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中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化，结构鉴定及生物活性检测 摘要：两栖类动物是从水生鱼类演化到真正陆地生爬行类动物之间的过渡类群，其皮肤 对维持两栖动物自身生存和适应栖息地的多样化生态环境起着重要作用，能为其生存提 供必须的呼吸作用、调节水分、抵御捕食、抗微生物入侵、排泄、生殖等功能。两栖类 皮肤是生物活性多肽的较好来源，其含量远远超过了来源于哺乳动物各种组织类似物的 含量。由于不同物种的皮肤中存在的生物活性分子的种类也不同，所以，生物活性多肽 有着超乎想像的分子和功能的多样性。而两栖类皮肤是一种非常容易获得的资源，适合 于生物活性多肽的发现、纯化和功能研究。中国林蛙( r a n ac h e n s i n e n s i s ) 是我国重要的 经济蛙类，也是东北地区优势药用价值动物资源之一。研究表明，林蛙皮是一种富含活 性肽的资源其皮腺内含有各种活性因子，其中包括保湿因子、多肽生长因子、林蛙生物 抗菌因子、血管紧张素因子、铃蟾肽类因子、舒缓激肽样多肽、促甲状腺素肽类、吗啡 因子等1 4 种多肽类因子。如果着眼于疾病治疗药物的筛选和生物活性分子的发现，有重 要应用价值的中国林蛙皮肤中生物活性肽的获得及结构分析，必能丰富“北药”资源，为 更有效的开发利用中国林蛙资源奠定坚实的基础。 本论文选择长白山末麓的本溪山区的中国林蛙为实验材料，利用凝胶层析和反相高 效液相色谱技术对皮肤生物活性多肽进行提取、分离和纯化，并对纯化方法和条件进行 了筛选优化，获得6 种皮肤生物活性肽。利用m s 和q t o fm s m s 对6 种多肽的分子 量和氨基酸排列顺序进行了测定。 首先通过电刺激诱导方法获得林蛙的皮肤分泌液。采用s h e p h a d e x g 5 0 凝胶层析和 v y d a e t p 5 1 0 反相高效液相色谱联合使用手段，采用线性梯度洗脱从皮肤分泌液中纯化得 到6 个多肽。 氨基酸序列分析结果表明，6 个多肽中3 个是缓激肽和缓激肽相关肽，3 个是抗菌 肽，分子量从1 0 5 9 6 3 到3 2 8 5 9 6 道尔顿，由9 个到2 7 个氨基酸组成。其一级结构分别 为r p p g f s p f r 、r p p g f s p f r a l 、r p p g f s s e d i t p s a p 、m h d e h a c t g d 、k m d l l k v a v n k i ，l a a h m h cl l d g l l 和k f 帐r l k r g k n v a r t l k e i k l f s t p t 。l 垒n c b i 蛋白质数据库比对，多肽r p p g f s p f r 是由9 个氨基酸组成的典型缓激肽( b r a d y k i n i n ) ； 多肽r p p gf s p f r a l 和r p p g f s s e d r p s a p 具有缓激肽的结构域保守序列r p p g f s ， 属于缓激肽相关肽b r p s ( b r a d y k i n i n r e l a t e dp e p t i d e s ) 。而多肽m h d e h a c t g 、 k m d l l k v a v n k l l aa h h r h c l l d g l l 和k f w v k r l k r g k n v a r t l k e i k l f s t p t 在数据库中与己知其它两栖类皮肤多肽相似度很低，属于新的多肽。这6 个多肽分别被 命名为b r a d y k i n i n - r c ，r a n a k i n i n r c1 ，r a l a k i l l i n r c 2 ，c h e n s i n i n - 2 ，c h e n s i n i n 一3 和 c h e n s i n i n - 4 。 抗茵活性分析表明，中国林蛙皮肤小分子活性肽具有较强的抗菌活性，其中的 c h e n s i n i n 3 ，c h e n s i n i n - 4 具有光谱抑菌性，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有 抑制作用，而b r a d y k i n i n - r c 只对金黄葡萄球菌具有抑制作用。 通过豚鼠离体回肠实验测定了3 个缓激肽和缓激肽相关肽对肠肌收缩性的影响。 实验结果表明b r a a y k i n i n r c 和r a n a k i n n r c l 能够使得豚鼠回肠肌明显收缩，且收缩 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 强度与肽的浓度呈现正相关，r a n a k i n i n r c l 的缓激肽活性要比典型缓激肽 b r a d y k i n i n r c 的收缩活性强。r a n a k i n i n r c 2 没有缓激肽活性。 