（生物物理学专业论文）极低频磁场对骨骼肌肌质网囊泡钙离子转运的影响.pdf

摘要 钙离子作为胞内重要的第_ + 信使，在细胞信号转导过程中发挥着极其重要的 作用。探讨极低频磁场( e l f m f ) 对胞内游离钙离子浓度( 【c a 2 + 】i ) 的影响， 对于从分子水平和细胞信号系统的角度来解释生物电磁效应，尤其是弱磁场的非 热效应有着重要的意义。有研究表明，e l f m f 作用后胞内【c a 2 + 】i 有所降低或者 没有明显变化，但也有相当多的研究结果提示e l f m f 能促进胞内【c a 2 + 】i 的升高。 由于细胞水平上e l f m f 对胞内【c a 2 + 】i 影响的研究结果明显缺乏一致，因此 e l f m f 是否对胞内【c a “】i 产生影响及其作用的机制尚无定论。本文首次以提取 的肌质网囊泡( s r ) 作为研究对象，探讨了e l f m f 对胞内钙库的作用位点以 及怎样与胞内的钙调控系统相互作用等系列问题。 利用动态光谱法检测s r 囊泡c a 2 + 摄取和钙泵( c a “m 9 2 + a r p a s e ) 的活性， 用c a “释放实验和 3 h 】r y a n o d j n e 结合实验检测c a 2 + 释放通道( r y r l ) 的活性， 以及采用荧光偏振法检测s r 囊泡的膜流动性等。结果表明，5 0h z 、0 4m t 的 正弦磁场暴露3 0m i n ( 2 5o c ) ，导致s r 囊泡c a 2 + 摄取初速率和c a 2 + 摄取总量分 别下降了3 1 和2 0 ；加入钌红( r r l 的特异性抑制剂) 只能部分恢复磁场对 c a 2 + 摄取的抑制，即磁场组的净c a 2 + 摄取初速率和摄c a 2 + 总量仍然较对照组下 调了1 6 和1 4 ，提示磁场对c a “m 譬“瑚r p a s e 的摄取有抑制作用。进一步研 究证实，磁场对c a 2 + 摄取的抑制是因c a 2 + m 9 2 + a t p a s e 活性受磁场暴露而下调 2 6 所导致。而膜流动性实验结果显示，磁场对s r 囊泡膜流动性无显著影响， 提示磁场对c a 2 + 一m g “，a r p a s e 活性的抑制不是因s r 囊泡膜流动性所引起。另一 方面，磁场暴露导致c a “释放初速率和【3 h 】- r y a n o d i i i e 结合度分别上调了1 7 和 5 ，而激活剂1m mn a d h 明显放大了磁场对r v r l 的上调效应，导致c a “释 放初速率和【3 川f y a i l o d i n e 结合度分别上调了2 3 和8 。提示磁场暴露对r y r l 有激活效果，并且与r v r l 通道的状态有关。 上述结果显示，5 0h z 、o 4m t 正弦磁场暴露引起的肌质网c a “摄取下调和 c a “释放上调是由于肌质网钙泵活性降低和c a 2 + 释放通道r v r l 活性升高所导 致。 关键词：极低频磁场；肌质网；钙转运：钙泵：钙离子通道 2 0 0 4 年幽家教育部留学回国人员犟会资助。 第v 负 a b s t r a c t a sau b i q u i t o u ss e c o n dm e s s e n g e r c a 。+ p l a y sac f i t i c a lr o l ei nt h ec e l l u l a rs i g n a l t r a n s d u c t j o n t od i s c u s st h ee f f e c t so fe x t r e m e l yl o wf r e q u e n c y ( e l f ) m a g i l e t i cf i e l d ( m f ) o nc ”o s o l i cf r e ec a 肿c o n c e n t r a t j o n ( 【c a 卅】i ) ，i t i s v e r ym e a n i n g f u l f o r u n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s m s0 fe l fm f b i o e f f c c t s ，e s p e c i a l l yf o r t h en o n t i l e 珊a l e f f e c t so fw e a km f ，i nv i e wo fm o l e c u l a rl e v e la n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n af c ws t u d j e s s h o w e dt h a te l fm fh a dn oe 彘c t so re v e nd e c r e a s e di nc y t o s o l i c 【c a 抖】i ，w h e r e a s t h eo t h e r sd e m o n s t a t e dl h a te l fm fe x p o s u r ci n c