（细胞生物学专业论文）拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证.pdf

摘要 在植物中，我们实验室和其他实验室的研究结果表明，钙调索( c a l m o d u li n ， c a m ) ，这一类传统上被认为细胞内重要的c a 2 + 传感蛋白，在细胞外也是广泛存在 的，并且发挥着非常重要的生物学功能。根据这些实验结果，我们实验室提出了 细胞外钙调素可能是种檬物多肽信使酶观点，并且建立了纲胞外钙调素信号转 导机制的假设模型。依据该模型，细胞处钙调素与存在于细胞外或质膜上的受体 结合，进而激活下游信号通路，最终调节植物的生理功能及基因表达。最近，c u i 等人利用3 5 s 标记c a m 的方法，证明了拟南芥悬浮培养细胞和原生质体表面存在 着细胞外c a m 受体样结合蛋白。但是，细胞质膜上与钙调素结合的蛋白是什么， 我们并不清楚，为此，我们进行了以下的实验来研究拟南芥细胞膜上和钙调素结 合的蛋自质。 我室前期工作首先提取了拟涛芥悬浮培养细胞的微粒体膜蛋自，其次利用钙 调素亲和层析及质谱分析，从抽提蛋自中，纯化鉴定褥到了3 5 种蛋自，并且通 过生物信息学分析的方法，对这些蛋白质的性质进行了简单的描述，然后瞬时转 化洋葱表皮细胞，荧光显微镜观察表明，其中有5 种蛋白质在质膜有明显的分布。 但是，这些蛋白质在植物体内是否和钙调素结合，还需要通过其他实验手段 来迸一步证明。为此本实验首先利用酵母双杂交和荧光共振能量转移的技术对这 些候选蛋盘和钙调素的相互作用进行了进一步的验证。酵母双杂交结果表明，4 个候选蛋白质p c a m b p i 、p c a 蠹i b p 2 、p c a m b p 3 、p c 酬b p _ 哇都可以和钙调素发生耀 互作用。但是采用洋葱表皮细胞瞬时共表达系统，荧光共振能量转移分析，只证 实其中的p c a m b p 4 可以和钙调素结合。 另外，本实验还对一些拟南芥t - d n a 插入突变体进行了d n a 水平的初步筛选。 关键字：拟南芥细胞膜钙调素钙调素结合蛋自 a b s t r a c t i np l a n ts y s t e m s ，as e r i e so fw o r ki no u ra n do t h e rl a b o r a t o r y sh a sp r o v i d e d e v i d e n c e st h a tc a l m o d u l i n ( c a m ) ，w d l - k n o w na sa ni n t r a c d l u l a rc a l c i u ms e n s o r , h a s a l s ob e e nf o u n de x t r a c e l l u l a r l ya n dp l a ys e v e r a li m p o r t a n tb i o l o g i c a lr o l e s b a s e do i l t h e s ed a t a , o u rl a b o r a t o r ys u g g e s t e dt h a te x t r a c e l l u l a rc a mm i g h ta c ta sap o l y p e p t i d e s i g n a la n dt h e r ew a sap o s s i b l et r a n s m e m b r a n es i g n a l i n gm e c h a n i s m i nt h i sm o d e l ， t h ee x t r a c e l l u l a rc 曲娃b i n d st oi t sr e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) i ne e l lm e m b r a n ea n dt h e n t h e r e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) a c t i v a t e s d o w n s t r e a ms i g n a lp a t h w a yt o r e g u l a t e p h y s i o l o g i c a lr e a c t i o n sa sw e l la sg e n ee x p r e s s i o n c u ie ta f i r s t l yr e p o r t e dt h e p r e s e n c eo fa p o p l a s t i cc a mr e c e p t o r - l i k eb i n d i n gp r o t e i n so nt h ec e l l s u r f a c eo f a r a b i d o p s i ss u s p e n s i o n - c u l t u r e dc e l l s 。