素的分离 1 7 1 。蛋白a 和蛋白g 分别为金黄色葡萄球菌和g 群链 球菌细胞壁蛋白，蛋白a 和蛋白g 在中性p h 与免疫球蛋白牢固结合，在低p h 缓冲液中解离。s c h u l e r 等【1 8 】应用蛋白a 从杂交瘤上清液中纯化出鼠i g g l 单抗， c o l e m a n 等 1 9 1 报道了一种新的交联多孔疏水反应性支持物，其流通性及柱床稳 定性高，可用于直接固定蛋白a 。 反义肽可以作为正链编码的肽或蛋白的亲和配基。通过反义肽亲和色谱已分 离纯化出哺乳动物细胞表达的重组人干扰素【2 0 l 。针对靶酶特异识别序列的数个 氨基酸、合成的多聚氨基酸以及寡聚肽已广泛应用于蛋白质分离。多肽的抗体也 可用做亲和配基，如环寡肽杆菌肽可用于分离纯化多种蛋白酶。 核苷酸及核苷酸辅酶已成功用于一些酶的分离纯化。i n o u e 等【2 1 】利用在同 一核苷酸吸附剂上的果糖6 _ 磷酸2 激酶从果蝇中纯化出膜相关的二酰甘油激 酶。e g i 等【2 2 】利用固定化的一磷酸硫胺素从人血液中纯化出硫胺素焦磷酸激酶 和腺苷酸激酶。 舛任五擘蘑t 擘传话主 金属螯合亲和色谱基于特定的氨基酸( 如组氨酸、色氨酸或半胱氨酸) 能与固 定螯合剂上金属离子的作用，改变螫合金属离子的种类可改变蛋白质和吸附剂之 间的作用强度，通常c u “的结合能力较强，螫合的c u 2 + 亲和色谱己成功用于分 离纯化细胞生长素 2 3 1 。金属螯合亲和色谱中最常用的螫合剂为亚氨基二乙酸 ( i d a ) ，其它还有三( 羧甲基) 乙二胺、次氮基三乙酸、& 羟基喹啉等。常用的金属 离子包括c u 2 + 、z n 2 + 、n i “、c 0 2 + 、f e 2 + 等。 1 2 2 染料亲和配基 染料亲和配基可能是最具有应用前景的一类组特异性亲和配基，可用于蛋白 质的大规模分离纯化。染料配基通过模拟底物、辅助因子或结合因子与蛋白及酶 的活性位点作用。由于天然生物配基制备与提纯困难，价格较贵种类有限，且 在固载与层析过程中易生物降解，失活。而染料配基价格低廉，易于合成，能通 过共价键牢固的结合到亲和载体上，与蛋白质的结合容量高，化学性质稳定，不 易为生物降解。其经济性，安全性，稳定性，高吸附容量及固定的简易性等优点 使其越来越多的取代天然生物配基，成为最具应用前景的一类亲和配基。 应用于亲和色谱中的染料配基主要是染纺上所用的一些活性染料。这些活性 染料一般由一个载色体( 如偶氮分子或葸醌分子等) 连接一个活性基团( 如单氯或 双氯三嗪环等) 组成，可称为染料母体和染料活性基，它们通常通过联接基相联， 也可以直接相联。在母体染料中一般具有l 3 个磺酸基作为水溶性基团，有些 活性基本身也具有磺酸基或硫酸酯基作为水溶性基团。这些染料分子有些同时还 带有羧基，氨基，或金属螫合等基团，有助于提高染料分子的亲水性能。活性染 料通常可分为：三嗪型活性染料( a ) ，卤代嘧啶活性基类( b ) ，乙烯砜活性基类( c ) ， 其它活性基类( 例如膦酸基型( d ) ，a 一卤代丙烯酰胺型) 和双活性基型活性染料 和等，见图1 3 。 6 舒任太季磺士晕佳话点 。一纣一节7 n t - - c i ”夕“ j c l ( 1 ) 一。一。鼢。 。卜卜 ( c ) ( d ) 图1 3 活性染料 三嗪染料是使用最广泛的一类活性染料，它又可分为一氯三嗪型，二氯三嗪 型，一氟三嚷型等，详见图1 4 。三聚氰氯( 1 4 a ) 是这类染料的基本单元结构。 三聚氰氯上的碳原子由于周围强电负性的氮原子的存在而非常容易受亲核试剂 的进攻，因此亲核性的载色体分子很容易进攻其中的碳原子，由此可衍变生成双 氯三嗪染料( 1 4 b ) 和单氯三嗪染料( 1 4 c ) 。