r e 鹄e d 【c a 抖】it oam a r k e dl e v e l s i n c et h e s er e s u l t sa p p a r e n t l a c ko fc o n s i s t e n c c ，w h c t h e ra n dh o we l fm fi n n u e n c e s c y t o s o l i c 【c a 抖】i a r es t i l lc o n t r o v e r s i a l i i lt h i ss t u d y w i t hi s o l a t e ds a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m ( s r ) v e s i c l c s ，t t l em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fe l fm fa f ! f e c tc y t o s o l i c 【c 一+ 】iw e r ci n v e s t i g a t e df o r t h ef i r s tt i m e u s i n gt h em e t h o do fd y n 锄i cc a 抖d y es p e c t r u m ，t h ec 一+ u p t a k ea l l d t h e c a 抖一m 旷+ a t p a s ea c t i v j t yw e f eo b s e r v e dw i t ho fw i t h o u te x p o s u r et 0e l fm f t h e f u n c t j o no ft h er y a i l o d i n er c c e p 幻r ( r y r l ) w a sm e a s u r c db y 出ec a 抖r e l e a s ea s s a y s a n db yt h er h 】- f y 锄o d i n eb i n d i n ga 龉a y s ，a n ds rm e m b r a n ef l u i d i t yw a se x a m i n e d b yt h ef l u o f e s c e n c ep o l a r i z a t i o n r e s u l t ss h o w e dt l l a t5 0h z 、o 4m tm fe x p o s u r ef o r 3 0m i na t2 5o cc a u s e dt h ei n i t i a lc a 2 + u p t a k er a t ea n dt h cc a 2 + u p t a l 【ec 印a c j t yt o d e c r e a s e3 1 a n d2 0 r e s p e c t i v e ly t h er y r li n h i b i t o r 邝t h c l l i u mr e d ( r r ) c o u l d p a n i a l l yr c s t o r et h ec a 2 + u p t a k ei n h j b i t e db yt l l ee l fm f a m e l yt h en e tc a 2 + u p t a k e i n i t i a lm t e ，柚dt h ec a 抖u p t a k cc a p a d t yo fm f 铲o u pw a ss t i l l l 6 a n d1 4 l e s sl h a n t l i a to fc o n t m lr c s p e c l i v e ly f u r t h e rr e s e a r c hd e m o n s t r a t e dt h a tm f e x p o s u f ec a u s e da 2 6 d e d i n eo fm ec a 2 + m 9 2 + a r p a s ea c t i v i t y m o r c o v e f t h er e s u l t so fd p h e x p e r i m e n t sj n d i c a t e dt h a ts rm e m b r a n en u i d i t yw a sn o tt h em a j o rc a u s eo ft h e i n h i b i t i o n0 nc a 抖- m g 抖- a t p a s ea c t i v i t yd u et om f e x p o s u r e o nt h eo t h e r h a l i d ，t h e r e s u l t ss h a w e dt h a tm fc a u s e da1 7 i n 盯e a s eo ft h ei n i t j a lc a “r c l e a s er a t ea n da5 i n c r e a s eo ft