h o w e v e r , w eh a v e n o ti n d e n t i f i e dt h e c a n d i d a t er e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) o nc e l ls u r f a c ef o ra p o p l a s tc a m s ow ec o n d u c t e d t h ee x p e r i m e n t sb e l o wt os t u d yt h ec a m - b i n d i n gp r o t e o m i c si na r a b i d o p s i sc e l l m e m b r a n e s w ep r e v i o u s l yp u r i f i e dt h em i c r o s o m ef r a c t i o n so fa r a b i d o p s i s s u s p e n s i o n c u l t u r e dc e l l s ，a n d t h ep r o t e i n sp u r i f i e df r o mc a ma f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yw e r ei d e n t i f i e db yl c m s m so rm a l d i - t o f - m s t h e c h a r a c t e r i z a t i o no ft h et o t a l3 5m a t c h e dp r o t e i n sw a sa n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c p r e d i c t i o n u n d e rl a s e rc o n f o e a lm i c r o s c o p y , f i v ep r o t e i n ss p e c i f i c a l l yo rm o s t l y l o c a t ei no n i o ne p i d e r m a lc e l lp l a s m am e m b r a n eb yt r a n s i e n te x p r e s s i o n a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s ep r o t e i n sa n dc a m nv v on e e dt ob ef u r t h e r c o n f i r m e d 晰mo t h e rm e t h o d s m a t i n g - b a s e ds p l i tu b i q u i t i ns y s t e m ( m b s u s ) a n d f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) w e r eu s e dt oi d e n t i f yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc a ma n di t sp u t a t i v eb i n d i n gp r o t e i n s u s i n gm b s u ss y s t e m , f o u rp r o t e i n s ( p c a m b p1 ，p c a m b p 2 ，p c a m b p 3 ，p c a m b p 4 ) c o u l di n t e r a c tw i t h c a m b u to n l yp c a m b p 4c o u l di n t e r a c tw i t hc a mi nt r a n s i e n tc o e x p r e s s i o no n i o n e p i d n a lc e l lb yf r e ta s s a y i nt h i sp a p e r , o l l et - d n ai n s e r t i o nm u t a n tw a si d e n t i f i e d 。i nd n al e v e l 。 i d e n t i f i c a t i o no fo t h e ri n s e r t i o nm u t a n t sw a so ng o i n g k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a c e i lm e m b r a n ec a mc a m b p s v 缩写表 a t c a m 3 ：a r a b i d o p s i s t h a l i a n ac a l m o d u l i ni s o f o r m3 b i f c ：b i m o l e e u l a rf l u o r e s c e n c ec o m p l e m e n t a t i o n c a m ：c a l m o d u l i n c a m 2 ：a r a b i d o p s i st h a l