关键词：中国林蛙；皮肤；生物活性肽；分离纯化；结构鉴定；质谱检测 2 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化，结构鉴定及生物活性检测 a b s t r a c t ：a m p h i b i a ns k i np l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nk e e p i n gt h e m s e p c e ss u r v i v i n g ，s u c ha s r e s p i r a t i o n , w a t e rr e g u l a t i o n , r e s i s t i n gp r e d a t i o n , a n da d a p t i n gt od i v e r s i t yi ne e o l o g i c a l e n v i r o n m e n t i ti st h o u g h tt ob eo n eo ft h er i c h e s ts o u r c e so fb i o a c t i v ep e p t i d e ss e c r e t e df r o m t h ed o r s a ls k i ng r a n u l a rg l a n d st op r o t e c tf r o mt h ei n v a s i o no fm i c r o o r g a n i s m sa n do t h e r p a t h o g e n si nt h ee n v i r o n m e n t ，乃ec o n t e n t so fb i o a c t i v ep e p t i d e sa r em o r et h a nt h a ti n m a m m a l i a n f u r t h e r m o r e ，a m p h i b i a ns k i ni sv e r ye a s i l yt ob eo b t a i n e dt od i s c o v e rn e w b i o a c t i v ep e p t i d e s r a n ac h e n s i n e n s i si st h ei m p o r t a n te c o n o m i cf r o gg r o w t hi nc h i n a r e s e a r c h e ss h o w e dt h a tr c h e n s i n e n s i ss k i nc o n t a i n sv a r i o u sa c t i v e f a c t o r s i n c l u d i n g m o i s t u r i z i n gf a c t o r , p e p t i d eg r o w t hf a c t o r , a n t i b a c t e r i a lf a c t o r , a n 百o t e n s i nf a c t o r , b o m b e s i n p e p t i d ef a c t o r , b r a d y k i n i n l i k ep e p t i d e ，t h y r o t r o p i np e p t i d e ，m o r p h i n ef a c t o r n l ei s o l a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fv a l u a b l ep e p t i d e sf r o mr a n ac h e n s i n e n s i sw i l lb ea b l et oe n r i c ht h e n o r t h e r nm e d i c i n e ”r e s o u r c e sa n dd e v e l o p er a n ac h e n s i n 删s 括r e s o u r c e s i nt h i sp a p e kr a n ac h e n s i n e 船i sg r o w t hi nc h a n g b a im o u n t a i nw a sc h o o s e da st h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h ei s o l a t i o n p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z a t i o no fb i o a e t i v e p e p t i d e sf r o mt h es k i no fr c h e n s i n e n s i sw e r ec a r r i e do u tb yg e lc h r o m a t o g r a p h ya n d r p h p l c t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fp u r i f i c a t i o nw e r es c r e e n e d a n ds i xo fs k i nb i o a c t i v e p e p t i d e sw e r eo b t a i n e d m sa n