h ef 3 h 】一u a n o d i n eb i n d i n g ，a n d1m mn a d hm a g n i f i e dt h ea c t i v a t i o n e f f c c t sb ym fe x p o s u r c ，w h i c hc a u s e da b o u ta2 3 i n c r e a s eo ft h ei n i t i a lc a 2 + r e l e a s e r a t ea n da8 i n c r e a s eo ft h e 【h 】一r y a n o d j n eb i n d i n g t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ed e c l i n eo ft h ec a 2 + 一m 9 2 + 一a i 甲a s ea c t i v j t ya n d t h ei n c r e a s eo fr y r lf u n c t i o n ，r e s u l t e di nad o w n - r e g u l a t i o no fc a 2 + u p t a k ea n da n u p - r e g u l a t i o no fc a 2 + r e l e a s e ，i n d u c e db ye x p o s i n gs r t oao 4m tm ff o r3 0 m i n k e yw o r d s ：e l f m f s r ；c a 2 + t r a n s p o n ；c a “m 9 2 + a t p a s e ；r y r l 第v l 页 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：婶日期：a ! 堑乞么 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 言翥豺彳土臣日期：泓：厶：f 导师签名：乏老、机 日期： 占。纠扫6 华东师范大学2 0 0 6 届硕十学位论文 第一章前言 第一节电磁场生物效应及其机理探讨 1 1 电磁场的生物学效应 随着国家工业化程度的发展，各种电子、电力设备和设施大量出现在人们的 日常生活和工作中。环境中的电磁辐射呈指数级数式增长，随之而来的环境污染 问题也日益严重。1 9 7 9 年w e i t h c i m e r 和k e p e r 两位学者首次报道儿童白血病 发病率增高可能与居住环境的高压输电线产生的工频磁场污染有关【l l ，表明极低 频波段的电磁波能够对机体产生不良的影响。由此引发了全球范围的环境极低频 ( e x 岫e m l yl a wf r e q u e n c y e l f ) 磁场( m a g i l e t j cf i e l d ，m f ) 与癌症发生的关系以 及其它可能危害的研究和关注。科学家们已在流行病学调查、动物实验和细胞分 子水平等多层次展开了广泛的研究。众多流行病学调查结果显示，环境e l f m f ( o 3 0 0h z ) 暴露能增加肿瘤( 尤其是白血病、脑瘤和乳腺癌等) 发生的危险度， 在一定程度上具有促癌效应i l 。2 1 ；但也有相当一部分研究结果对此持否定或矛盾 的观点【3 j 。另外细胞分子水平上的很多研究也提示，环境e l f m f 可能具有潜在 的生物学危害【4 一】。为此，美国国家环境健康研究所( n h s ，1 9 9 8 ) 和国际癌 症研究机构( i a r c ，2 0 0 1 ) 均将环境e l f m f 归为“人类可疑致癌源”，并建议 采取谨慎避免原则( h n p ：w w w e l e c l r i c a l l ) o l l u t i o n ) 。 电磁场的生物学效应主要包括“热效应”和“非热效应”。热效应是生物体吸收 电磁辐射能量致使体温升高，由此引起的生理和病理变化。而电脑、电视机、微 波炉等家用电器产生的电磁场通常频率低、强度弱，能量通量小( 其光子能量比 氢键和范德瓦尔斯力小两个数量级) ，难以引起生物体或受辐射细胞内的明显温 升，引发的是非热效应1 4 叫。目前有关热效应的研究工作及其应用已基本完善： 而对于非热效应的研究，由于实验结果不一致而且可重复性差、对相应机制的探 讨不够完善和准确、以及常规的流行病学研究方法敏感性低等原因，使得e l f m f 的非热效应本身及其作用机制等问题至今仍未阐明。 1 2 电磁场非熟效应的机理研究 电磁场的非热效应具有非线性【“、相干性【8 1 、协同性i 踟、阈值性f 9 】以及“窗 特性0 1 ( 频率窗、功率窗、时渊窗) 等特点。针对这些特点，早期的研究者们 提出了多种理论模型来解释。其中较为著名的有：玻色爱因斯坦凝聚理论【1 1 】、 跨膜离子回旋谐振理论、量子粒子结合效应理论【1 3 】、膜动力学场致变化理论 第l 负 毕乐帅范大学2 0 0 6 俑坝士学位论文 【1 4 j 、以及包括孤子传播在内的非线性效应理论1 7 】等。