两个双氯三嗪染料可以通过一个双官 能团相连成一个双三嗪环基团的染料分子( 1 4 d ) 。还有一些其它类型的三嗪染 料【6 】。 a y a n a 飞n 户 “u 。石= 高 a 。y ”、一 ” a r 交 咖量h 2 c h 棚瞒 图1 4 三嗪染料 ( a ) 三聚氰氯：( b ) p r o c i o nm x ( i c i ) ；( c ) c i b a c r o n ( c i b a g e i g y ) 和p r o c i o nh ( i c i ) 初j 染料： ( d ) p r o c i o nh e ( i c i ) ；( e ) 单氟三嗪染料( c i b a - g e i g y ；( o 三氯嘧染料( s a n d o z ) ( g ) 二氟单 7 a吣of 一一 磷 枷p。 露 露 斜任土晕辱t 擘佳话盘 氯嘧啶染料( s a n d o z ) = ( h ) r e m a z o l 系列染料( h o e c h s t ) 。 其中，r e m a z o l 系列染料虽然没有三嗪环，但也被证明对蛋白具有亲和作用。 1 2 3 染料亲和原理及运用与发展 染料配基与蛋白的作用机理是非常复杂的。通常可归结为以下两点：一为染 料分子模仿天然生物配基( 如n a d h ，n a d p h ，n a d + ，n m ) p + ，p , t p ，g t p 等) 的形状、芳 香性及电荷分配等，在这些作用位置上与蛋白质形成竞争性吸附；二为染料分子 与蛋白质之间存在静电作用、疏水作用、氢键及电荷转移作用等非特异性吸附。 当染料与蛋白主要以特异性作用结合时，吸附作用强，需要用天然配基进行沈脱； 当染料与蛋白主要以强的非特异性作用结合时不需要用亲和配基进行洗脱。例 如，蛋白都可以与c b ( c i b a c r o nb l u ef 3 g a ) 发生非特异性结合。c b 染料分 子中存在蒽醌或苯环部分可以与蛋白分子表面发生疏水作用，其分子上又带有磺 酸基团，具有阳离子交换作用，能与蛋白质分子表面的精氨酸发生静电作用。当 疏水作用起主导作用时，可用降低盐浓度，改变p h 及用有机溶剂( 如乙二醇等) 使蛋白洗脱；当离子交换起主导作用时，可在低p h 下使蛋白吸附，高p h 下使 蛋白洗脱。根据非特异性作用机理，一般改变p h 或离子强度就可以达到洗脱的 目的。 染料配基亲和色谱的发展始于七十年代初期，人们偶然发现很多蛋白质在蓝 色葡聚糖色谱柱上的性能有明显的差异【2 4 】，推测是因为蛋白与染料发生了类似 于生物大分子与其相应生物配基之间的亲和作用。之后的研究表明某些活性染料 与载体共价结合后能够分离纯化许多蛋白质。于是，以染料作为配基的染料亲和 色谱很快被人们所认识并得到了广泛的应用。在染料配基的基础上，针对其选择 性较差的问题，人们又在染料其原有结构上定向改造使其更接近于天然生物配 基，增强其对目标蛋白的亲和性，于是仿生染料又成为染料亲和色谱的一个新应 用。 s m a l l 2 5 将p r o c i o nb l u em x - r 键合到制备级硅胶上，应用于大规模纯化 l d h ( l - 乳酸脱氢酶) ，还利用b l u es e p h a r o s ec l - 6 b 从厌氧极端嗜热菌中分离 出n a p d + 偶联的乙醇脱氢酶另外，还有利用c i b a c r o nb l u ef 3 g a 和p r o c i o n y e l l o wm x 4 g 从鼠肌肉中分离纯化出l d h 及丙酮酸激素的报道【2 6 】。 