i a n ac a l m o d u l i ni s o f o r m2 c a m b d ：c a l m o d u l i nb i n d i n gd o m a i n c a m b p s ：c a l m o d u l i nb i n d i n gp r o t e i n s c f p ：c y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n c n g c ：c y c l i cn u c l e o t i d e - g a t e di o nc h a n n e l e c f p ：e n h a n c ec y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n e g t a ：e t h y l e n eg l y c o l - b i s ( 1 3 - a i m o e t h y l e t h e r ) - n ，n ，n ，n - t e t r a c e t i ca c i d e y f p ：e n h a n c ey e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n f r e t ：f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r l c - m s m s ：l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y 队l d t o f m s ：m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n l o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y m b s u s ：m a t i n g - b a s e ds p l i tu b i q u i t i ns y s t e m m e l ：m e t h i o n i n e o n p g ：o - n i t r o p h e n y lp - d g a l a c t o p y r a n o s i d e o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e p e r ：r e v e r s et r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s c ：s y n t h e t i cc o m p l e t em e d i u m s d ：s y n t h e t i cm i n i m a lm e d i u m s d s - p a g e ：s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s x - g a l ：5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l 一一d g a l a c t o p y r a n o s i d e y f p ：y e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文拟南芥质膜定位的4 个推测的钙调素结合蛋白的分 析验证，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中 已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的 研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者! 签名) ：夕净溜 返年6 月f y 网 指导教师确认( 签名) 弘磁 础年6 月；e i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河= 艺师范大学有权保留并向豳家有关部门或机构 送交学位论文豹复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河j | ：师范大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者! 签名) ：辟玉强 y 留年g 旁f 堋 指剥币( 签名) 声何 p 艿年易月j vf i i 文献综述 。_ l植物细胞膜上钙调素结合蛋白的研究意义 研究结果袭骧，钙离子，在植物对外界的各种生物和非生物刺激的生物反应 中，可以作为第二信使向下游传导信号。各种不同的刺激可以激发细胞内c a 扣 浓度的瞬间变化秘1 ，产生以不同振幅、持续时间、不同频率及空间转导方式为特 征韵钙信号轻辩1 。钙离子捧为一种简单的离子信号分子，是通过c 矿传感鬣自及 其靶蛋盘来实瑷调节各静不蠢熬生物学反应麴。霆j ；i f 已被鉴定c 矛+ 转感蛋白可分 为苏下隧类洚调素及其网工型；钙调素褶钕蛋自秘其他其有辨手型鳇e a 2 + 结合 结构域的e a 2 + 结合蛋自；钙依赖型蛋良激酶和无e f 攀型的c a 抖结合结构域的c a 结合蛋白1 。