但是，由于生物系统的复杂 性和这些理论模型的过于物理化，导致上述每个理论都只能解释部分实验结果。 近年来，随着非线性科学和混沌动力学理论的发展、学者们将该理论与生物信息 学和系统科学等相结合1 1 ”，提出了一些新的理论模型较好地解释了弱电磁场作 为触发器引发非热效应的机理。至于环境e l f m f 的微弱刺激如何激发出强大 的生物学应答，越来越多的证据表明，弱电磁场首先通过细胞膜将物理信号转换 成生物信号，再将生物信号放大而导致生物学效应的产生。因此，将细胞跨膜信 号转导的研究成果和方法用于解释e l f m f 非热效应的机理正在被广泛接受 【1 6 】。 细胞跨膜信号转导所研究的是环境刺激因子或胞间信使等通过作用于细胞 膜受体，跨膜转换形成胞内第二信使，再经过其后的信号转导途径级联传递、激 活控制代谢、信使和细胞生长酶系统等反应，导致基因改变，诱导细胞增殖和分 化等一系列生物学应答【1 6 】( 图1 ) 。研究证实，e l f m f 能够影响细胞的各种生 理活动，包括促进细胞增殖【4 1 、抑制细胞凋亡【1 7 】、改变离子转运( 尤其是钙离子) 1 1 引、d n a 、r n a 和蛋白质的合成【4 】、以及基因转录等【2 0 】。这些效应与细胞跨 膜信号转导有着直接的关系，因而，从信号触发器角度出发探讨e l f m f 非热 效应的机理有了新的突破和飞跃。 1 3e l f - m f 对细胞膜信号转导的影响 细胞信号转导作为一种基本而又重要的胞内通讯途径，其通常过程是配体与 膜上受体结合，再通过受体构象改变而触发胞内的生化级联反应。如果e l f m f 能干扰受体对外界信号的接收，那么很有可能因此而影响到细胞的功能。因此， 学者们首先展开了e l f m f 对细胞膜受体影响的研究。例如，u b u r d v 等研究表 明，6 0h z 磁场对t 淋巴细胞膜受体与配体( c d 3 和c d 2 0 ) 的结合有显著的抑 制作用【2 l 】；另外，5 0 h z 、0 4 m t 正弦磁场辐照中国仓鼠肺成纤维细胞( c h i n e s e h a m s t e rh n gf i b r o b l a s tc c l l s ，c h l ) ，明显诱导了表皮生长因子受体( e p i d e m a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r e g f r ) 的聚集1 2 2 】，我们对该现象的机理进行了初步的探 讨，发现酪氨酸激酶抑制剂p d l 5 3 0 3 5 干扰了磁场诱导的e g f r 聚集( 参见附录 i ) 【5 j 。这些研究证实，e l f m f 能够对配体的结合位点进行修饰，从而扰乱细胞 膜对外界信号的接收。另有文献报道，e l f m f 通过降低细胞膜的流动性和导电 性、改变膜结构等来干涉细胞信号转导途径的起始【2 孓矧，再次表明，细胞膜是 e l f m f 引发非热效应的关键靶体。 第2 页 华东师范大学2 0 0 6 届硕士学位论文 环境刺激 图1 ：细胞信号转导主要途径模式图【1 6 】 环腺苷酸( c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e ，c a m p ) ：三磷酸肌醇( i n o s i t o l 1 ，4 ，5 一岫s p h o s p h a t ，i p 3 ) ；二酰甘油( d i a c y l 出y c e m l ，d g ) ；依赖c a m p 的蛋白激 酶( p f o t e i nk i i l a s e a ，p k a ) ：依赖c a 2 + 与磷脂的蛋白激酶( p r o t e i nl 【i n a s ec ，p l ( c ) ； 依赖c a “c a m 的蛋白激酶( c a l m o d u l i n p r o t c i nk i n a s e ，c a m p k ) ；有丝分裂原蛋 白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp m t e i nk i n a s e ，m a p k ) ；另一种蛋白激酶0 a n u sk i n a s e ， j a k ) ；转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t f ) 。 第3 负 华东师范大学2 0 0 6 届硕十学位论文 如图1 所示，细胞信号转导以细胞膜为界大致分成3 个部分：膜外的胞间信 号( 第一信使) ；膜上受体；膜内的胞内信号( 第二信使) 。已有的资料显示，细 胞膜虽然是外界电磁场最先接触的细胞成分，但并非是转导电磁场信号的唯一效 应器，胞间信号分子( 胰岛素) 和胞内第二信使( 如c a m p 、i p 3 、c a 2 + 等) 也可 能是电磁场作用的重要位点之一1 2 6 。j 。