8 街住上晕硪士擘r 圣话土 k a t s o s 等 2 7 人研究了链霉菌谷氨酸氧化酶( g o x ) 与三种染料蒽醌仿生 染料b m i ，三嗪染料p r o c i o uy e l l o w , t u r q u o i s em x g 之间的亲和作用，从分子模型、 动力学、吸附平衡和亲和色谱分析等方面进行了研究，建立了能够保持高活性和 高回收率的g o x 分离纯化的基本模型。 a r i e a 等【2 8 ，2 9 1 研究了溶菌酶在结合了p r o c i o ng r e e nh e - 4 b d ，r e a c t i v e g r e e n1 9 染料膜上的吸附情况，并利用这种染料亲和膜来分离纯化溶菌酶，得 到良好的吸附容量和分离结果。 d e n i z l i 3 0 等研究了葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶在c i b a c r o nb l u ef 3 g a 结合 的大孔聚酰胺中空纤维上的吸附作用，其最大吸附量分别可达2 4 8 o m g g 和 1 3 2 0 m g g , 洗脱率可达9 3 ，两种酶能在此亲和色谱上得到很好分离，且都能 在洗脱后保持活性。 k o c k 等1 3 1 】对丝氨酸蛋白酶( 包括c 2 ，促凝血酶原激酶，胰岛素，糜蛋白 酶，3 蛋白酶等) 在三嗪染料c i b a c r o nb l u ef 3 g a 为配基的交联琼脂糖亲和色 谱上的结合情况进行了研究，发现其中只有胰岛素家族丝氨酸蛋白酶的结合能 用苯甲脒洗脱。 r u c k e n s t e i n 等 3 2 1 $ j j 备了c i b a c r o nb l u ef 3 g 八p r o c i o nr e dh e 3 b 和p r o c i o n b l u em x r 三种染料结合的大孔壳聚糖膜，并用人血清和牛血清作为标准蛋白 对其吸附能力作了比较。实验得出c i b a c r o nb l u ef 3 g a 染料结合的壳聚糖膜比 其它两种膜对蛋白的吸附能力都要强很多，用其可从人血浆中分离出高纯化的 人血清蛋白。 c l o n i s 等1 3 3 在c i b a c r o nb l u ef 3 g a 和v i l m a f l xb l u ea - r 的基础上模仿l 乳酸脱氢酶的底物和抑制剂的结构合成相应的仿生染料，将其固定到交联琼脂 糖u l t r o g e la 6 r 上做成仿生染料亲和色谱。应用于从牛心粗提取物中分离l 乳 酸脱氢酶，研究表明改进后的仿生染料要比相应的原染料有更高的纯化能力。 至此，染料亲和色谱成为分离纯化蛋白质的一种有力工具。 1 3 亲和色谱填料 1 3 1 蛋白分离色谱填料 在过去的几十年中，人们不断尝试引入新填料以完善蛋白质分离。多种基质 9 拜住太擘壕t 亏他话土 材料，包括有机和无机聚合物，被用作色谱填料。蛋白质的吸附和解吸取决于粒 问溶质分子的对流迁移，分子从溶液中向颗粒外表面扩散，在多孔结构间的扩散， 以及在表面活性部分的吸附。通过改变洗脱条件，吸附应是可逆的，根据蛋白质 的结合特性和具体用途，可以调整参数使分离最优化。尽管色谱参数可以根据蛋 白质分离的具体情况进行优化，但色谱介质存在一些通用标准：首先，材料必须 具备化学，物理稳定性和良好的机械性能以满足高流速条件；其次，材料中应不 含与蛋白质发生非特异性结合的基团，但易产生衍生物以便引入功能基用于交互 作用色谱；再次，材料必须对洗涤条件具有一定的耐受性；最后，材料颗粒大小 和孔径分布在生产过程中应能控制，且产品重复性良好 3 4 1 。 