其中钙调素( c a l m o d u l i n ，c a m ) 是真核细胞内广泛存在的、高度保 守的、最重要的一类钙离子受体蛋白。 植物中的钙调素和动物中的钙调素在结构上和功能上有许多相似的地方，不 丽的是，脊稚动物巾有多种c a r l 基因，毽它稍编码的e 棚蛋鑫具有完全一致豹 氨基酸序列，箍在植物孛发现的多种c a m 基因，它们编码相同或橱似的豢鑫， 并曼不翳的器宦，不同的细飓毒不翳的表现形式，但是这些蛋盎都具有静手型 c a 2 + 结合结构域，都能够与c 酽+ 结合嘲。 c a 2 + 与c a m 的结合，引起c a m 异构体的改变，暴露出疏水区域后与靶蛋白，。 也就是钙调素结合蛋白 枷b p 8 ) ，结合。植物中广义上的钙调素结合蛋白可以分 莠以下三类：第一类是只有在在植物孛特异存在，丽在其德物种中没有同源蛋白， 墨翦发现有2 0 多种。翔与生长素瘴答福关嚣s a u r s ，花耪特巽蛋爵n p g i 等。 第二类是在其他物耱中有窬源蛋蠡，但只是在植物中意会受到c a m 调控的蛋盎 球1 ，比如g a d ，a p y r a s e ，n a d 激酶。第三类是与动物中类似的c a m b p ，如质膜 c a 外- a t p a s e ，c n g c s 等。现在人们普遍认为植物中c a m b p s 参与的生物学反应主 要有以下几种：1 植物发育；2 代谢调节；3 细胞骨架功能；4 激素反应；5 逆 境胁迫反应；6 离子吸收；7 放御反应；8 转录调控等翻粥。 由于c a m b p s 的重要性，弱蓊，对e 矿度醐的信号转导途径的研究主要是集 中在c a m b p s 酶分析与鉴定上。运震生讫弱分子生物学翦手段分离霸鉴定c a m b p s ， 对于理解c a 2 + c a m 信号通路的多样性和重要性具有非常重要的作用。 目前作者了解的已经有文献报道的植物中在细胞膜上有分布的c a m b p s 主要 有以下三类：c a 2 + - a t p a s e ；c n g c ；m l o 蛋自潍。在植物的细胞外也广泛存在着钙 调素，并显可能作为种信使发挥着非常重要的生物学功能雏哦h 3 ，这一点已经被 证实。最近，c u i 等人( 2 0 0 5 ) 利用氅标记c a m ，证明了拟南莽悬浮培养细胞和原 生质体表面存在细胞外c a m 受体样结会蛋自n 封。如果细胞膜上存在和胞外钙调素 结合的蛋白，那么这种蛋白质的胞外域应该存在蓿和钙调素结合的区域，但是上 述三类c a m b p s 的钙调素结合域都存在于蛋白质的胞内域，这样也就是说细胞膜 上还存在不同上述三类钙调素结合蛋臼。研究细胞膜上钙调素结合蛋白，尤其是 胞外具有与钙调素结合的域的钙调素结合蛋自，对于阐明胞外钙调素的跨膜转导 视制具有j 常重要的意义，这也是本实验研究的出发点。 。2 植物中已经报道的质膜上钙调素结合蛋自的种类和生物学功缝 1 。2 。1e a 2 + - a t p a s e 谗多生物学和非生物学的刺激都可以引起钙离子浓度的瞬间变化，然后钙离 子作为第二信使向下游传导信号，但是细胞内过高的钙离子浓度对生物来说是一 种伤害，甚至会导致细胞死亡。细胞质膜和内质网上的钙泵，对终止强而持续的 钙信号，维持细胞内钙的稳态是非常重要的n k 珏1 。 c a a t p a s e ，是细胞质膜上普遍存在的一种高亲和力低容量的钙泵，在维持 生物体细胞质的低钙离子水平中起着非常重要的作用，因秀胞质中微弱的钙离子 浓度的变化就可以激活其酶的活性，把钙离子主动地运到细胞外或细胞器中，使 生物体胞质维持相对比较低的钙离子水平n 4 3 。 根据c + - a t p a s e 的蛋白序列的同源性，可将动物和植物中的c 水a t p a s e 分为 两类：i i a 型和i i b 型。i i a 型包括s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m 型和e r 型 c a 2 + _ a t p a s e 。 植物中i i a 型c a 2 + - a t p a s e 主要分稚在液泡膜，内质网膜和质膜上， 并且其活性不受钙调素的调节疆躬。i i b 型c a 2 * - a t p a s e ，首先在动物细胞中发现 ( c a r a f o l i ，1 9 9 4 ) ，随艨研究者在拟南芥和花椰菜中也克隆到了这一类 c a 打- a t p a s e ，这一类c a 2 + - a t p a s e 的特点是主要分布在质膜上，其活性受钙调素的 调节。但是植物中这类c a 2 + - a t p a s e 与动物中c a 2 + - a t p a s e 有两点不同：一是其钙 调素调节结构域位于n 端，而动物中的钙调素调节结构域位于c 端：二是在分布上， 植物中在质膜上和内膜系统上都有分布，而动物中只分布在质膜上n 引。 