我们实验室前期研究发现，5 0 h z 脉冲电 场能引起培养基中胰岛素构象改变、降低与受体的结合能力，最终对细胞的增殖 产生影响【2 6 l ；j u t t a 等以5 0h z 、2m t 交变磁场辐照大鼠成纤维细胞5m i n ，引 起c a m p 的浓度上调2 1 和细胞间隙通讯增强6 0 1 2 7 j ；k o r z h 等以5 0h z 、o 1m t 正弦磁场辐照j u r k a t 细胞可激活磷脂酶( p h o s p h o l i p a s e ，p i 甜2 ) ，导致i p 3 的浓 度上升【硎；而后诱导细胞内贮c a “释放到胞浆中。由图1 所示，细胞内信号转 导途径通常形成交叉网络状，该网络中的任何一个成分的变化，均可或多或少的 演绎出不同甚至截然相反的效应。尤其是胞内的第二信使，可以被多个上游活化 物调节，而且自身也有多个不同的靶点而引起各种生理反应。因此，e l f m f 对 胞内第二信使的直接作用，可能是电磁场引发生物效应的另一重要模式。 钙离子( c a 2 + ) 作为胞内重要的第二信使，除调控骨骼肌和心肌等细胞的兴 奋收缩偶联( e 】【c i t a t i 衄c o n t m c t i o nc o u p l i n g ，e c 偶联) 外，还普遍参与物质代 谢、突触传递、间隙通讯、基因表达等活动。由于胞内【c a 2 + 】i 的变化影响诸多细 胞的生理活动( 如细胞生长、分化、增殖和凋亡等) ，因此探讨e l f m f 对胞内 【c a 2 + 】i 的影响，对于从分子水平和细胞信号转导的角度来揭示弱磁场生物效应的 机理有着显著的意义【1 0 1 2 1 18 2 9 3 5 】。 1 4 极低频电磁场对胞内c a 2 + 浓度的影响 e l f m f 对胞内【c a 2 + 】j 影响的研究较早、较多，已积累了大量的实验数据， 但是以往的研究多数是以细胞为模型，不同的细胞株或不同的e l f m f 暴露条 件得到的结论缺乏统一。有部分文献报道，e l f m f 不会影响胞内【c a “】i 或c a “ 信号转导阻3 埘，甚至对胞内【c a 2 + 】i 的波动有抑制效果1 3 1 1 ，但多数研究结果表明， e i _ b m f 促进了胞内【c a 2 + 】i 的升高【3 二3 5 1 。 g l a s e r 等以各种频率( 1 5h z 1 2k h z ) 和强度( o 2 6m t ) 的正弦磁场， 1 k h z 不同强度( o 3 9m t ) 的交变磁场和3 9m t 静磁场、以及最大场强为 1 5 0v m 的电场分别辐照红细胞，均未发现电磁场对胞内【c a 2 + 1 i 有明显的影响【2 9 】。 杨巍等以1 5 5 m t 、1 6 h z 脉冲磁场，3 0 0 m t 、2 h z 旋转磁场和o 9 m t 、1 6 h z 正弦磁场等辐照人肝癌细胞( h e p g 2 ) ，也未检测到受辐照细胞内【c a “】i 与对照 组的显著差异i 。有报道称，e l f m f 的生物效应具有频率、功率和时问等三方 面的“窗口” 6 。1 州，以上实验均末检测到磁场对胞内f c a 2 + 1 i 的影响，可能是由于所 第4 呱 华东师范大学2 0 0 6 届项上学位论文 选磁场的频率、功率和时间等没能构成有效的“窗口”；另外，所选细胞对磁场的 敏感性差也可能是未导致胞内【c a n 】i 变化的重要因素。但是，e l f m f 促进胞内 【c a 2 + 】i 升高或c a “信号转导增强的报道则更多见。例如，“b u r d y 等采用控制细 胞培养基中c a 2 + 含量的方法来研究e l f m f 对胞内【c a 2 + 】i 的影响，结果发现6 0h z 磁场促进了丝裂原( c o n a ) 活化的淋巴细胞外液c a 2 + 的内流和胞内钙库的释放， 从而导致胞内f c a 2 + 1 i 的明显上升【3 2 】；i j n d s t r o m 等以0 1m t 工频磁场辐照j u r k a t 细胞，引起胞内c a “振荡水平的显著上升【3 3 】；b a r b i e r 等研究提示，5 0h z 正弦 磁场辐照小鼠垂体细胞促进了胞内【c a 2 + 】i 的升高，而且大部分是经过细胞膜上电 压依赖的二氢吡啶敏感的l 型c a 2 + 通道( d i h y d r o p y r i d i i l e ，d 闭) r ) 进入细胞， 但d h p r 抑制剂和无c a “介质均不能完全阻止磁场促进胞内c a 2 + 1 i 的升高，提 示e l f m f 也能诱导胞内钙库的c a 2 + 释放而增加胞内c a 2 + 浓度【3 4 1 。最近，黄 春明等研究再次表明，一定强度的e l b m f 引起了小鼠嗜铬瘤细胞( p c 1 2 ) 胞 内f c a 2 + 】i 的显著升高，部分是外c a 2 + 内流和钙库的c a 2 + 释放所导到3 5 1 。 l j b u r d y 和b a r b i e r 等相互独立的实验均证实e l f m f 促进了胞内【c a “】i 的 升高，另外也提示e l f m f 引起胞内f c a 2 + 1 j 升高有两条基本途径：一是增加细 胞膜c a “通道的通透性，促进胞外c a “的跨膜内流；二是促进胞内钙库的c a “ 释放【3 2 川。