基体材料对填料的机械，化学和热稳定性起决定性作用。根据化学组成可将 载体材料分为无机聚合物，有机聚合物和复合材料几类。无机聚合物氧化硅是应 用最广泛的色谱填科，已有多种粒度和孔径的产品，其最大的缺陷就是在强碱或 强酸条件下会溶解。由于氧化硅的化学不稳定性，许多金属氧化物如氧化铝，氧 化钛等先后被重视【3 5 】。 有机聚合物材料比较多，包括天然多糖，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯 高聚物等。最先受到人们关注有机聚合物是天然多糖，包括琼脂糖，纤维素，交 联葡聚糖，交联直链淀粉和淀粉，还有之后的壳聚糖等。它们的优点是能在很宽 的p h 范围内稳定，主要缺点是机械性能差，承受压力有限。近来也有通过化学 交联法改善多糖的机械稳定性。聚丙烯酰胺类材料，其交联度影响着基体的刚性 和渗透性，能在酸性介质中稳定，但在p h 高于1 0 时迅速水解成聚丙烯酸。聚 丙烯酸酯类材料，使用大量交联单体时，颗粒刚性大，有被直接用于蛋白质体积 排阻色谱和疏水交互作用色谱的应用。大多数聚乙烯高聚物是苯乙烯一二乙烯苯 共聚物，能制备出高交联度，耐高压的刚性聚合物微球，有被用于渗透色谱填料 【3 6 1 。刚性聚苯乙烯微球有结构稳定和在整个p h 范围内性质稳定的优点，但其 基体的强疏水性限制了其在生物色谱方面的应用，可通过对其表面进行修饰以增 加其极性【3 7 】，也可通过改换单体增加其亲水性能。 其它类型，不同组成的聚合物也被越来越多的研究和应用。为了克服基体材 料的化学不稳定等缺点，将刚性载体与具有生物相容性和化学稳定性的组分作为 固定相结合成复合材料，并从材料结构特征方面改善其色谱性能。通常有化学修 1 0 拜f i 上学辱士雪佳话土 饰、物理吸附表面键合、多孔基复合材料和复合载体等类型的复合材料。 1 3 2 亲和色谱填料基质 亲和色谱的两个关键问题是能否找到合适的基质和能否使适当的配基与基 质高效的结合。作为蛋白分离用亲和色谱所用基质，必须具备蛋白分离色谱填料 基质的一些通用标准，如前1 3 1 所述，另外还必须符合一些亲和色谱本身的要 求。基质的物理性质主要包括粒径，形状，孔径，表面积和机械强度等。一般认 为，亲和色谱基质适合的粒径范围在1 _ 2 0 0 微米，粒径分布越均匀越能提高 柱效，一般要求达到9 5 以上的均一度【3 8 】。基质的最佳形状为球形，载体的孔 径尺寸一般应为蛋白质直径的5 倍以上。孔径太大会使比表面积降低，也不利于 色谱分离。机械强度主要要求载体具有一定的刚性以满足高压操作，大规模生产 和基质重复利用。基质必须具有亲水性，化学稳定性，可修饰性，和生物惰性等 特性。要求基质能够在广泛的p h 、温度、离子强度以及有机溶剂中使用。理想 的基质材料应该是非特异性低，无疏水作用位点，连接容量低，能耗小，能很好 的回收并具有良好的重复使用性。 染料亲和色谱填料的基质必须具备以下性质。首先，基质表面必须具有一些 可衍生化，连接染料的功能基，比如羟基，羧基，氨基等。其次，基质应该是多 孔的，用于接联上足够的染料配基，因而能够对目标物有高吸附能力。这并不是 说接的染料配基量越多就会有越高的吸附量，另外还会受到孔径的影响，一般会 存在一个最佳的配基比例。再次，基质材料还必须具备亲和色谱填料基质的一般 要求，比如亲水性，化学物理性稳定等。 1 3 3 亲和配基的耦联 配基固定到基质上通常会有几个中间步骤，必须要结合考虑基质和配基的性 质。