2 ua b 1 c a 2 + l n h a u i b t o i l 0 - 毫 c a m 霹 图卜l 动物和植物中c a - a t p a s e 的拓扑结构示意图 f i 9 1 1t o p o l o g ym o d e l so fp u t a t i v ec a 2 + - a t p a s e si np l a n t sa n da n i m a l s ( t o s h i f u m in a g a t a 等，2 0 0 4 ) 至今，许多实验室已经从不同的植物材料中克隆了在细胞质膜上有分布的 c a 2 + a t p a s e s ，并且对其生理作用和生化性质进行了详细的研究。比如说拟南芥 a t a c a 8 是植物中第一个被克隆的质膜c a 2 + a t p a s e s 。b o n z a 等人( 2 0 0 0 ) 利用c a m 亲和层析法从拟南芥悬浮培养细胞质膜中纯化出a t a c a 8 引，该蛋白由1 0 7 4 个 氨基酸组成，具有1 0 个跨膜域和p 型c a 2 _ a t p a s e s 的典型特征：其n 端具有c a m 结合域，自抑制区域存在于n 端，而且与c a m 结合域重叠n 引。c h u n g 等( 2 0 0 0 ) 克 隆的大豆s c a i 编码一个c a 2 + a t p a s e ，定位于质膜上，其n 端具有c a m 调节的自 抑制区n 踟。 1 2 2 离子通道 除c a 2 + - a t p a s e ) b ，植物细胞膜上存在的另一类重要的钙调素结合蛋为环核苷 酸门控性离子通道( c y c l i cn u c l e o t i d e g a t e di o nc h a n n e l ，c n g c ) ，它可作为 某些重金属进入细胞的通道，是一种定位于膜上的非选择性配体阳离子门控通 道n 9 1 。 植物c n g c 离子通道是1 9 9 8 年在筛选大麦钙调素结合转运蛋白( h o r d e u m v u l g a r ec a m 咱i n d i n g t r a n s p o r t e r ，h v c b t l ) 时首次确认的( s c h u u r i n k 等1 9 9 8 ； m o s e r 等2 0 0 1 ) 心们心。目前，人们已经在模式植物拟南芥，水稻中都发现t c n g c 的基因序列的存在，其中拟南芥有2 ( ) 个瞳引，水稻有1 6 个( y u a n 等2 0 0 3 ) 心心3 1 ，另 外，在烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 、菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 等植物中也都发 现了许多c n g c 同源序列心13 ，这样浼i | 月植物c n g c 离子通道基因可能是一个较大的 3 l i _ _ 阱 基因家族引。 植物中的c n g c s 和动物中c n g c s 结构极其相似，都具有6 个跨膜域，不同的是 植物中的c n g c s 的钙调素结合域和环核苷酸结合域重合，位于c 段，而动物中的钙 调素结合域位于n 端( 图2 ) n 引。c a m 、环核苷酸和c a 2 + 可与c n g c 相互发生作用，并 且能以一种整合的形式控制离子通过此种植物离子通道。当c n g c 与环核苷酸结 合被激活后，通道打开，胞外c a 2 + 内流，胞内c a 2 + 的增多，一方面会导致c a 2 + 依 赖蛋白激的激活，进而引起下游靶蛋白的磷酸化；另一方面受c a 抄激活的钙调蛋 白会与c n g c 结合，阻止c n g c 与环核苷酸的结合，通道活性受抑制，从而限制c a 2 + 的进一步内流引。 a 2 + 团鄹 c a m 图1 - 2 动物和植物中c n g c 拓扑结构示意图( c a w ：钙调素结合位点，c n b ：环核苷酸结合位点) f i g l - 2at o p o l o g yo fc y c l i cn u c l e o t i d e - g a t e dc a l c i u mc h a n n e l ( c n g c ) i np l a n ta n da n i m a l ( c a m ：c a l m o d u l i nb i n d i n gs i t e ，c n b ：c y c l i cn u c i e o f i d eb i n d i n gs i t e ) ( t o s h i f u m in a g a t a 等, 2 0 0 4 ) 植物中的c n g c s 是个大家族，数量众多，说明其参与了许多不同的生物功能。 主要有：赤霉素在糊粉发育过程中的信号通路；光敏色素信号转导途径；花粉管 的生长；根的形成：细胞周期的调控等n 引。 1 2 3m l o 蛋白 植物中的m l o 是在病原菌防御反应中发挥着重要的作用的一种蛋白。与m l o 序列有关的基因只在植物中发现，说明m l o 基因是植物特有的。m i o 蛋白是一种定 位在质膜上的蛋白，具有7 个跨膜域，其n 一端位于胞外，存在糖基化位点，c 端位于胞内心叫心刀瞳。m l o 蛋白家族蛋白成员序列的多样性，7 跨膜的拓扑结构以及 在细胞膜上的位置的特点，类似于动物和真菌的7 跨膜的g 蛋白偶联受体出引。 植物中的m l o 蛋白可能是一种c a m 结合蛋白。