dq - t o fm s m sw e r eu s e dt od e t e r m i n a t et h e i rm o l e c u l a r w e i g h ta n da m i n oa c i ds e q u e n c e s 7 r a n ac h e n s i n e n s i ss l d ns e c r e t i o nw a so b t a i n e db ye l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n t h e nt h e s e c r e t i o nw a sp u r i f i e du s i n gs h e p h a d e xg 5 0 g e lc h r o m a t o g r a p h ya n dv y d a c t p 5 10r p h p l c i n t o6s i n g l ep e p t i d e s n 圮r e s u l t so fa n a l y s i so fa m i n oa c i ds e q u e n c e ss h o w e dt h a tt h r e eo ft h e s ep e p t i d e sw e r e b r a d y k i n i no rb r a d y k i n i n r e l a t e dp e p t i d e s ，a n dt h eo t h e rt h r e ew e r ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s t h e r em o l e c u l a rw e i g h t sw e r ef r o ml0 5 9 6 3t o3 2 8 5 9 6d a l t o n a n dc o m p o s e do f9t 02 7 a m i n oa c i d s t h e i rp r i m a r ys t r u c t u r ew a sr p p g f s p f r 、r p p g f s p f r a l 、 r p p g f s s e d r p s a p 、m h d e h a c t g d 、k m d l l k 、襁仆t k il aa h h r h c l l d g l la n d k f 、7 l 帐r i ，k r g k n 、，a r t l k e i k 工。f s t p t r e s p e c t i v e l y a f t e rb l a s ts e a r c h e di nn c b i p r o t e i nd a t a b a s e s ，w ef o u n dt h a tp e p t i d e sr p p g f s p f rw a st y p i c a lb r a d y k i n i nc o m p o s e do f 9a m i n oa c i d s a n dp e p t i d e sr p p g f s p f r a la n dr p p g f s s e d r p s a ph a dt h em o t i fo f b r a d y k i n i n ( r p p g f s - ) a n db e l o n g e dt ob r a d y k i n i n - r e l a t e dp e p t i d e s p e p t i d e sm h d e h a c t g k m d l l k 、( a 、仆i k l l aa h ：h r h c l l d g l la n dk f 帐r i ，k r g k n v a r t l k e i k l f s t p t s h o w e dl i t t l eo rn oa m i n oa c i d s e q u e n c es i m i l a r i t y t oa n yk n o w na m p h i b i a ns k i n a n t i m i c r o b i a lp e p t i d ei nt h en c b ip r o t e i nd a t a b a s ea n dw a st h e r e f o r ec o n s i d e r e dan o v e l p e p t i d e m yw e r en a m e d 雒b r a d y k i n i n r c ，r a n a k i n i n r c1 ，r a n a k i n i n r c 2 ，c h e n s i n i n 一2 ， c h e n s i n i n 3a n dc h e n s i n i n - 4 ，r e s p e c t i v e l y n l ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fp e p t i d e sf r o mr c h e n s i n 册s 括s k i ns h o w e dt h a tc h e n s i n i n 