虽然这些研究均证实，e l f m f 促进胞内【c a 2 + 1 i 的升高与胞内钙库 有关，但时至今日，e l f m f 对钙库的作用位点及其怎样与钙库发生作用等的研 究仍未见报道。 第二节细胞内钙信号转导系统 2 1 细胞内c a 2 + 的分布 研究表明，c a “几乎调控所有细胞的生理活动。在生命的丌始c a 2 + 就通过 触发受精，控制细胞发育和分化为特定类型的细胞，然后调节细胞的生理活动， 最后参与细胞凋亡过程等【3 6 】。由于要协调细胞多方面的功能，因此，对胞内c a 2 + 信号的调控必须非常灵活同时又要受到严格的控制。近年来，随着新的荧光染料 的开发和钙成像、激光共聚焦等新技术的应用，对于胞内c a “稳态的研究已深 入到亚细胞水平，包括对肌质网、线粒体和细胞核等的钙调控研究。 一般认为，大多数细胞外【c a “】为1 0 0 1 0 0 0 肛m o l l ，比静息态时胞内【c a “】i 的o 1 口m o l l 大3 4 个数量级i ，从而使c a 2 + 具有很强的电化学力。当细胞受 到某些刺激时，少量的胞外c a “进入细胞，就令胞内c a “1 j 大幅卜升，产生钙 信号。另外，当受到刺激时，胞内钙库c a “也释放到细胞质中，这是胞内钙信号 产生的另一重要途径。但是，如果胞内【c a “】i 过高，会引起磷酸根沉淀( 磷酸根 第5 负 华东师范大学2 0 0 6 届硕士学位论文 是细胞能量与物质代谢所必需的1 3 6 1 ) ，而对细胞造成损伤甚至导致细胞死亡。因 此，维持细胞内外的c a 2 + 浓度差和胞内c a 2 + 平衡是细胞正常生理活动所必须的。 c a 2 + 平衡是将胞内【c a 2 + 】i 控制和维护在一定的生理范围内的一种能力。研究与探 讨c a 2 + 平衡机制，是认识各种c a 2 + 依赖性生物学作用机理的共同基础。 2 2 细胞内c a 2 + 的调控系统 对于可兴奋细胞而言，c a “担负着“兴奋信号传感器”的角色。可兴奋细胞 都是通过c a 2 + 将电信号即动作电位转变为生物学效应( 如神经递质，激素的分 泌，肌纤维的收缩舒张等) 。如图2 所示，当运动神经兴奋时，外界刺激首先诱 导细胞膜去极化，导致c a 2 + 跨膜内流，与肌质网( s a - c o p l a s m i cr e t i c i i l u m ，s r ) 上的钙释放通道( r y a n o d i n er e c 印t o f ，r y r ) 结合，从而触发s r 内贮c a 2 + 的释 放，进一步导致胞内【c a 2 + 】i 升高。当【c a “】i 达到1 0 肛m o l l 时肌钙蛋白被激活， 通过变构使肌球蛋白和肌动蛋白相互接触，引起肌肉收缩。为防止【c a “】i 过高造 成细胞损伤，胞内的许多蛋白质、核苷酸、酸性磷脂等都可以与c a 2 + 结合起到 初步缓冲作用【翊。但胞内蛋白缓冲c a 2 + 的能力有限，对终止强烈而持续的钙信 图2 ：细胞钙调控系统模拟图 肌质网( s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m ，s r ) ；质膜钙泵( p l a s m am e m b f a n e c a “a r p a s e ，p m c a ) ；钠钙交换器( n a + c a 2 + e x c h a n g c r ，n c x ) ； 钙释放通道( r y a n o d i n er e c e p t o r ，r y r l ) ；钙泵( c a “m g “一a r p a s e ) 。 第6 负 华东师范大学2 0 0 6 届硕士学位论文 号，必须将c a 2 + 迅速排出胞浆。其中一部分c a 2 + 由质膜钙泵( d l a s m am e m b r a n e c a “a t p a s e ，p m o ) 和n a + c a “交换器( n a + c a 2 + c x c h a n g e r ，n c x ) 转移到 胞外，而另一部分c a 2 + 由s r 膜上的钙泵( c a “m 9 2 + a r p a s e ) 重新摄入钙库以 降低胞内f c a “】- ，当降到o 1 m o 】l 时肌球蛋白和肌动蛋白分离引起肌肉舒张， 这样就形成一个完整的肌肉收缩舒张过程i 硎。 钙调控系统主要包括质膜c a 2 + 转运和胞内钙库的调节。胞内钙库是指能够 吸收和释放c a 2 + 的细胞器，目前较为清楚的胞内钙库有肌质网、线粒体和细胞核 等。由于本文着重探讨的是e l f m f 对肌质网钙库的影响，有关e l ，f - m f 对线粒 体和细胞核等的作用是我们下一步将要展开的研究，因此线粒体和细胞核钙库的 背景知识在这里不作详述。 2 2 1 质膜上的c a 2 + 外捧机制 细胞膜上有两个c a “转移系统将胞内c a “排出胞外( 图2 ) ：即普遍存在的 c a 2 + 高亲和性、低容量的质膜钙泵( p m c a ) 和可兴奋细胞膜上存在的n a + c a 2 + 交换器( n c ( ) 。p m c a 是一种疏水的膜结合蛋白，其结构与s r 钙泵的结构相似。 