病原菌信号分子和植物防御信号 分子强烈影响j m l o 基因的表达，m l o 蛋白的活性调节是通过钙调素在其c 端的尾部 的结合而实现的，钙调素与m l o 蛋白的结合，显著提高了m l o 蛋白的活性。进一步 对钙调素在m l o 蛋白活性调节的作用机制的研究，将有助- j j f 确阐述钙，钙调素 在植物防御反应中的作用3 0 | 。 4 k i m 等人( 2 0 0 2 ) 以h r p 标记c a m 作探针，通过筛选病原菌激发的水稻悬浮培养 细胞e d n a 表达文库，得到与大麦m l o 具有6 5 同源性的o s m l o 。大麦的m l o 和水稻 的m l o 的拓扑结构如图卜3 和图i - 4 所示。通过钙调素凝胶覆盖分析，重组m l o 蛋白 可以和s c a m - 1 ( s o y b e a nc a mi s o f o r m - 1 ) 以依赖于钙离子的方式结合，进一步分 析表明，其c a m b d 是位于c 段的2 0 个氨基酸，o s m l o 的表达水平受真菌病源微生物 和植物防御信号分子的强烈诱导口。目前研究者已经在多个物种包括拟南芥，大 麦，小麦，水稻，玉米等中发现m l o 蛋白的同源基因的存在。 1 j 1 m l ： l n 。 。| ：- _ = - _ _ 一 图1 - 3 大麦m l o 的拓扑结构图 f i g l - 3 at o p o l o g yo fh v m i o ( d e v o t o 等， 19 9 9 ) 图1 4 水稻的m l o ( o s m l o ) 拓扑结构图 灰色的棒代表细胞膜，开环的线代表o s m l o 的氨基酸序列，颜色加重的线表示o s i l o 的 c 出m d f i g l - 4 曩t o p o l o g yo fo s m i o t h ep l a s m am e m b r a n ei sr e p r e s e n t e db yag r a yb a r o p e nc i r c l e sr q x 璐e n tt h ea m i n oa c i d so f o s m l oa n dt h e2 0a m i n oa c i d so a r r e s p o n d i n g t ot h ep u t a t i v ec a m b do fa r ed e n o t e db yc l o s e d c i r c l e s ( k i m 等2 0 0 2 ) 1 3 钙调素结合蛋白质的钙调素结合域的结构特性 随着越来越多的钙调素结合蛋白被鉴定，人们对钙调素与靶酶或靶蛋白的结 合和调节机制进行了比较广泛和深入的探讨。c a m 不仅在有c a 2 + 情况下，通过 c a 2 + - c a m 与c a m b p s 作用而传递信号，也能在低浓度或无c a 2 + 条件下，作为无 钙离子结合钙调素，通过与钙不依赖性c a m b p s 结合而传递信号。垃3 。研究表明钙 调素的结合区域的氨基酸在一级序列上并不保守，没有同源性，但在二级结构上， 具有相似的结构特征，即有1 6 3 5 个氨基酸组成的带有正电荷的碱性双亲分子， 具有形成a 螺旋的倾向：a 螺旋的轮状映射图中，一半多为带j 下电荷的氨基酸， 5 另一半多为疏水性氨基酸儿3 钔。研究者通过对大量的已经鉴定的c a m b p s 的c a m b d 的氨基酸序列分析，发现c a m b d 主要有两种三类基序：1 ) 不依赖于c a 2 + 的c a m b d 序列：i q 基序( i q x x x r g x x x r ) 2 ) 依赖于c 分+ 的c a m b d 序列，包括卜8 - 1 4 基序和 1 - 5 - 1 0 基序 x x x ( f i l v w ) x x x ( f i l v ) x x x x 钙调素的结会使靶蛋自二聚亿，铁面激活靶蛋自汹1 。 4 植物质膜上钙调素结合蛋自的常用的生化研究方法 1 4 1 蛋自质的亚细胞定位研究的方法 对未知蛋白质进行亚细胞定位主要有三种基本的方法：一是不用抗体的技 术，通过报告基因的方法；另外种方法是利用抗体的免疫组织化学技术；第三 种方法是通过生物信息学的预测。随着生物信息学的发展，用计算机程序预测蛋 白质皿细胞定位的系统也在逐步地建立，利用生物信息学的方法预测蛋白质的亚 细胞定位也逐渐成为一种主要的方法漩醒嘲。 1 4 1 。圭报告基因定位法： 在进行亚细胞定位的研究中，研究者常用的两种报告基因为荧光蛋自的报告 基因和b 葡糖苷酸酶( g u s ) 的报告基因。其中有以荧光蛋白的报告基因应用最 为广泛。报告基因定位法是同过构建融合有目的基因和报告基因的表达载体，然 后通过不同的转化方式，使表达载体在特定的材料中表达。由于荧光蛋白可以在 一定的波长光的激发下，发出特定的荧光，这样就可以借助于荧光显微镜或者是 激光共聚焦显微镜，观察融合蛋自的涯细胞定位，从丽确定西的蛋自的亚缁胞定 位。荧光蛋自麓够和强的蛋自质的冀端或e 端融合两保持其天然蛋是的特性， 丽且灵敏度高、对活细胞无毒害作用，所以得到广泛应用。削。 盟然人们有时也通过b 一葡糖苷酸酶( g u s ) 来观察蛋白质的亚细胞定位，但 是g u s 作为标记系统目前主要是用在目的蛋白的组织定位中。