3 a n dc h e n s i n i n - 4h a d b r o a d - s p e c t r u ma n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tt h eg r o w t ho f g r a m - p o s i t i v ea n dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ，b u tb r a d y k i n i n r co n l yi n h i b i t e dt h eg r o w t ho f 3 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s t h eb r a d y k i n i na c t i v i t yo fb r a d y k i n i na n db r a d y k i n i n r e l a t e dp e p t i d e sw a st e s t e db y a s s a y i n gt h ec o n t r a c t i l ea c t i v i t y o ni s o l a t e dg u i n e ap i gi l e u m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t b r a d y k i n i n - r ca n dr a n a k i n i n - r c 1e x e r t e dc o n t r a c t i le f f e c t so nr a ti l e u m ，a n dt h ee o n t r a c t i l i n t e m i t yw a sc o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t r a n a k i n i n r c1e x h i b i t e ds t r o n g e rb r a d y k i n i na c t i v i t y t h a nb r a d y k i n i n - r c r a n a k i n i n r c 2h a dn o tb r a d y k i n i na c t i v i t y k e y w o r d s ：r a n ac h e n s i n e n s i s ，s k i n , b i o a c t i v ep o l y p e p t i d e s ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ， s t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o n ，m a s ss p e c t r o m e t r yd e t e c t i o n 4 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： e l 期：湖嬲l i p 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 为伊 ， 一 辟 一 纫吖 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 前言 在地球上两栖类动物分布广泛，除南极外全球均有分布，以温差小而湿度大的热带、 亚热带居多。其皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境，但在长 期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制，即从特定的腺体分泌防御物质到背部、 腹部皮肤及肠腔来抵御有害环境因子的侵袭。因此，两栖动物皮肤是这些防御物质最为 丰富的源泉，同时两栖类动物生活环境复杂多变，其皮肤中含有相应的化学物质以适应 其生活环境和调节其生理功能。因此，两栖动物是研究生物活性肽的结构与功能关系、 诱导表达的理想模型。另外值得注意的是，在两栖类皮肤中发现的活性肽类物质，大多 都能在哺乳类神经内分泌细胞和肽能神经元中找到它们的对应物，具有广泛的生理和药 理活性。因此，它们在临床方面的应用愈来愈受到关注【2 删。 中国林蛙( r a mc h e n s i n e n s i s ) 是我国重要的经济蛙类，在分类学上属两栖钢、无尾 目、蛙科、蛙属【6 】。在我国分布广，其主要产区是东北林区，特别以长白山、小兴安岭 最为集中，具有广阔的生态适应性。中国林蛙的皮肤在其适应多样性生态环境的过程中 起着重要的作用：担任呼吸、调节水平衡、抵抗猎食者、抗菌、外分泌等多方面的功能。 有关文献【7 8 】报道中国林蛀皮肤在损伤后不易感染、自愈速度快、修复能力强与中国林 蛙皮肤中所含有的活性肽有关。 我国对两栖类动物药用价值的开发利用尚处于起步阶段，尤其是对两栖类皮肤活性 物质的研究进行得较少【9 l o 】。中国林蛙作为辽宁省优势药用动物，尚有许多药用价值有 待于进一步开发利用。