首先，要注意到有些配基会在固定化过程中失去其活性或功能性，因此配基 的连接位置必须是在非活性区域，以保证配基能够和目标物完美结合；其次，因 为生物物质的活性点一般都在三维结构里面，因而在配基与目标物作用中会有空 间阻碍。这时就需要用到白j 隔臂，通常为烷基链，还有一些是亲水臂，比如含羟 1 1 拜任_ 之雪赣士季幢话主 基，氨基，另外还有一些用大分子作为间隔分子的。常见的有溴化氰，环氧氯丙 烷，己二胺，乙二胺等。 配基的耦联有两种方式，一为基质先连接间隔臂再连接配基( a ) ，二为配基 先与间隔臂连接后再与基质相连( b ) ，可用如图1 5 1 6 1 表示 藿壹 _ 多錾。 图1 5 亲和配基的耦联 1 4 聚合物微球的制备 1 a 1 聚合物微球 单分散聚合物微球具有球形好，尺寸小，比表面积大，吸附性能强和功能 基在表面富集，表面反应能力强的特异性质。作为功能性材料，单分散聚合物微 球的反应不仅深入到日常生活的方方面面，而且近几十年来，已经进入到高尖端 技术领域。单分散聚合物微球的制备和应用技术越来越受到关注。 1 9 5 5 年美国里海大学乳液聚合物研究所的v 卸d e n o f f 和b r m f o r d 教授【3 9 】 发表了关于成功合成单分散聚合物微球的论文，为高分子科学开辟了一个新的研 究领域。目前，单分散微米级具有不同聚合物分子量，不同颗粒形态和表面特征 的聚合物微球已成为国内外学者致力于研究的一个热点，并获得了引人注目的发 展。近年来更有在聚合物微球基础上发展起来的各种功能性微球研制成功和广泛 应用。例如以高分子微球为核，磁性物质附在表面制成的磁性微球在化工( 如催 化) 和医疗诊断( 如磁共振成像的对比剂等) 中有着相当重要的应用价值【4 0 】。 弘卜卜卜 街f ij 巳幸奄t 晕任话盘 以聚苯乙烯粒子为种子，通过乳液聚合或微波辐射无皂乳液聚合在其表面引入聚 ( n 异丙基丙烯酰胺) 热敏性壳层，制得的核一壳结构热敏性微球，在免疫分析 【4 1 1 ，生物医学1 4 2 ，催化等领域都有广泛的应用。源于免疫学的分子印迹的聚 合物微球在色谱分析和电泳分离系统1 4 3 ，生物传感器 4 4 1 ，酶模拟1 4 5 1 ，固相萃 取1 4 6 方面有着广泛的应用。 单分散聚合物微球目前在美国，英国，日本等国家都己经有多种牌号的商品 生产它们在许多领域有着如下几个方面的应用1 4 7 1 。1 ) 单分散聚合物微球可 作为标准计量的基准物，可用作电镜，光学显微镜及粒径测定仪的标准粒子，可 用于胶体体系和聚合物乳液研究以及半透膜孔径的测定。还可以在电子工业检测 仪器中作标准物质。2 ) 聚合物微球在医学和生物化学领域中应用日益广泛，它 可用于临床检验，药物释放，癌症和肝炎的诊断，细胞的标记、识别、分离和培 养，放射免疫固相载体及免疫吸收等方面1 4 8 1 。3 ) 在分析化学中可以作高效液 相色谱填料，适当粒径的单分散微球可大大提高分离效果及检测精确度，并可改 善流动性，显著的提高柱效。如果对聚合物微球表面进行修饰，比如根据酶一底 物，抗原一抗体，激素一受体问的特异性作用原理，将一方固载到微球的表面， 则可得到高选择性的亲和色谱填料，这在分离纯化生物体成分方面有着重要的应 用价值。4 ) 在化学工业中大粒径、单分散并具有多孔结构的聚合物微球可用作 催化剂载体，其催化活性高，副作用少，反复利用率和选择性高，并且催化剂易 于回收。这种聚合物微球还可以用作高效离子交换树脂。5 ) 可作液晶片之间的 问隙保持剂，将其施加在晶片之间，可准确控制和保持间距，这样可以大大提高 液晶显示的清晰度。6 ) 单分散大粒径微球还可以用作高档涂料和油墨添加剂， 能显著提高其遮盖力，可用