g u s 可以切割底物 ( x - g l u c ) 的葡糖醛酸部分，从而产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中 6 间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀，从而指示目的蛋白的弧细胞定位。 报告基因定位法虽然可以通过比较简单的实验手段来反映目标蛋白质的亚 细胞定位，但是由予目标蛋白和报告基因表达的蛋白融合，这样有时并不能真实 地反映天然状态下强标蛋自质的亚细胞定位，定位结果可能与在体内条件下的蛋 自覆的分奄有差异：另外，融合蛋巍的过强表达可能会造成匿标蛋白质在不应该 出现的部位表达，造成一定的假阳性，或者融合蛋白质表达过弱会使定位结果不 清，尤其对质膜等膜类蛋白的定位可能产生较大影响。 1 4 1 2 免疫组织化学定位法 免疫组织化学，是利用蛋白质特异的抗体检测髓标蛋白质在细胞中的位置的 方法。免疫组织化学定绒法，首先是把特定部位的材料固定，切片，然后用标记 的抗体识别切片中的冒标蛋自质，然后借助光学显微镜或电子显微镜观察其所在 位置，根据抗原抗体的结合部位确定尽标蛋自的位置。用免疫组化方法定位蛋自 质的最大优点是反映的是活体状态下目标蛋白质在植物细胞的位置，是最直接、 准确的定位方法，因为目标蛋白质没有进过任何加工和改造，其表达水平也没有 发生变化。但是，这种方法的先决条件是要求具备目标蛋白质的特异性的抗体， 只有非常特异性的抗体才能避免假象的出现，而这对绝大部分植物蛋白质来说都 是缀难具备的条彳宰，另外，免疫组化方法实验周期长，效率低，技术依赖性强， 难以实现高通量。 1 4 。1 3 生物信息学预测定位 随羞人们对细胞特定亚细胞结构特征的认识和蛋白质的氮基酸序列特征的 逐渐了解，研究者认为不同亚细胞定位的蛋白质具有一些相似的特征，比如说， 定位在细胞膜上的强自质一般具有信号肽和跨膜域，这样就可以通过提取蛋白质 的氨基酸序列特征的参数以及亚细胞的特异结构特征的参数，通过算法比较查询 穿到中所包含的特征参数与各类被定位蛋自旗的相似度，铁面对蛋盘覆的亚细胞 定位作出判断。虽然晷前不同的网站有不同的预测软件，可以预测蛋自质的亚细 胞定位，但是大多数的程序预测均有局限，预测的定位数据往往只可以绘研究 者提供参考，蛋白质在生物体内定位的真实情况还需要实验数据的验证h 训。 一 另外，研究者也可以通过共分离标记酶辅助定位法和蛋白质组学定位技术的 方法来进行蛋白质的亚细胞定位。 7 1 4 2 常用的鉴定某种蛋白质为钙调素结合蛋白质的研究方法 由于钙，钙调素信号通路具有很重要的生物学意义，所以不同的研究者已经 通过不同的方法发现并鉴定了多种钙调素结合蛋白。在发现和鉴定钙调素结合蛋 自中常用的方法主要有以下几种： 量。4 2 。量生物信息学的方法 应用网站h t t p ：c a l c i u m o c i u t o r o n t o c a _ ：分析钙调素结合域的软件，对感兴趣 的蛋囱质进行生物信息学分析，确定这个蛋白质是否是一个钙调素结合蛋白质或 蛋白质的某段区域是否是钙调素结合的区域，这是一种比较简单的方法。其原理 是首先根据疆白质的疏水性，平均疏水性力矩及形成螺旋的倾向，对每个氨基酸 给出0 - 9 的分值，然后根据其得分值的多少，确定某种蛋自质是甭是钙调素结合 蛋自或蛋卷质那段区域是可能的钙调素结合域。一个典型的c a m b d 为一段褥分值 在7 - 9 之间的1 0 - 2 0 个氨基酸序列。曩翦研究者在寻找钙调素结合蛋自的钙调素结 合域，一般首先通过生物信息学的预测，找到可能的区域后，然后再用各种不同 的实验方法来加以验证h 。 1 4 2 2c a m 凝胶覆盖法( c a mg e lo v e r l a y ) 待测样品首先经s d s - p a g e 电泳后，再电转移到硝酸纤维素薄膜等固相支持 膜上，经封闭后，加用放射性( 满王，群s ) 的c a m ，然后用放射自显影来检测样品中 是否存在c a m b p 。或者加用非放射性的，用生物素或地高辛培基标记的c a m ，然 后用免疫显色的方法来检测样品中是否存在c a m b p 。此方法检测的蛋白质与蛋白 质的相互作用属于体外。例如k i m 等人( 2 0 0 2 ) 在确定上文提到的o s m l o 蛋白质的 钙调素结合域的实验中，首先通过异源表达o s m l o 蛋白质的钙调素结合域，然后 把提取的蛋白质跑s d s p a g e 电泳后，转p v d f 膜，然后用h r p 标记的c a m 覆盖 检测。 重4 2 3c a m 亲和层桥法秘蓟 研究者根据依赖予c 扩的钙调素结合蛋自质可以在有c 矿的情况下和c a m 结 合，在无e g + 的情况下和c a m 解离的特性，酋先钙调素偶联到介质上，制成钙调 索亲和层析柱，然后把样品中c a m b p s 在有c a 2 + 条件下与凝胶上c a m 结合，然后 在加入c a 2 + 鳌合剂e g t a 的情况下，使c a m b p s 与c a m 解离，从而将c a m b p s 洗脱， 再经s d s - p a g e 分离检测与鉴定。 1 4 2 4 c d n a 表达文库的筛选： 8 这种方法是首先构建c d n a 表达文库，用不同方法标记的c a m 为探针筛选表 达文库，得到阳性克隆，然后根据阳性克隆的序列，确定阳性克隆的基因。