目前，国内对中国林蛙皮肤活性肽缺少系统的研究，对中国林蛙 皮肤活性肽分离提取技术以及功能等方面的研究少见报道，特别是人们在粗放式获取大 量蛤士蟆油( 中国林蛙输卵管) 的同时，丢弃了林蛙皮一i 塞一富含生物活性物质的宝贵 资源，难以充分发挥中国林蛙的药用、保健价值。本试验立足于辽宁省中国林蛙资源丰 富这一优势，进行中国林蛙皮肤活性肽分离提取技术及其功能的研究。如能从中国林蛙 皮肤中分离提取出有重要价值的生物活性肽，必将拓宽中国林蛙的开发利用新途径，丰 富辽宁省的“北药”资源，并为祖国传统医药宝库增加一新的生力军。 7 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化结构鉴定及生物活性检测 第一章综述 1 1 生物活性肽概述 生物活性肽是指从动物、植物、微生物中分离出的肽段，其复杂程度从小分子的二 肽到环形大分子多肽，多肽又通过磷酸化作用、糖基化作用或酰基化作用变换为多种其 他形式的多肽，这些肽通常具有多种生理功能。现代营养学研究发现：人类摄食的蛋白 质经消化道的酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例 很小。中国的肽谷专家组进一步试验又揭示了肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表 明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功 能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食 用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。生物 活性肽可在生物体内作为载体和运输工具，将人们平常所食的营养输送到人体各个部 位，充分发挥其功能：生物活性肽在生物体内作为神经递质，传递生物信息；生物活性 肽具有极强的活性和多样性，可全面调节人体生理功能，增强人体生理活性；生物活性 肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有特殊的生物学功能，促进人体对 蛋白质、维生素、氨基酸、钙、铁、锌、硒、镁、铜等多种对人体有益微量元素的吸收； 有些生物活性肽具有原食品蛋白质或其他组成氨基酸所没有的重要的生理机能。生物活 性肽中有些分子量较小的小肽，与氨基酸运输功能相比，生物活性肽中的小肽具有吸收 快速、低耗和不饱和的特点。科学界和医学界可利用其特点为一些特殊状况下的人群补 充营养，如术后伤口愈合期、康复期、身体复原期；精神压力大，过度劳累，食欲不振； 食物中化学物质、重金属、辐射储存、残留农药，长服化学药物、中药余毒，消化系统 损害引起的肠胃功能失调者；运动量大、体力劳动强度大须及时补充氮源，又不能增加 肠胃功能负担者；消化系统因疾患障碍不能进食者；消化器官未发育成熟的婴幼儿，消 化吸收功能开始衰退的老人。生物活性肽中的小肽对人体中的乳酸菌、双岐杆菌和酵母 菌等多种有益维生物的生长有显着促进作用，这对食物营养的消化吸收具有重要意义。 1 2 两栖类皮肤生物活性肽 1 2 1 抗菌肽 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，富含阳离子氨基 酸残基，是热稳定性的两亲性的广谱抗菌分子，多数抗菌肽的等电点在8 9 9 5 。一般 具有抗细菌或真菌作用，有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功制1 8 】，是生物天然 免疫的重要组成成分。n m r 研究表明一些抗菌肽在三氟乙酸水溶液或与磷酸脂膜混合时 为q 一螺旋，如c e c r o p i n ；一些是通过分子内二硫键稳定的b 一片层结构，如d e f e n s i n ， 另外一些同时具有q 一螺旋和b 一片层结构，如a p i d a e c i n s 。抗菌肽对热稳定，许多抗菌 肽在1 0 0 度加热1 0 分钟还能保持一定的活性。抗菌肽对较大的离子强度和较低或较高 的p h 都有较强的抗性，部分抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。抗菌肽 8 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 通常与由细菌和真菌产生的抗生素肽和抗病毒肽联系在一起，如乳酸链球菌肽是由乳酸 球菌( 1 a c t o b a c i l l u s ) 产生的含3 4 个氨基酸残基的多肽，是一种酸性分子物质，即使在 胃这样低p h 条件下也表现出很高的稳定性，能抑制革兰氏阳性菌的活性，而且具有抑制 梭状芽抱杆菌和杆菌类形成芽抱的能力，是理想的防腐剂替代品【1 1 。1 3 1 。大量研究表明， 多数抗菌肽具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤等作用，表现高选择性和稳定性。因此，抗菌 肽的研究和应用已成为昆虫学、植物学、生理学及药理学研究的热点。 两栖类皮肤长期裸露，在长期的自然进化过程中，为了抵御有害环境因子的侵袭， 从而逐渐形成了一系列保护机制。两栖类的皮肤及其分泌物中都含有丰富的杀菌、防御 天敌的生物胺和抗菌肽类物质。自从a n a s t a s i 等【l5 】首次从欧洲铃蟾分离纯化出铃蟾肽以 来，国外已经从世界各地的6 0 0 多种两栖类动物皮肤中分离纯化出了1 0 0 多种抗菌肽，人 们根据这1 0 0 多种抗菌肽在结构上的同源性将其划分成各个家族。