具有1 0 个跨膜区域，第4 5 跨膜区的胞浆部分有一个活化中心。c 末端也处于胞 浆区域，内含钙调素( c a l m o d u l i n ，c a m ) 结合和激酶磷酸化部位，未活化泵的 c 末端遮蔽了活性中心，结合上c a m 或被激酶磷酸化后即可暴露出活化中心而 使钙泵活化【3 6 j 。p m c a 每水解一个 i p 分子可将1 2 个c a 2 + 转移到胞外，同时 以1 ：2 比例将h + 转移到胞内，使离子交换结果为电中性，因此细胞膜两侧的电 位差不会影响c a “的转移。p m c a 转移c a 2 十的特点是它与c a 2 + 亲和性高，但转 移容量不大，因此p m c a 在调节细胞内c a 2 + 稳态时起一种灵敏的微调作用【1 6 】。 n a + c a “交换器主要存在于可兴奋性细胞，不能直接利用 皿为能源。它 的驱动力有两种：第一，利用细胞内外n a + 的浓度梯度，此梯度大约为1 0 ：1 ， 因而只能勉强地将c a 2 + 移出胞外。由于细胞内外n a + 浓度差是由n a + c a 2 + 泵来维 持的，故认为n c x 在间接地利用a r p 为能源。第二，动力学研究发现n c x 排 出1 个c a “交换进入3 个n a + 。这种净进入1 个正电荷的效应，使n c x 增加了另一 个能量来源膜电位。总之，n c x 是靠着化学梯度和电位梯度二者结合驱动的【1 6 1 。 n c x 的特点是亲和性低，一般认为，在胞内c a 2 + 浓度达到1m m o l l 时才能发挥 作用，但交换容量大，n c x 主要用于兴奋细胞受刺激后从胞内除去大量的c a 2 + 。 2 2 2 质膜上的c a 2 + 内流系统 第7 孤 毕东师范大学2 0 0 6 届倾十学位论文 细胞膜钙通道是一种膜结合蛋白，它通过构象变化呈开放或关闭状态，从而 控制胞外c a “的内流。根据操纵启闭的上游调控因子大致分为电压门控钙通道、 激动剂受体门控钙通道、机械操纵性钙通道。电压门控钙通道受控于膜电位的 变化，但也能被神经递质、g 蛋白、信使依赖激酶所调控，主要存在于骨骼肌、 心肌等兴奋性细胞。静息状态即膜电位为9 0m v 左右时钙通道处于关闭状态； 当细胞受刺激引起初始去极化作用时，首先是膜上对电位敏感的n a + 通道开放， n a + 内流使胞内进一步去极化；达到3 0m v 左右时c a 2 + 通道开放；而膜电位进 一步改变到+ 4 0m v 时，其它离子的作用( 如k + 外流) 使膜电位回到9 0m v ， c a “通道重新关闭。电压门控钙通道又可分为t 、l 、n 和p 型，其中l 型c a 2 + 通 道对二氢吡啶类的阻断剂敏感1 1 “。 第三节骨骼肌细胞兴奋收缩偶联 临床研究表明，由细胞内的钙调控系统紊乱而导致的钙信号转导异常是引起 骨骼肌( 如恶性高热、中心结疾病和白肌病) 【3 7 8 】和心肌( 如心脏衰竭、心动 过速) 等疾病的重要原酬3 9 1 。因此，钙调控系统对细胞机能影响的研究十分活跃， 尤其是e - c 偶联的研究有着重要的理论和临床意义。骨骼肌与心肌细胞的e c 偶联过程极其类似( 图3 ) ，首先是细胞膜去极化，胞外c a 2 + 进入细胞激活r y r ， 图3 ：骨骼肌和心肌细胞的e c 偶联过程的异同【3 7 】。 p m c a ( 质膜钙泵) ；n c x ( 钠钙交换器) ；d h p r ( 二：氢吡啶敏感受体) ；c i c r ( 钙诱导钙释放) 第8 负 华东师范大学2 0 0 6 届硕士学位论文 引起内贮c a “释放而引起骨骼肌收缩。之后钙泵将c a “重新泵入s r 内，而导 致肌肉舒张【3 7 j 。骨髂肌与心肌细胞e c 偶联的区别在于：骨骼肌d h p r 通过与 r y r l 直接偶联而引起r y r l 的胞浆区构象变化释放c a 2 + 。即骨骼肌主要通过蛋白 质问的直接作用，把细胞膜上的去极化和r y r l 的c a 2 + 释放偶联起来。另外，由 于r y r l 数量上多于d h p r ，一部分r y r l 同d h p r 直接偶联，另一部分r y r l 可能 以c i c r 的方式被激活。因此，骨骼肌的收缩不完全依赖于胞外内流c a “的参与， 甚至可以在完全没有胞外c a 2 + 时处于收缩状态【朔。 3 1 肌质网钙泵( c a 2 + m 9 2 + a 羽p a 辨) 3 1 1 钙泵的结构和功能 如图4 所示，肌质网钙泵是分子量为1 0 0 1 1 0 k d a 的跨膜蛋白，对c a 2 + 的 亲和性高，在c a 2 + 的快速转移中发挥主要作用【加1 。钙泵由位于s r 膜上的1 0 个跨膜螺旋和位于s r 膜外的3 个胞浆区，即a 区( a c t i v a t i n gd o m a i n ) ，n 区 ( n u c l e o t i d eb i n d i n gd o m a i n ) 和p 区( p h o s p h o f y l a t i o nd o m a i l l ) 组成。