研究 者已经通过构建不同植物，不同组织，经过不同胁迫处理来源的c d n a 表达文库， 鉴定了许多c a m b p s 。例如l i q u nd u 等( 2 0 0 5 ) 用鬻 s - c a m 作为探针，筛选拟南 芥的c d n a 表达文库时，得到一个阳性克隆，这个阳性尧隆编码溅f l 的c 端的 4 4 个氨基酸，d w f i 是一个在职早期合成过程发挥着非常重要的生物学功能的一 种蛋白质口引。 1 4 2 5f r e t ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 。 f r e t 技术以其可以对蛋白质之间的相互作用进行实时，定量，原位的检测 的优点得到广泛的应用。如果两个荧光团相距在1 - - 1 0r i m 之间，且一个荧光团 ( 供体) 的发射光谱与另一个荧光团( 受体) 的吸收光谱有一定的重叠，当供体被 入射光激发时，供体可遂过偶极与偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受 体分子，供体分子衰变到基态而不发射荧光，受体分子由基态跃迁到激发态，再 衰变到基态同时发射荧光，这一过程称为荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) “羽。 下面以比较常用的f r e t 荧光探针对：c f p ( c y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 、y f p ( y e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 为倒衙要说明其原理：c f p 的发射光谱与y f p 的吸收光谱有相当躲重叠，当它们足够接近时，用c f p 的吸收波长激发，c f p 的 发色基团将会把能量高效率地共振转移至y f p 的发色基团上，所以c f p 的发射荧 光将减弱或消失，主要发射将是y f p 的荧光h 钔嘲。例如要研究两种蛋白质a 和b 间的相互作用，可以根据f r e t 原理构建一对融合蛋白：a 吨f p ；b - y f p ，然后将 编码融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生 理条件下研究蛋自质一蛋白震溺的相互作用。用c f p 吸收波长作为激发波长，当 蛋囱质a 与b 发生褶互作用时，由于蛋盘质b 受蛋自质a 作用而发生构象交化， 使c f p 与y f p 充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的主要是y f p 的发射 波长为的荧光；当蛋白质a 与b 不发生相互作用时，由于c f p 与y f p 空间距离 比较远，不能发生荧光共振能量转移，此时检测到的主要是c f p 的发射波长为的 荧光。人们已经利用f r e t 的技术证明了许多蛋白可以和c a m 用，比如m a n j o tb a l 等( 2 0 0 8 ) 用t i r f f r e t 的技术分析了c a m 和m - t y p ek + c h a n n e l s 的相互作用秘引； d o n a l des p r a t t 等( 2 0 0 7 ) 用f r e t 的技术分析了c a m 和n it r ico x id es y n t h a s e 9 p e p t i d e s 的相互作用m 3 。 1 4 2 6 表面等离子共振技术( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c es p r ) 将探针或配体固定于传感器芯片镀着的金膜表面，含分析物的液体流过传感 片表露，分子闻发生特异性结合时可孳| 起传感片表面折射率的改变，折射率的交 化表示了传感芯片表面的蛋白质量变化，可以反映两者的结合强度俅1 “引。这样就 可以将加有标签的c a m b p s 纯化后，包被子传感芯片上，然后让一定浓度的c a l l 溶液流过芯片，如果钙调素结合到芯片表面的c a m b p s ，就会导致折射率的变化。 1 4 2 7c a m 与c a m b p 复合物的天然电泳分离 将待测液与标记的钙调素先行孵育，混合物用天然电泳法分离，然后用放射 自显影或免疫显色的方法检测待测液中是否存在c a m b p 。此方法虽避免了s d s 的 干扰，但只限于检测可溶性鲍蛋自质， 悉羹并不知道检测的蛋自质的分子量嘲。 l 。4 2 。8 凝胶迁移转换法( g e lm o b i l i t ys h i f ta s s a y ) 利用合成的预测的c a m b d 肽段，在有钙离子或无钙离子的条件下与一定量的 c a m 混合孵育，然后进行天然凝胶电泳，如果合成的肽段与c a m 结合，电泳的迁 移率会降低h 。 1 4 2 9b i f c ( b i m o l e c u l a rf l u o r e s c e n c ec o m p l e m e n t a t i o n ，b i f c ) b i f c 技