报道较多的有 m a g a i n i n 家族、b o m b i n i n 家族、b o m b i n i n 1 i k e 家族、b r e v i n i n 家族、e s c u l e n t i n 家族、 r a n a t u e r i n 家族、t e m p o r i n 家族和r a n a l e x i n 家族a u r e i n 家族【16 1 9 】。其中a u r e i n 家族中 的a u r e i n l 2 由1 3 个氨基酸残基组成，是目前已知的抗菌肽中最小的来自于蛙类并且有着 显著抗菌活性的多肽。m a g a i n i n 家族在其抑菌活性上显示了很强的广谱性，它不仅对于 革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母以及原生生物具有明显的抑制作用，而且对 一些癌细胞也有很强的杀伤力。与此同时这族抗菌肽相比其他各族抗菌肽来说，有着较 低的溶血性，所以可以将其开发成为新一代的抗生素。另夕b b o m b i n i n 家族的抗菌肽也有 很强的抗菌活性，但是它有很强的溶血性，这限制了这族抗菌肽开发成为抗菌药物的前 景。b r e v i n i n 家族、e s c u l e n t i n 家族、r a n a t u e r i n 家族和r a n a l e x i n 家族的共同特点是它们都 包含了一个分子内的二硫键，在c 末端包含一个具有六个或七个氨基酸残基的环状结构 1 2 0 o 表1a u r e i n 家族的氨基酸序列 a u r e i na m i n o - a c i ds e q u e n c e 1 2 2 5 2 6 3 1 3 2 3 3 g l f d i i k k i a e s f n h ， g l 同d i a k k v i g g s l - n h ， g l 同d q q ，i g v i g s l - n h ， g l f d k k i a g h i a g s i - n h ， g l f d k k i a g h i a s s i n h 2 g l 同d k k i a g h i v s s i 二n h ， 另一方面，各种两栖动物之间产生的抗菌肽在一级结构上差异巨大。在科，属，种 甚至亚种之间，抗菌肽在分子量，氨基酸组成，带电性，疏水性，空间结构和抗菌谱等 方面均各自不同。所以，在不同物种间从未发现过相同的抗菌肽。虽然抗菌肽的种类繁 多，但结构上主要有三种类型：( 1 ) 多肽中富含1 2 种氨基酸，通常是脯氨酸；( 2 ) 含二硫 键以稳定b 一折叠结构；( 3 ) 有亲水亲脂区域并形成a 一螺旋。一些抗菌肽中含有一些d 型氨 9 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 基酸，这为研究d 一型氨基酸如何在核糖体上合成多肽提供了理想的模式【2 1 1 。这些抗菌肽 之间氨基酸残基变化很小所以有着很强的保守性，并且通常n 端是富含亲水性氨基酸残 基的稳定区，在这个区域中碱性氨基酸残基如精氨酸和赖氨酸一般数量较多；c 端则含 有较多的疏水残基是抗菌肽的疏水区，一般含有丙氨酸和缬氨酸，且c 端一般都被酰基 化。与其它的生物活性多肽相同，抗菌肽的结构与功能间同样存在着密切的联系。如从 澳洲几种树蛙皮肤中分离纯化得到的具有广谱抗菌活力的c a e r i n1 家族，其肽链上含有2 个脯氨酸残基，这种结构对其保持抗菌活性是必需的，任何一个或两个脯氨酸被甘氨酸 取代都将直接导致多肽的活力下降【2 引。另外，无论从n 端或c 端降解2 个氨基酸残基都 会导致c a e t i n1 家族多肽抗菌活性的丧失【2 3 1 。人们发现c i t r o p i n l 1 和它的类似物a 4 k 1 4 c i t r o p i n l 1 中，后者a 螺旋的c 末端区域可能更加稳定，这可能是由于在a 4 k 1 4 c i t r o p i n l 1 中l y s l 4 代替了原来的g l y l 4 而造成的。由此看来，a 4 k 1 4 c i t r o p i n l 1 的c 一末端 区域稳定的结构可能是其抗菌活性增强的原因【2 4 1 。 抗菌肽在功能上的最大特点是它对原核生物细胞有很高的杀菌活性，而对真核生物 细胞则无毒性。来源于非洲爪蟾的m a g a i n i n 家族因其具有很强的抗菌活性且无溶血活 性，作为抗菌药物的基因工程产品已经进k 2 3 期临床【2 5 1 。另外，m a g a i n i n 的合成类似物 m s i 9 9 已经已用在对转基因的香蕉和转基因烟草增强抗病能力的研究中。m s i 一9 9 体外实 验研究表明，浓度为1 6 p l m l 时，就可以抑带l j f u s a r i u mo x y s p o r u mf s p c u b e n s e ( 这是一 种可以引起植物萎蔫病的茵类) 生殖细胞的萌芽和生长。m s i 9 9 已经通过亚克隆进入植 物表达载乖4 # p m s l l 6 8 和p m s l l 6 4 而分别转入烟草和香蕉中，m s i 9 9 在它们中的成功表达， 增强了转基因烟草和转基因香蕉对病害的抵抗能力【2 6 1 。 