磷酸化位 点( a s p - 3 1 5 ) 位于p 区，a r p 的y 位可与a s p 3 1 5 结合而使钙泵磷酸化。a t p 与n 区的核苷结合位点( p h e4 8 7 ) 的结合为a r p 与p 区磷酸化位点( a s p 3 1 5 ) 的结合创造了条件。a 区的活性部位被受磷蛋白( p h o s p h a l 锄b a n ) 所遮蔽，活化的 p k a 和c a 2 + c a m 激酶可使其磷酸化。在磷酸化过程中，a 区的部分氨基酸残 基进入p 区的磷酸化位点附近，取代a d p 的位置，并促进磷酸根从e 2 p 磷酸 化位点心口3 5 l 水解下来1 4 l j 。 位于跨膜d 螺旋疏松部位的c a 2 + 结合位点，是通过与周围氨基酸残基上的 氧原子配位形成。胞浆c a “与钙泵上c a 2 + 位点的结合需要：( 1 ) 钙泵形成与转 运c a “相匹配的几何空间；( 2 ) 钙泵要提供有序的氧排列以引导c a 2 + 的进入。 3 1 2 钙泵摄取c a 2 + 和水解a t p 的过程 当胞内【c a 2 + 】i 升高时，激活钙泵水解a r p 产生自由能，将c a 2 + 逆着浓度梯 度的方向转移，钙泵每水解1 分子a t p 可转运2 个c a 2 + ，从而迅速降低胞内 【c a 2 + 】i 【4 2 1 。被泵入s r 的c a 2 + 以氧化钙或磷酸钙的形式存在，也可被c a 2 + 高亲和 性蛋白( 如集钙蛋白、钙网蛋白等) 结合。 钙泵摄取c a 2 + 不同于一般的离子通道，从s r 膜外侧到c a 2 + 高亲和性位点 以及从c a “高亲和性位点到s r 内侧均无直接的通道，因此钙泵摄取c a 2 + 是通 过酶构象改变和而对c a 2 + 亲和性的改变来完成的【4 3 1 。根据钙泵对c a 2 + 的亲和性 不同，将钙泵分为e 1 和e 2 态。e 1 态是尚未结合c a 2 + 的非磷酸化状态，对 第9 ! j 华东师范大学2 0 0 6 届硕士学位论文 c a 2 + 亲和性高。在e 1 态，钙泵的c a 2 + 结合位点向胞浆面丌放，可与胞浆中的2 个c a 2 + 结合形成e 1 c a 2 态。当环境中存在a r p 时，a r p 首先与e 1 c a 2 态的n 区结合，引起n 区向p 区倾斜，使得a t p 的y 位与p 区的磷酸化位点结合， 引起钙泵的构象改变，2 个c a 2 + 被封闭在钙泵中。随后，a = 1 1 p 被水解为a d p 和 图4 ：肌质网钙泵( c a 2 + m 9 2 + a r p 觞e ) 结构模拟图i 4 3 1 。 图5 ：s r 钙泵( c a 2 + m 矿+ a r p a s e ) 水解a t p 和摄取c a 2 + 的模拟图【4 3 j 。 华东师范人学2 0 0 6 届硕士学位论文 磷酸，为钙泵磷酸化提供无机磷，形成磷酸化的中间产物( e 2 p c a 2 ) ，其构象进 一步改变，将2 个c a “被完全封闭在钙泵中。钙泵磷酸化后，其构象再次改变， a d p 从钙泵上解离下来。此时，由于c a 2 + 结合位点空间结构的改变，对c a 2 + 的 亲和性降低，c a “从钙泵上解离并被释放到s r 腔内；完成将胞内2 个c a 2 + 向 s r 腔内的摄取。最后在m g “参与下，磷酸化的中间产物e 2 p c a 2 水解，无机磷 p j 被释放到s r 外侧，钙泵转变成e 2 态，e 2 态的钙泵在胞浆c a 2 + 的作用下再次 被激活，重新转变成对e 1 态，并与胞浆c a 2 + 结合进入下一个转运c a 2 + 的循环【4 l 】。 由于钙泵摄取c a “和水解a r p 都需m 9 2 + 的参与，因此肌质网钙泵也称为 c a “m 矿+ a r p a s e 。 3 1 3 影响钙泵摄取c 矿+ 和水解a t p 活性的因素 钙泵的活性受多种生化试剂( 如钒盐v a n a d a l e ，毒胡萝卜素t g ，次氯酸 h c i _ o ，活性氧r o s 等) 和物理因素的调节，而且多数是因为钙泵摄取c a “和 水解a t p 的循环途径中某个状态受到影响所导致。例如，、a d a t e 能够与磷p i 竞 争性结合而形成中间态e 2 v c a 2 以降低钙泵的活性i 钢：1 1 g ( 钙泵活性的特异性 抑制剂) 可与e 2 态的钙泵相互作用，从而抑制钙泵活性和c a 2 + 摄取i 蚓。据文献 报道，每个钙泵分子有2 6 个巯基( s h ) 半胱氨酸残基，其中6 个以二硫键形 式存在，剩余的2 0 个办自由巯基【4 7 j 。活跃的巯基基团是调控钙泵活性的关键部 位，用药物氧化或抑制巯基可导致钙泵水解a r p 和摄取c a 2 + 活性的下降。例如， t c 埘l c c 等研究表明，h c i o 对钙泵活性的抑制正是通过将自由巯基氧化所引起 【“。另外，由于钙泵与s r 膜上的磷脂等周围环境发生作用，因此磷脂的组成 及其物理状态通常对其活性有一定的影响1 4 2 1 。n a v a 肿等研究发现，随着磷脂 酰乙醇的增多使得钙泵活性和c a 2 + 摄取能力均有所增强1 4 9 j 。也有文献报道，膜 流动性