1 2 2 缓激肽 缓激肽是一种具有血管活性的九肽，由激肽释放酶( k a l l i k r e i n ) 直接降解激肽原或 者赖氨酰舒缓激肽。缓激肽在体内的半衰期很短，一般小于0 5 m i n 。经过研究发现其生 物学活性多种多样，在相同或不同的细胞类型中，它能激活所有已知的第二信号系统。 缓激肽是激肽释放酶一激肽系统中的一种主要的激肽类物质，既可引起病理生理反应， 又可发挥生理保护作用，参与多种系统器官的功能调节和病理生理过程，如心血管、肾 脏、中枢神经系统的调节、平滑肌收缩、炎症、疼痛、休克和组织损伤过程等。 在纯的缓激肽和它的氨基酸序列【2 让8 】获得之前的相当长的一段时间里，缓激肽作为 一种未知的物质而被世人所熟知。但是其生理活性已经有实验确证：通过孵育胰岛素， 从血液中释放出的缓激肽，能缓慢引起小猪回肠的收缩作用【2 9 1 ，因此它得名为 b r a d y k i n i n ，在希腊语中意为：缓慢作用。激肽释放酶一激肽体系由激肽原( 前体) ，激肽 释放酶( 类胰岛素酶) 和激肽组成，在哺乳动物中已有详尽研究。缓激肽的生理作用是通 过两种小同的受体( b 1 和b 2 ) 介导：受体b 2 广泛存在于各种细胞，需要缓激肽全肽链作为 激动剂。受体b 1 的数量有限，对b r a d y k i n i n 无应答作用，但是对缺失第9 个氨基酸残基一 1 0 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化结构鉴定及生物活性检测 精氨酸的缓激肽或其他激肽的d e s - a r g 类似物有应答作用【3 0 1 。缓激肽对小猪的离体回肠 纵纹平滑肌的收缩作用是由b 2 受体所介导的，而对老鼠的离体回肠纵纹平滑肌的收缩作 用是由b l 受体所介导的【3 。 在非哺乳类脊椎动物，特别是两栖动物皮肤中，也发现了缓激肽及其相关多肽( 结 构变异体和衍生物) 存在。人们曾试图通过激活激肽释放酶一激肽原体系，从蛙类动物的 血液中诱发产生内生缓激肽，并进行分离纯化和表征，然而此举并未成功【3 2 1 。许多两栖 动物都可分泌缓激肽相关多肽如：蟾蜍b o m b i n ao r i e nt a li s , 晟m a x y m a 撇v a r i e g at a ， 真蛙r a n at e m p o r a r i兄g a l a m e n s i s , 忍旧 o m e d u s ar o h d e i 和h e l e o p h r y n ep u r c e l i 。 最近的研究表明，从有尾蛙a s c a p h u s 芒兀旧卜一种最古老的青蛙的皮肤分泌物中也分 离到了缓激肽相关多肽【3 3 】。 1 2 3 其他的生物活性肽 胸腺肽一b4 最初来源于胎牛胸腺，由约4 4 个氨基酸组成，是等电点在5 - 7 之间的一 类酸性肽。其结构中的4 1 5 ，3 0 4 0 位点氨基酸序列形成两段a 一螺旋，中间的1 7 - 2 5 位点 ( 1 7 一l k k t e t q e k - 2 5 ) 则形成了与g 一肌动蛋白的结合区域。在胸腺肽一1 34 氨基酸序列中， 除了第一个a 一螺旋区与g 一肌动蛋白结合区连接的1 6 位点及c 一末端的4 0 以后的几个位点 的氨基酸残基具有一定的变异以外，其余的氨基酸序列具有高度同源性。胸腺肽一b4 曾 经被认为具有胸腺激素的功能。但是随后的实验发现，这类肽除了可以通过阻隔g 一肌动 蛋白的聚合，调节g 一肌动蛋白形成细胞骨架以外，还能促进血管生成、伤口愈合、肿瘤 发生以及头发毛囊发育等方面有多种功能和作用。 b o m b e s i n 最早自b o m b i n ab o m b i n a 分离得到的【州，随后从其他种类的青蛙中同样 分离到了结构和活性相似的l i t o r i n ，r a n a t e n s i n 和p h y l l o l i t o r i n 等多肽 3 5 - 3 8 】 b o m b e s i n 的发现导致了其在哺乳动物中的类似物胃泌激素释放多肽的分离。它们作用 于平滑肌，引起血管收缩，抑制尿液分泌，在神经系统治疗方面有巨大应用潜力【3 9 _ 4 1 1 。 o p i o i d 多肽包括d e r m o r p h i n 和d e l t o r p h i n s 两类多肽。该家族多肽的结构独特， 氨基端的第二个残基为d 型氨基酸，研究发现这是受体结合和活性表现的关键位点。这 些多肽对哺乳动物的o p i o i d 受体有强烈的选择性结合作用，显示出非常有效的鸦片剂 特性：镇痛，耐受性和生理依赖性【4 2 ，4 3 】。在哺乳动物中与之相应的物质为脑啡肽 ( e n k e p h a l i n s ) 和内啡肽( e n d o r p h i n s ) 。 速激肽( t a c h y k i n i n ) 于低等无脊椎动物至哺乳动物的体内广泛存在，是动物体中 数量最多的一个多肽家族。速激肽不仅存在于两栖动物皮肤组织中，而且也存在于内脏 器官和脑组织中。自p h y s a l a e m u sf u s c u m a c u a t u s 分离的p h y s a l a e m i n 是第一个从青 蛙皮肤中发现的速激肽【4 卅。速激肽对外周和中枢神经系统具有潜在的活性，它们可引起 哺乳动物和其他脊椎动物内脏的收缩作用。研究发现p h y s a l a e m i n 对狗和老鼠具有强烈 的催涎作用，其作为神经传递素和神经调节素在中枢神经系统中起重要作用。速激肽在 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 哺乳动物中起相同作用的物质为s p ，神经激肽a ( n e u r o k i n i na ) 和神经激肽b ( n e u r o k i n i n b ) m s 。 1 3 两栖类皮肤活性肽的功能多样性 两栖类皮肤中的活性物质种类繁多、功能复杂。已经证实，有越来越多的生物活性 多肽从两栖类皮肤分泌液中获得，而且从皮肤分泌液中分离纯化出的活性肽在生物功能 上有着多样性的特点。 1 3 1 抗菌活性 两栖类皮肤抗菌多肽大多具有抗革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌的能力。 很多抗菌肽在很低的浓度水平时就能显示强大而广谱的抗菌活性。来源于中国大蹼铃蟾 的抗菌多肽m a x i m i n 3 在1 5i lg m l 的浓度水平时就可以完全抑制大肠杆菌、巨大芽孢杆 菌以及痢疾杆菌的生长。m a x i m i n 3 也对真菌白色念珠菌显示抑制作用，其最小抑菌浓度 为1 5 | lg m l 。 1 3 2 抗病毒活性 有些来源于其他生物的抗菌多肽还对病毒显示了一定的杀伤作用，例如从日本马氏 蟹血淋巴细胞得到的抗菌多肽p 0 1 y p h e 舢s i n s 和t a c h y p l e s i n ，它在浓度5ug m l 时就对 艾滋病病毒显示出了一定的抑制作用。我国从中国大蹼铃蟾皮肤中分离得到的抗菌多肽 m a x i m i n 3 同样显示出了抗艾滋病病毒活性，这是首次报道的两栖类来源的抗艾滋病病毒 抗菌，多肽m a x i mi n 3 在浓度为1 5ug m l 时，对抗艾滋病病毒的选择系数为7 6 。 1 3 3 抗精子作用 从中国大蹼铃蟾皮肤纯化得到的抗菌多肽m a x i m i n l 和m a x i m i n 3 在浓度为1 0 0l ag m l 时可以抑制8 0 的精子细胞。另外从非洲爪蟾中纯化得到的抗菌多肽m a g a i n i n 在同样浓 度的条件下也显示相似的抑制精子活性的作用。现在，国际上已经有一些公司和研究机 构正在尝试把这些多肽开发以用于避孕。 1 3 4 细胞调亡 最近有研究发现从两栖类动物( p s e u d i s p a r a d o x a ) 得到的抗菌多肽p s e u d i n ( g l n a l k k v f q g i h e a i k l i n n h v q ) 对控制蝌蚪尾部形态变化的细凋亡具有调节作用。p s e u d i n 在结构上与一种细胞凋亡因子d e f t 的一段区域具有很高的相似性，而后者可以调节哺 乳动物精原细胞细胞凋亡。 1 3 5 其他生物功能 非洲爪蟾的抗菌多肽m a g a i n i n a m i d e 显现出了极强的胚胎毒性，在微克级的浓度时， 就可以导致小鼠胚胎的死亡，这种多肽也正在被试图用作临床避孕药物。中国大蹼铃蟾 的抗菌多肽m a x i m i n h 和东方铃蟾的抗菌多肽b o m b i n i n h 都显示了强烈的红细胞溶解活 性。m a xi m i n h 在5 01 te g m l 时就可以导致兔红细胞的1 0 0 溶解。另# b m a x i m i n 对d , 白鼠 显示出了一定程度的致死活性，因而推测这类抗菌多肽可能作用于小白鼠的神经系统而 1 2 中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 导致神经毒性。此外也有于两栖类动物抗菌肽可以加快伤口愈合的报道。 1 4 两栖类皮肤活性肽的组织学分布 两栖动物皮肤主要包括两大层，即表皮( e p i d e r m i s ) 和真皮( d e r m i s ) 。表皮层是由一些 死细胞组成，这有助于两栖动物在陆地生活时减少水分从皮肤中流失。真皮层中含有大 量的毛细血管，这使得两栖动物能通过皮肤进行呼吸。另外两栖动物皮肤中还有色素胞， 这些色素胞分布在真皮层和表皮层之间或者在真皮层外表面，色素胞含有的色素让它们 能进行恐吓性的防御行为。 真皮层中存在许多腺体和腺体聚集体是两栖动物皮肤的特点，大量的皮肤活性肽存 储于蛙类和蟾类的皮肤疣粒中。其皮肤腺可分为三类：粘液腺、颗粒腺、泡状腺，其中 前两类皮肤腺占绝大多数。粘液腺体直径通常不超过1 0 0 u m ，相对于粒状腺体，个体小 但是数量多。粘液腺通常位于表皮层下，它的分泌管从腺体直接穿过表皮层通向体表。 两栖动物身体表面的粘液通常由粘液腺体分泌，对两栖动物的水陆两栖生活方式起重要 作用。首先，粘液可以起到防御作用，它能使两栖动物的皮肤光滑，以逃脱食肉动物的 猎捕。其次，粘液中通常含有大量的化学成分，如非洲爪蟾产生的蛙皮粘液素，r a n a p i p i e n s 产生的粘多糖等。这些成分与身体表而p h 值的调节和皮肤水分的保持有关，也参 与体温调节和皮肤润滑。粒状腺体主要位于青蛙的背部皮肤上。粒状腺体的直径为4 0 0 5 0 0 u r n ，肉眼可见其透过背部皮肤而呈浅灰色斑点。颗粒腺的形体较大，在体表分布不